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An electron microscopic study of neuronal degeneration and glial cell reaction in the retina of glaucomatous rats
(Murcia : F. Hernández, 2002) Wang, X.; Tay, S.S.W.; Ng, Y.K.
The present investigation was focused on the ultrastructural changes in the neurons and glial cells in the retina of rats with experimentally-induced glaucoma. An experimental glaucoma model was created by limbal-derived vein cauterization. Animals were sacrificed at 1, 3 weeks and 3 months post-operation. Retinae were dissected and processed for electron microscopy. Neuronal degeneration was observed in all the different layers of the retina at both 1 and 3 weeks post-operation. Some degenerating neurons were found in the ganglion cell layer (GCL), inner nuclear layer (INL) and outer nuclear layer (ONL). And the dying neurons presented apoptotic-like more than necrotic neurons. Many degenerating axons and axon terminals were observed between neurons in the GCL, inner plexiform layer (IPL), INL, and outer plexiform layer (OPL). Activated astrocytes and microglial cells were present in close association with degenerating neurons and axons. The Müller cells in the INL also presented longer and darker processes with more microfilaments than in normal cells. Degenerating neuronal debris, degenerating axonal profiles and electron-dense bodies were often found in the cytoplasm of macrophages. The results suggest that both microglial cells and astrocytes are activated in the process of neuronal degeneration in the retina of experimentally-induced glaucomatous rats. It is hypothesized that they may play a protective role in removing degenerating neuronal elements in the retina after the onset of glaucoma.
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Análisis de la degeneración de los fotorreceptoes en modelos experimentales de retinosis pigmentaria, degeneración macular asociada a la edad y glaucoma =Analysis of photoreceptor degeneration in experimental models of retinitis pigmentosa, aging macular degeneration and glaucoma
(2015-07-24) Ortín Martínez, Arturo; Vidal Sanz, Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Villegas Pérez, María Paz; Facultad de Medicina
. Objetivo. Determinar el número total y la topografía de la población de conos en roedores adultos utilizando rutinas automatizadas que nos permita investigar objetivamente los efectos de diferentes modelos experimentales de patologías humanas tales como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinosis pigmentaria (RP) y la neuropatía óptica glaucomatosa (NOG) sobre la población de fotorreceptores. Material y métodos. Se han utilizado cinco cepas distinta de roedores: Sprague-Dawley (SD), Piebald Virol Glaxo (PVG) y la rata transgénica P23H-1, y ratones Swiss y C57/BL6. Todos los experimentos y procedimientos se han realizado bajo el estricto cumplimiento de las recomendaciones de la “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO)” y la “European Union guidelines for the use of animals in research”, y todos los procedimientos utilizados han sido previamente aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Murcia. Se han utilizado diferentes técnicas para el estudio histológico y morfológico y se han analizado en retinas montadas a plano y en secciones transversales; se han utilizado tecnologías de imagen avanzadas como la Spectral Domain Optical Coherence Tomography (SD-OCT)y se ha realizado análisis de proteínas mediante Western Blot. Como modelo de RP se ha utilizado la rata transgénica P23H-1, esta rata es portadora de una mutación autosómica dominante en el gen de la rodopsina que causa distrofia y muerte de los fotorreceptores. Se ha desarrollado un nuevo modelo experimental útil para la comprensión de la patología de la DMAE, la fototoxicidad localizada de los fotorreceptores tipo cono inducida por LED (FTIL). Por último se ha utilizado un modelo experimental de hipertensión ocular (HTO) inducida mediante láser que permite la evaluación de los efectos de la NOG sobre la población de fotorreceptores. Resultados. El número medio de conos que expresan la opsina-L es de 231.736 ± 14.517 en la rata SD; 239.939 ± 6.494 en la rata PVG; 117.424 ± 17.721 en el ratón Swiss y 135.155 ± 8.742 en el ratón C57/BL6. El número medio de conos que expresan la opsina-S es de 41.028 ± 5.074 en la rata SD; 27.316 ± 2.235 en la rata PVG; 146.682 ± 24.958 en ratones Swiss y 119.616 ± 8.756 en ratones C57/BL6. El porcentaje de conos duales en la rata SD es del 3,2%, del 2,9% en la PVG, de un 73% en el ratón Swiss y de un 40% en el C57/BL6. En todas las cepas de ambas especies existe un paralelismo en la distribución de las células ganglionares de retina (CGR) y los conos-L. La topografía de los conos-L en todas las cepas de rata y ratón analizadas es similar, se observan zonas de alta densidad en el eje nasotemporal superior, las densidades medias alrededor del nervio óptico y un descenso de densidad gradual desde las zonas centrales hacia las periféricas. Sin embargo, existen claras diferencias en la distribución de los conos-S entre las especies y cepas analizadas. El la rata P23H-1, la degeneración de los bastones ocurre antes que la de los conos y de forma rápida: primero con el acortamiento de los segmentos externos, a P30 existe una gran pérdida de bastones y a P180 la pérdida es prácticamente en la totalidad de la retina exceptuando la extrema periferia. La degeneración de bastones y conos está espaciotemporalmente relacionada, ocurre en forma de anillos que aparecen alrededor de P90 y se extiende por toda la retina. A P180, los anillos de degeneración son más abundantes en la retina ecuatorial y de mayor tamaño en la retina dorsal. En un nuevo modelo in vivo de fototoxicidad focal de los fotorreceptores inducido por LED, la SD-OCT muestra un daño en una región circular situado en la retina superotemporal. En esta región se observa una disminución progresiva del espesor de la retina desde 183,4 ± 5 mm (12 h) hasta 114,6 ± 6 mm (7 d). Las secciones transversales muestras una pérdida masiva de bastones y conos en la región dañada por la luz. En las retinas montadas a plano se observa una región circular con disminución del número de conos-L y conos-S. En este área circular en las retinas izquierdas y en la región correspondiente de la retina control derecha, el número total de conos-L o conos-S es de 7.118 ± 842 ó 661 ± 125 en las retinas fotoexpuestas (n=7) y de 14.040 ± 1.860 ó 2.255 ± 193 en las retinas control (n=7), respectivamente. Aunque el CNTF no, la brimonidina, el BDNF, PEDF y el bFGF muestran efectos neuroprotectores significativos sobre los conos-L y conos-S. La HTO provoca sectores con su vértice en el disco óptico carentes de CGR Brn3a pero que aún contienen gran número de núcleos DAPI positivos. Los niveles de todas las opsinas disminuyen a las 2 semanas y esta disminución progresa hasta el 20% de los niveles basales a los 3 meses. Las secciones transversales revelan áreas focales de degeneración en las capas externas de la retina (CER). Las CGR supervivientes a los 15 días representan aproximadamente el 28% y no cambian con el tiempo, mientras que de las poblaciones de conos-L y conos-S sobreviven un 80% y un 65% a un mes o un 35% y un 20% a 6 meses, respectivamente. Conclusiones. Se ha establecido, por primera vez, el número total y la distribución topográfica de los conos-L y conos-S en dos cepas de rata y dos de ratón y se ha demostrado el paralelismo topológico de la distribución de los conos-L y las CGR. Se han proporcionado las bases para estudiar la degeneración de conos y su prevención en condiciones patológicas. Se ha descrito por primera vez que, en la rata P23H-1, la degeneración de bastones y conos está espaciotemporalmente relacionada y se produce en anillos. La pérdida de conos sigue a la pérdida de bastones, que comienza de forma temprana, incluso antes de P30, la primera edad analizada. Las características de los anillos sugieren que la degeneración secundaria de conos está influenciada por la localización en la retina y / u otros factores intrínsecos o extrínsecos. Se ha evidenciado que la FTIL provoca una pérdida de conos y bastones y es un modelo fiable, cuantificable y reproducible para estudiar la degeneración de los fotorreceptores. La administración intravítrea de BDNF, PEDF o bFGF, o la administración tópica de brimonidina proporcionan neuroprotección significativa sobre los conos, en este modelo. Se ha demostrado que la HTO induce una pérdida selectiva de CGR en la capa de la CGR que no progresa después de 1 mes, mientras que los conos-L y conos-S presentan una pérdida progresiva hasta los 6 meses. Por lo tanto, HTO provoca graves daños tanto en las capas más internas como en las CER. SUMMARY. Purpose. To determine the total number and topography of the cone population in two rat and two mouse strains using automated routines which allowed us to investigate objectively the effects of different experimental models of human pathologies such as Aging Macular Degeneration (AMD), Retinitis Pigmentosa (RP) and Glaucomatous Optic Neuropathy (GON) on the photoreceptor population. Material y methods. A total of 303 rats and 23 mice were used in this thesis, five different strains of rodents were used: albino Sprague-Dawley (SD), pigmented Piebald Virol Glaxo (PVG) and P23H-1 transgenic rats, albino Swiss and pigmented C57/BL6 mice. All experimets and procedures were carried out in strict accordance with the recommendations in the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) and the European Union guidelines for the use of animals in research, and all the protocols were approved by the Ethical and Animal Studies Committee of the University of Murcia. Several techniques such as, the identification of the three different types of photoreceptors and other retinal populations by immunohistofluorescence analyzed in whole flat-mounted retinas and in oriented radial sections, classical staining as H-E, imaging advanced technologies as Spectral Domain Optical Coherence Tomography (SD-OCT), and protein analysis by western blot, have been used. In this thesis the P23H-1transgenic rat has been used as a model of RP, this animal bears an autoasomal dominat mutation in the rhodopsin gene (proline to histidine substitution at codon 23 of the rodopsin protein) that causes photorecptor dystrophy and death. A new experimental model useful to understand the AMD pathology, has been developed for this thesis, Light Emmitting Dioede (LED)-induced cone-photoreceptor phototoxicity (LIP), the blue-light LED exposition on the rat retina causes a damage-area located in the retinal zone with maximun L-cones densities and a cone to rod ratio similar to the human macular fovea. And finally, an experimental model of Laser-induced ocular hypertension developed recently in our Laboratory of Experimental Ophthalmology at the University of Murcia has been used to understand the effects of GON on the cone population. Results. The mean number of L-opsin+cones is 231,736 ± 14,517 in SD rat; 239,939 ± 6,494 in PVG rat; 117,424 ± 17,721 in Swiss mouse and 135,155 ± 8,742 in C57/BL6 mouse. The mean number of S-opsin+cones 41,028 ± 5,074 in SD rat; 27,316 ± 2,235 in PVG rat; 146,682 ± 24,958 in Swiss mouse and 119,616 ± 8,756 in C57/BL6 mouse. The percentage of dual cones is 3.2% in SD rat; 2.9% in PVG rat; 73% in Swiss mouse and 40% in C57/BL6 mouse. In all strains, and both species, there is a parallel distribution of retinal ganglion cells (RGC) and L-cones. The topography of L-cones is similar in all strains of rats and mice analyzed, the highest densities are observed in the superior nasotemporal axis, medium densities around the optic nerve, and this density gradually decreases from the center to the periphery. However, obvious differences are found in S-cones distribution. While in the two rat strains there is a increasing gradient of S-cones density along the inferonasal quadrant and the highest densities are found in the retinal rim, in the Swiss mouse strains S-cones are abundant in the dorsal retina although their highest densities are ventral but the C57/BL6 mouse shows a low number of S-cones in the dorsal retina and very dense population in the ventral retina, being densest in its nasal aspect. In P23H-1 rats, rod degeneration occurs rapidly: first the rod outer segment shortens, at P30 there is extensive rod loss, and by P180 rod loss is almost complete except for the most peripheral retina. The numbers of L cones are, at all postnatal ages, lower in P23H-1 rats than in control SD rats, and decrease significantly with age (by P180). Rod and cone degeneration is spatiotemporally related and occurs in rings that appear already at P90 and spread throughout the entire retina. At P180, the rings of rod-cone degeneration are more abundant in the equatorial retina and are larger in the dorsal retina. In a novel in vivo model of focal LED-induced photoreceptor phototoxicity SD-OCT showed damage in a circular region of the superotemporal retina, whose diameter varied from 1,842.4 ± 84.5 mm (at 24 hours) to 1,407.7 ± 52.8 mm (at 7 days). This region had a progressive thickness disminution from 183.4 ± 5 mm (at 12 h) to 114.6 ± 6 mm (at 7 d). Oriented cross-sections showed within the light-damaged region of the retina massive loss of rods and cone-photoreceptors. Wholemounts documented a circular region containing lower numbers of L- and S-cones. Within a circular area (1 mm or 1.3 mm radius, respectively) in the left and in its corresponding region of the contralateral-fellow-retina, total L- or S-cones were 7,118 ± 842 or 661 ± 125 for the LED exposed retinas (n=7) and 14,040 ± 1,860 or 2,255 ± 193 for the fellow retinas (n=7), respectively. Brimonidine, BDNF, PEDF and bFGF but not CNTF showed significant neuroprotective effects on L- and S-cones. Ocular hypertension (OHT) resulted in wedge-like sectors with their apex on the optic disc devoid of Brn3aRGC but with large numbers of DAPI+nuclei. The levels of all opsins diminished by 2 weeks and further decreased to 20% of basal-levels by 3 months. Cross-sections revealed focal areas of outer retinal layers (ORL) degeneration. RGC survival at 15 days represented approximately 28% and did not change with time, whereas the L-cone and S- populations diminished to 80% and 65%, or to 35% and 20% at 1 or 6 months, respectively. Conclusions. It has been established, for the first time, the total number and the topographical distribution of S- and L-cones in two rat and two mouse strains and demonstrated the correlation of L-cones and RGC spatial distribution. It has been provided the basis to study cone degeneration and its prevention in pathologic conditions. It has been described for the first time that in the P23H-1 rat, rod and cone degeneration is spatiotemporally related and occurs in rings. Cone loss follows rod loss and starts very soon, even before P30, the first age analyzed here. The characteristics of the rings suggest that secondary cone degeneration is influenced by retinal position and/or other intrinsic or extrinsic factors. It has been evidenced that LIP results in rod and cone-photoreceptor loss, and is a reliable, quantifiable model to study cone-photoreceptor degeneration. Intravitreal BDNF, PEDF or bFGF, or topical BMD afford significant cone neuroprotection in this model. It has been demostrated that OHT induces in the ganglion cell layer selective RGC loss that does not progress after 1 month, whereas the S- and L-cones exhibit progressive loss up to 6 months. Thus, OHT results in severe damage to both the innermost and the ORL. Palabras clave: Retina, Fotorreceptores, Conos, Retinosis Pigmentaria, Degeneración Macular Asociada a la Edad, Glaucoma. Key words: Retina, Photoreceptors, Cones, Retinitis Pgmentosa, Aging Macular Degeneration, Glaucoma.
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Capacidad diagnóstica de la microperimetría, el campo visual y la tomografía óptica de coherencia macular y papilar en el glaucoma
(Universidad de Murcia, 2018-01-16) Rodríguez Cavas, Marta Beatriz; Villegas Pérez, María Paz; García Medina, José Javier; Facultades, Departamentos, Servicios y Escuelas::Facultades de la UMU::Facultad de Medicina
INTRODUCCION: El glaucoma es una neuropatía óptica la segunda causa de ceguera en el mundo después de las cataratas y es, por tanto, la principal causa de ceguera irreversible. El tipo de glaucoma más frecuente en nuestro país es con mucho el glaucoma primario de ángulo abierto, que se define como una neuropatía óptica multifactorial progresiva. La muerte de células ganglionares de la retina se asocia con cambios estructurales y funcionales. Los daños estructurales consisten en aumento de la excavación papilar, adelgazamiento del anillo neurorretiniano y de la capa de células ganglionares de la mácula y de la capa de fibras nerviosas de la retina (CFNR). El daño funcional causa defectos del campo visual con patrones específicos En la última década el desarrollo de las nuevas tecnologías y de los recursos informáticos ha supuesto una revolución en el diagnóstico del glaucoma. En concreto, la introducción de la tomografía óptica de coherencia que permite medir estructuras papilares y retinianas y segmentar y estimar el grosor de las capas retinianas y de la microperimetría (MP) han permitido el diagnóstico más preciso de esta patología. OBJETIVOS: El objetivo de este estudio es evaluar la capacidad diagnóstica de varias pruebas estructurales y funcionales: la MP macular, la perimetría automatizada estándar macular, la OCT macular y la OCT papilar para diferenciar entre distintos estadíos evolutivos de glaucoma e investigar la correlación de los resultados obtenidos en la diferentes pruebas. MATERIAL Y MÉTODOS: Es un estudio descriptivo de cohorte y transversal, que incluye pacientes sanos, pacientes con hipertensión ocular y pacientes con glaucoma primario de ángulo abierto, estos últimos divididos en: glaucoma leve, moderado y severo. Se incluyeron en el estudio un total de 128 ojos de 99 pacientes: 44 “sin glaucoma” y 84 “con glaucoma”. De los 44 ojos “sin glaucoma”, 22 eran “sanos” y 22 “hipertensos oculares”. De los 84 ojos “con glaucoma”, 26 padecían “glaucoma leve”, 20 “glaucoma moderado” y 38 “glaucoma severo”. A cada paciente se le realizaron tres pruebas funcionales: MP, CV 10-2 y 30-2 y dos estructurales: OCT de papila y macula. De las pruebas funcionales maculares se tuvieron en cuenta las sensibilidades medias en decibelios y también convertidas a escala lineal. En la OCT se midieron el reborde neuroretiniano y la excavación, el espesor de la capa de fibras nerviosas (RFNL) peripapilar, y, a nivel macular, el grosor de la RFNL, de la unión de la capa de células ganglionares y la capa plexiforme interna (GCLIPL) y de la retina externa. Se compararon los parámetros obtenidos en las pruebas entre los dos grupos generales del estudio (sin glaucoma y con glaucoma) y entre los cinco subgrupos de estudio. Por otra parte, se calculó la capacidad diagnóstica de los diferentes parámetros de estos tests funcionales y estructurales utilizando el análisis de curvas Receiver Operating characteristic Curve (COR). Por último, se realizó un estudio de correlación estructura-función macular entre los parámetros obtenidos en las diferentes exploraciones maculares RESULTADOS: Todos los parámetros estudiados mostraron capacidad de diagnóstico de glaucoma. La comparación de los parámetros obtenidos en las pruebas funcionales entre los diferentes subgrupos El análisis comparativo del tiempo empleado en la realización de las pruebas funcionales determinó que la prueba que más se tarde en realizar es la MP, seguida del CV 10-2 y después el CV 30-2; y que conforme se incrementa la severidad de la enfermedad se tarda más tiempo en realizar cualquiera de las pruebas. La comparación de los parámetros obtenidos en las pruebas estructurales mostró que tanto el área del reborde neuroretiniano como el volumen y el diámetro vertical de la excavación y el grosor de la RFNL peripapilar y en la mácula el grosor de la GCLIPL y de la RFNL mostraban capacidad diagnóstica de glaucoma, pero estos parámetros mostraron diferentes sensibilidades en la comparación entre los diferentes subgrupos, aunque generalmente estas eran mayores cuando aumentaba la severidad del glaucoma. El grosor de la retina externa macular no mostró cambios entre los grupos. El análisis por curvas COR determinó que los parámetros con mayor valor diagnóstico fueron la DSM y la duración de las pruebas funcionales, que aumentaban con la severidad del glaucoma y que tenían mayor sensibilidad que los parámetros estructurales. El análisis de correlación determinó una buena correlación entre las pruebas funcionales maculares (MP y CV 10-2), que aumentaba con la severidad de la enfermedad. Por otra parte, a nivel macular se pudieron evidenciar, tanto con correlaciones estructura-función entre MP o CV 10-2 y espesores maculares que no aumentaron cuando las sensibilidades fueron convertidas a escala lineal. CONCLUSIONES: Los parámetros del CV 10-2 y de la MP y de la OCT papilar y macular estudiados muestran una buena capacidad diagnóstica de glaucoma y además tienen capacidad para diferenciar entre los diferentes estadios evolutivos del glaucoma excepto en los intervalos sanos versus hipertensos oculares y glaucoma leve versus glaucoma moderado. De los parámetros estructurales estudiados, el grosor de la GCLIPL tiene mayor capacidad diagnóstica que el grosor de la CFNR. De los parámetros funcionales, tienen mejor capacidad discriminativa la DSM y la duración de la prueba y son superiores a los parámetros de la OCT. Por otro lado, las correlaciones estructura-función encontradas a nivel macular aumentaron conforme aumenta la gravedad del glaucoma. INTRODUCTION Glaucoma is the second leading cause of blindness in the world after cataract so it is the main cause of irreversible blindness. The most common type of glaucoma in our country is primary open-angle glaucoma by far, that is defined as a multifactorial and progressive optic neuropathy. Ganglion cell death in the retina is associated with structural and functional changes. Structural damage is made up of disc cupping, thinning of neuroretinal rim, macular ganglion cell layer and retinal nerve fiber layer (RNFL). Functional damage causes several visual field defects with specific patterns. Over the last decade the development of new technologies and computing resources have provided a revolution in the diagnostic procedures of glaucoma. Specifically, the introduction of optical coherence tomography that allows the possibility of measuring papillary and retinal structures and segmentating and estimating the thickness of intraretinal layers, and microperimetry (MP) have let on more precise diagnosis in this disease. PURPOSE The main goal of this study is to evaluate the diagnostic capacity of several structural and functional tests: macular MP, macular automated perimetry (AP), macular and papilar OCT in order to make differences among the evolutionary stages of glaucoma and to investigate the correlation of the results as obtained by different tests. METHODS This is a transversal, descriptive study that recruited healthy patients, ocular hypertensive patients, and patients with primary open-angle glaucoma. These latter ones were divided into early, moderate and severe glaucoma. 128 eyes from 99 patients were finally included: 44 without glaucoma (22 healthy and 22 hypertensive eyes) and 84 with glaucoma (26 early glaucoma, 20 moderate glaucoma and 38 severe glaucoma). Each patient underwent three functional (MP, AP 10-2, AP 30-2) and two structural tests (papillary and macular OCT). Mean sensitivities in decibels and mean sensitivities converted to lineal scale were considered in functional tests. Concerning OCT, neuroretinal rim, cupping, peripapillary RNFL thickness and, in the macular region, thickness of the RNFL, the sum of ganglion cell layer and inner plexiform layer (GCLIPL) and outer retina were measured. Parameters obtained in these tests were compared between general groups in this study (groups with and without glaucoma) and between five subgroups. Otherwise, diagnostic capacities of the different parameters were calculated for structural and functional tests using receiver operating characteristics curves. Finally, a correlation study of the macular structure-function relationship between obtained parameters was conducted. RESULTS Every studied parameter showed diagnostic capacity of glaucoma. The comparison of the values obtained in different subgroup presented significant differences between all the subgroups except for healthy versus hypertensive subgroups (none parameter exhibited to be different) and early versus moderate glaucoma. Comparative analysis of duration in the functional tests concluded that the longest-lasting test was MP, followed by AP 10-2 and AP 30-2. The higher the stage severity was the longer the test was, independently of the kind of test. The comparison of structural results showed that area and volume of the neuroretinal rim, vertical cupping, peripapillary RNFL and macular GCL and RNFL presented diagnostic capacity in glaucoma. These parameters showed different results between different groups although, in general, the greater severity of glaucoma the higher they were. Thickness of outer retina did show no changes between groups. ROC curve analysis showed that the best parameters to distinguish between stages were pattern standard deviation (PSD) and the duration of functional tests that presented better capacity than structural parameters. Correlation analysis demonstrated good associations between both functional macular tests (MP and AP-10-2). The strength of these associations increased as long as the severity of the disease increased. Otherwise, it was found similar macular structure-function relationships using MP and AP 10-2 irrespective of whether the sensitivities were converted into linear scale or not. CONCLUSION Parameters of AP 10-2, microperimetry, papillary and macular OCT studied show a good diagnostic capacity in glaucoma. Plus, they are able to differentiate between different evolutionally stages of glaucoma except for the intervals of healthy and hypertensive patients and early versus moderate glaucoma. Among structural parameters studied, GCLIPL thickness has greater diagnostic capacity than RNFL. Considering functional parameters, the best discriminative power was found for PSD and duration of the tests, that they are superior to OCT parameters. Furthermore, macular structure-function correlations were more numerous and stronger as long as the severity of the disease increases.
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Comparison of retinal nerve fiber layer thinning and retinal ganglion cell loss after optic nerve transection in adult albino rats
(Association for Research in Vision and Ophthalmology., 2015-07-15) Rovere, Giuseppe; Nadal-Nicolás, Francisco Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Sobrado Calvo, Paloma; Nieto López, Leticia; Nucci, Carlo; Villegas Pérez, Maria Paz; Vidal Sanz, Manuel; Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica; Facultades de la UMU::Facultad de Medicina
PURPOSE. We compared the time-course and magnitude of retinal nerve fiber layer (RNFL) thinning with that of retinal ganglion cell (RGC) loss after intraorbital optic nerve transection (IONT) in adult rats. METHODS. At 3, 7, 12, or 21 days, or 1, 2, or 4 months after ONT, the retinas were imaged with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) using the circular-peripapillary scan and volume scan raster pattern (61 horizontal sections equally spaced) both centered in the optic nerve. In all sections, the RNFL and retinal thickness were measured to obtain the total values of the peripapillary scan and the values of three concentric sectors (400, 1200, and 2400 lm in diameter) from the volume scan. After SD-OCT, retinas were dissected and immunoreacted for Brn3a and neurofilaments (pNFH) to identify RGCs and their intraretinal axons, respectively. Total numbers of RGCs were quantified. RESULTS. Thinning of the RNFL was first observed at 12 days in peripapillary scan (10% decrease) and progressed up to 4 months (72% decrease). The volume scan showed transient RNFL swelling in central and medial sectors at 3, 7, and 12 days followed by progressive significant thinning first observed at 21 days (central sector, 30%; medial sector, 40%) and 12 days (peripheral sector, 15%), respectively. Following IONT, Brn3aþ RGCs decreased to approximately 80%, 52%, 17%, 9%, 5%, 3%, and 2% at 3, 7, 12, 21 days, and at 1, 2, and 4 months, respectively. Retinal ganglion cell axon immunodetection decreased from 12 days onwards. CONCLUSIONS. After IONT, RGC death is more severe and precedes thinning of the RNFL.
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Conferencia: 'Disease progression in glaucoma animal models and the pathogenic role of gamma-synuclein'
(2009-06-25) Urbina, Luis
Conferencia: 'Disease progression in glaucoma animal models and the pathogenic role of gamma-synuclein', a cargo de Nicholas Marsh-Armstrong.
Restricted
Differential visual system organization and susceptibility to experimental models of optic neuropathies in three commonly used mouse strains
(Elsevier, 2016-01-12) De Groef, Lies; Dekeyster, Eline; Geeraerts, Emiel; Lefevere, Evy ; Stalmans, Ingeborg; Moons, Lieve; Salinas Navarro, Manuel Ángel; Anatomía Humana y Psicobiología
Mouse disease models have proven indispensable in glaucoma research, yet the complexity of the vast number of models and mouse strains has also led to confusing findings. In this study, we evaluated baseline intraocular pressure, retinal histology, and retinofugal projections in three mouse strains commonly used in glaucoma research, i.e. C57Bl/6, C57Bl/6-Tyrc, and CD-1 mice. We found that the mouse strains under study do not only display moderate variations in their intraocular pressure, retinal architecture, and retinal ganglion cell density, also the retinofugal projections to the dorsal lateral geniculate nucleus and the superior colliculus revealed striking differences, potentially underlying diverging optokinetic tracking responses and visual acuity. Next, we reviewed the success rate of three models of (glaucomatous) optic neuropathies (intravitreal N-methyl-d-aspartic acid injection, optic nerve crush, and laser photocoagulation-induced ocular hypertension), looking for differences in disease susceptibility between these mouse strains. Different genetic backgrounds and albinism led to differential susceptibility to experimentally induced retinal ganglion cell death among these three mouse strains. Overall, CD-1 mice appeared to have the highest sensitivity to retinal ganglion cell damage, while the C57Bl/6 background was more resistant in the three models used.
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Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats
(Frontiers Media , 2014-10-06) Nadal-Nicolás, Francisco Manuel; Salinas Navarro, Manuel Ángel; Jiménez López, Manuel; Sobrado Calvo, Paloma; Villegas Pérez, Maria Paz; Vidal Sanz, Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica; Facultades de la UMU::Facultad de Medicina
We have studied in parallel the population of displaced retinal ganglion cells (dRGCs) and normally placed (orthotopic RGCs, oRGCs) in albino and pigmented rats. Using retrograde tracing from the optic nerve, from both superior colliculi (SC) or from the ipsilateral SC in conjunction with Brn3 and melanopsin immunodetection, we report for the first time their total number and topography as well as the number and distribution of those dRGCs and oRGCs that project ipsi- or contralaterally and/or that express any of the three Brn3 isoforms or melanopsin. The total number of RGCs (oRGCs+dRGCs) is 84,706 ± 1249 in albino and 90,440 ± 2236 in pigmented, out of which 2383 and 2428 are melanopsin positive (m-RGCs), respectively. Regarding dRGCs: i/ albino rats have a significantly lower number of dRGCs than pigmented animals (0.5% of the total number of RGCs vs. 2.5%, respectively), ii/ dRGCs project massively to the contralateral SC, iii/ the percentage of ipsilaterality is higher for dRGCs than for oRGCs, iv/ a higher proportion of ipsilateral dRGCs is observed in albino than pigmented animals, v/ dRGC topography is very specific, they predominate in the equatorial temporal retina, being densest where the oRGCs are densest, vi/ Brn3a detects all dRGCs except half of the ipsilateral ones and those that express melanopsin, vii/ the proportion of dRGCs that express Brn3b or Brn3c is slightly lower than in the oRGC population, viii/ a higher percentage of dRGCs (13% albino, 9% pigmented) than oRGCs (2.6%) express melanopsin, ix/ few m-RGCs (displaced and orthotopic) project to the ipsilateral SC, x/ the topography of m-dRGCs does not resemble the general distribution of dRGCs, xi/ The soma size in m-oRGCs ranges from 10 to 21 μm and in m-dRGCs from 8 to 15 μm, xii/ oRGCs and dRGCs have the same susceptibility to axonal injury and ocular hypertension. Although the role of mammalian dRGCs remains to be determined, our data suggest that they are not misplaced by an ontogenic mistake.
Open Access
Dock3-NMDA receptor interaction as a target for glaucoma therapy
(Universidad de Murcia. Departamento de Biología Celular e Histología, 2017) Kimura, Atsuko; Namekata, Kazuhiko; Guo, Xiaoli; Harada, Chikako; Harada, Takayuki
y. Glaucoma is a neurodegenerative disease of the eye and it is one of the major causes of blindness. Glaucoma is usually associated with elevated intraocular pressure (IOP) and the current therapy focuses on reduction of IOP. However, neuroprotective strategies could also be beneficial for treatment of glaucoma because the pathology of the disease involves retinal ganglion cell (RGC) death and damage to the optic nerve. Dedicator of cytokinesis 3 (Dock3) is an atypical guanine exchange factor (GEF) that belongs to a family of Dock proteins, Dock1-11. Dock3 exerts neuroprotective effects on the retina and optic nerve, and studies revealed that some of the Dock3-mediated effects are GEF-independent. One of these mechanisms is that Dock3 directly binds to the GluN2B subunit of the Nmethyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Upon stimulation by NMDA or optic nerve crush, overexpression of Dock3 promotes internalization and degradation of the NMDA receptor in the retina in vivo. It is suggested that this process is mediated by inhibition of Fyn, a Src family tyrosine kinase. Reduction in NMDA receptor expression results in decreased excitotoxic damage and oxidative stress, thereby promoting RGC survival. In this review, we discuss the therapeutic potential of neuroprotection for glaucoma and the effects of Dock3 on NMDA receptors. We also discuss apoptosis signalregulating kinase 1 (ASK1), a member of mitogenactivated protein kinase kinase kinase that is a key regulator of cellular responses to oxidative stress, as an innovative therapeutic target for glaucoma.
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Ecografía Doppler retrobulbar en pacientes con glaucoma / Gloria Mª Torralbo Caballero; directores, Vicente García Medina, Fernando Hernández Artola
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Dermatología, Estomatología, Radiología y Medicina Física,, 2009) Torralbo Caballero, Gloria María
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Effects of a non-selective ß-blocker on adult rat anterograde axonal transport and retinal ganglion layer after increased intraocular pressure
(Murcia : F. Hernández, 2005) Díaz, F.; Villena, A.; Moreno M.; Vidal, L.; Parrado, C.; García-Campos, J.; Perez de Vargas, I.
The aim of this study was to examine the effects of timolol in an experimental model of elevated intraocular pressure (IOP). Three episcleral veins of rats with normal IOP were cauterized. Three months later we examined the effects on anterograde axonal transport from the retinal ganglion cells (RGCs) to the superior colliculus (SC) as well as on the number of neurons in the retinal ganglion layer (RGL). These parameters were also studied in a group of rats submitted to treatment with timolol after confirming that their IOP was still raised after two weeks. After the surgical procedure, the mean IOP of the experimental eyes increased to 33.5±1.06 mmHg (1.25 fold compared to the control group) and three months later the IOP remained significantly elevated; however, after a long period of treatment with timolol the IOP was 14.05±0.81 mmHg, similar to that of the control group. In the group with normal IOP, labelling with horseradish rabbit peroxidase (HRP) at 120 minutes and 24 hours postinjection showed continuous staining from the retina to the SC. In the experimental group the optic nerve head (ONH) was completely negative, although in the group treated with timolol there was partial block of axonal transport in the ONH, in which the staining was slightly more intense The number of neurons in the RGL, counted by immunohistochemical labelling with Neu-N, showed that in eyes with normal and elevated IOP there were 423±11 neurons/mm2 and 283±10 neurons/mm2, respectively. After treatment with timolol the number of neurons (331±10 cells/mm2) increased compared with elevated IOP eyes, although the number did not reach that of the control group. These results indicate that treatment with timolol, started two weeks after the surgical procedure, was partially neuroprotective because the loss of neurons in the RGL was lower than in untreated animals, though not sufficient to re-establish normal axonal transport.
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Estudio cuantitativo y cualitativo del sueño en el glaucoma mediante cuestionarios validados y pruebas morfofuncionales
(Universidad de Murcia, 2018-07-09) Tudela Molino, Miguel; Villegas Pérez, María Paz; García Medina, José Javier; Escuela Internacional de Doctorado
INTRODUCCIÓN La influencia de las circunstancias relacionadas con el sueño en el glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) ha sido poco estudiada. OBJETIVOS Evaluamos la calidad del sueño, la somnolencia diurna y el riesgo de padecer síndrome de apnea obstructiva del sueño (SAOS) en pacientes sin y con GPAA. También si estos influían en el campo visual (CV) y en el espesor de varias capas retinianas y en parámetros papilares en los dos grupos de pacientes. MATERIAL Y MÉTODOS Estudio prospectivo, observacional y transversal que incluyó pacientes sin glaucoma y pacientes con GPAA. Los pacientes cumplimentaron los tests de calidad del sueño de Pittsburgh, de somnolencia diurna de Epworth, de Berlín de despistaje de SAOS y otro sobre postura dominante durante el sueño y número de almohadas utilizadas. Mediante tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT, Cirrus 4000) de la mácula y de la papila se evaluó el espesor: de la capa de fibras nerviosas de la retina (RNFL), del complejo capa de células ganglionares y plexiforme interna (GCLIPL) y de la retina externa (OR) macular, de la RFNL peripapilar, y el área de papila, la excavación media y vertical, y el volumen de la excavación papilar. Mediante CV 30-2 SITA Fast se obtuvieron el visual field index (VFI), el defecto medio (DM) y la desviación estándar modelo (DSM). Se incluyó en el estudio solo el ojo con peor DM de los pacientes. Los resultados perimétricos y de la SD-OCT se correlacionaron con los obtenidos en los tests de la calidad del sueño, de grado de somnolencia diurna y de riesgo de SAOS en los dos grupos de pacientes del estudio. RESULTADOS Se incluyeron 157 ojos: 99 de pacientes con GPAA y 58 de pacientes sin glaucoma. Los pacientes con GPAA tenían peor calidad del sueño y más riesgo de padecer SAOS que los pacientes sin glaucoma. No se observaron diferencias ni en el grado de somnolencia diurna ni en la postura predominante durante el sueño entre pacientes con GPAA y sin glaucoma. Cuando los resultados perimétricos se analizaron en función de la calidad del sueño y del riesgo de SAOS, no se observaron diferencias en ninguno de los dos grupos de estudio. Sin embargo, en el grupo de pacientes sin glaucoma, los que tenían mayor somnolencia diurna presentaban peor VFI, y en el grupo de pacientes con GPAA, los que tenían mayor somnolencia diurna presentaban peores VFI y DSM. Cuando se analizaron los resultados de la SD-OCT en función de la calidad del sueño y el grado de somnolencia diurna, no se observaron diferencias en el espesor de las capas maculares, ni en el espesor de la RNFL peripapilar, ni en los parámetros papilares en ninguno de los dos grupos del estudio. Al analizar los resultados de la SD-OCT en función del riesgo de SAOS, no se observaron diferencias en el espesor de las capas maculares, ni en el espesor de la RNFL peripapilar, ni en los parámetros papilares en el grupo de pacientes sin glaucoma. Sin embargo, en el grupo de pacientes con GPAA se observó que los espesores de la GCLIPL macular y de la RFNL peripapilar eran inferiores en pacientes con alto riesgo de SAOS. CONCLUSIONES El GPAA se asocia a una disminución de la calidad del sueño y a mayor riesgo de SAOS. Los pacientes sin glaucoma y con GPAA y con mayor grado de somnolencia diurna presentan peores índices perimétricos. Los pacientes con GPAA y alto riesgo de SAOS presentan menor espesor medio de la GCLIPL macular y de la RFNL peripapilar que los pacientes con GPAA y bajo riesgo de SAOS. INTRODUCTION The influence of sleep-related circumstances in primary open-angle glaucoma (POAG) has been little studied. PURPOSE The main objective was to evaluate sleep quality, daytime sleepiness and the risk of suffering obstructive sleep apnea syndrome (OSAS) in patients with and without POAG. It also intended to evaluate their influence in the visual field (VF) and in the thickness of the retinal layers and optic disk parameters in both groups of patients. METHODS Prospective, observational and cross-sectional study that included patients without glaucoma and patients with POAG. Every patient completed the following tests: Pittsburgh Sleep Quality, Epworth daytime sleepiness, Berlin OSAS and an additional one on the dominant sleeping position and the number of pillows used. Using spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT, Cirrus 4000) of the macula and optic disk, we evaluated the thickness of the retinal nerve fiber layer (RFNL), ganglion cell layer-inner plexiform layer complex (GCLIPL) and outer retina (OR) in the macula, and the peripapillary RFNL thickness, the disk area, the mean and vertical cup diameters, and the cup volume. With the VF 30-2 SITA Fast, the Visual Field Index (VFI), mean deviation (MD) and pattern standard deviation (PSD) were obtained. Only the eye with the worse MD was included for each patient. Perimetric and SD-OCT results were correlated with those of sleep quality, daytime sleepiness degree and risk of OSAS in the two groups of patients. RESULTS We included 157 eyes: 99 from patients with POAG and 58 from patients without glaucoma. Patients with POAG had worse sleep quality and had higher risk of OSAS than patients without glaucoma. No differences were observed in the degree of daytime sleepiness, nor in the dominant sleeping position between patients with POAG and patients without glaucoma. When the perimetric results were analyzed in relation to sleep quality and risk of OSAS, no differences were observed in any of the two study groups. However, in the group of patients without glaucoma, those with greater daytime sleepiness showed worse VFI, and in the group of patients with POAG, those with greater daytime sleepiness showed worse VFI and PSD. When the SD-OCT results were analyzed in relation to sleep quality and degree of daytime sleepiness, no differences were observed in the thickness of the macular layers, nor in the peripapillary RFNL thickness or in the optic disk parameters within the two groups of the study. When the SD-OCT results were analyzed according to the risk of OSAS, in the group of patients without glaucoma no differences were observed in the thickness of the macular layers, nor in the peripapillary RFNL thickness or in the optic disk parameters. However, in the group of patients with POAG, the thicknesses of the macular GCLIPL and peripapillary RNFL were smaller in patients with high risk of OSAS. CONCLUSION POAG is associated with decreased sleep quality and a higher risk of OSAS. Patients without glaucoma and with POAG and with a higher degree of daytime sleepiness show worse perimetric global indexes. Patients with POAG and high risk of OSAS have lower GCLIPL and peripapillary RFNL thickness than those with POAG and low risk of OSAS.
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Estudio del endotelio corneal y de la presión intraocular en pacientes intervenidos de glaucoma y catarata en uno o dos tiempos
(2015-09-03) Soro Martínez, María Isabel; Villegas Pérez, María Paz; Ruiz Gómez, José María; Miralles de Imperial Mora-Figueroa, Jaime; Facultad de Medicina
OBJETIVOS Determinar los cambios en la morfología y la disminución de la densidad de células endoteliales corneales tras la cirugía de glaucoma y catarata en uno ó dos tiempos, y analizar cuál de los dos tipos de cirugía produce mayor daño endotelial. Determinar la disminución de la presión intraocular tras la cirugía de glaucoma y catarata en uno ó dos tiempos y analizar cuál de los dos tipos de cirugía produce una mayor disminución de la Presión intraocular y/o mayor estabilidad de ésta en el postoperatorio. MATERIAL Y MÉTODOS Este es un estudio prospectivo randomizado y aleatorizado realizado en 46 ojos de 39 pacientes, con edad comprendida entre 66 y 80 años que padecían glaucoma y catarata. Los pacientes fueron seleccionados aleatoriamente para ser intervenidos de trabeculectomía y facoemulsificación con implante de lente intraocular (LIO) en uno (Grupo 1) o dos tiempos (Grupo 2), después de dar su consentimiento informado. Se recogieron de los pacientes varios tipos de datos: demografía, mejor agudeza visual corregida, evaluación del endotelio corneal mediante microscopia confocal (Confoscan 4™), medición del espesor corneal mediante biometría ultrasónica (Ocuscan®), medida de la profundidad de la cámara anterior con un biómetro óptico (IOLMaster®). Los pacientes fueron examinados previamente a la cirugía y 3, 6, 12 y 24 meses tras la cirugía. El análisis estadístico se llevó a cabo mediante el software Minitab® siguiendo los estándares publicados en la literatura clínica. RESULTADOS La Mejor Agudeza Visual corregida aumentó de forma significativa en los dos grupos después de la cirugía (p<0,0001) y la presión intraocular disminuyó de forma significativa en los dos grupos tras la cirugía (p<0,0001) pero no se observaron diferencias significativas (p=0,568 al mes, p=0,629 a los tres meses, p=0,208 a los seis meses y p=0,838 a los doce meses) entre los grupos en ninguno de los tiempos estudiados. El número medio de fármacos hipotensores tópicos se redujo de 1,21±0,55 a 0,20±0,43 colirios en el grupo 1 y 1,26±0.2 a 0,25±0,46 colirios en el grupo 2 a los 12 meses del estudio, no existiendo diferencias estadísticamente significativas (p=0,704) entre los dos grupos. La densidad endotelial disminuyó de forma significativa en ambos grupos tras la cirugía (p<0,0001). La densidad endotelial a los 12 meses de la cirugía fue de 1.769± 509 células/mm2 en el grupo 1 y de 1.396±514 células/mm2 en el grupo 2, siendo esta diferencia estadísticamente significativa (p<0,0001). El porcentaje medio de reducción de células endoteliales fue de 31,62±14,73 % en el grupo 1 y de 42,55±17,68 % en el grupo 2 a los 12 meses de estudio. El coeficiente de variación celular no varió de forma significativa en ninguno de los dos grupos tras la cirugía, sin embargo el coeficiente de hexagonalidad disminuyó de forma significativa en el grupo 2. No se encontró una correlación significativa entre la disminución de la densidad de células endoteliales y la profundidad de la cámara anterior preoperatoria ni tampoco entre esta densidad y el espesor corneal central previo a la cirugía en ninguno de los grupos, aunque tampoco se observaron edemas corneales clínicamente significativos en ninguno de los ojos incluidos en el estudio. SUMMARY IN ENGLISH OBJECTIVES To assess changes in morphology and density of the corneal endothelial cells after glaucoma and cataract surgery in one or two stages and to analyze which type of surgery causes most damage to the corneal endothelial cells. To assess the decrease of the intraocular pressure after glaucoma and cataract surgery in one or two stages and to analyze which type of surgery causes a greater decrease of the intraocular pressure and more stability of the intraocular pressure in the postoperative period. METHODS This is a randomized prospective cohort study that included 46 eyes with glaucoma and cataract from 39 patients aged between 66 and 80 years. Informed consent was obtained, after which the patients and were randomly assigned to receive trabeculectomy and phacoemulsification and intraocular lens (IOL) implantation in one (Group 1) or two stages (Group 2). Demographic as well as other parameters were determined: Best Corrected Visual Acuity (BCVA), corneal endothelial cell status (using confocal microscopy with the Confoscan 4™), central corneal thickness (using ultrasonic biometry Ocuscan®) and anterior chamber depth (using optic biometry IOLMaster®). Patients were assessed prior to surgery and 3,6,12 and 24 months after surgery. Statistical analysis was performed using the software Minitab® and published international clinical standards. RESULTS Best corrected visual acuity increased significantly in both groups after surgery (p<0.0001) and the intraocular pressure diminished significantly in both groups after surgery (p<0.0001), but there were not significant differences between groups at any of the periods studied (at one month, p=0.568; at three months, p=0.629; at six months, p=0.208; and at twelve months, p=838). Mean number of topical ocular hypotensive treatments diminished from 1.21±0.55 to 0.20±0.43 in Group 1 and from 1.26±0.2 to 0.25±0.46 in Group 2 twelve months after surgery and there were no significant differences between groups (p=0.704). Corneal endothelial cell density decreased significantly after surgery in both groups (p<0.0001). Endothelial cell density 12 months after surgery was 1,769± 509 cells/mm2 in Group 1 and 1,396±514 cells/mm2 in group 2, and this difference was statistically significant (p<0.0001). Mean percentage of decrease of corneal endothelial cells was 31.62±14.73% in Group 1 and 42.55±17.68% in Group 2, twelve months after surgery. The variation coefficient did not change significantly in any of the groups with surgery, but the hexagonality coefficient decreased significantly after surgery in Group 2. There was no significant correlation between the decrease of the endotelial cell densities and the preoperative anterior chamber depth or the preoperative central corneal thickness in any of the groups. However, we did not observe any clinically significant corneal edemas in any of the eyes included.
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Estudio electrorretinográfico en un biomodelo de glaucoma crónico en Göttingen Minipig
(2014-12-01) Micó Valls, Carlos; Vecino Cordero, Elena; Bayón del Río, Alejandro Ángel; Facultad de Veterinaria
La electrorretinografía es una técnica que permite evaluar de forma objetiva, la función retinal durante el proceso de transformación de un estímulo luminoso en una respuesta eléctrica. En nuestro estudio, se reproduce un biomodelo de glaucoma crónico humano de ángulo abierto en Göttingen minipig. Este biomodelo de glaucoma se consigue mediante la cauterización de las venas epiesclerales de uno de sus ojos, estando ya previamente validado en cerdo. Nuestros objetivos comprenden primeramente, la valoración de la evolución de la presión intraocular a lo largo de un periodo cercano al año (50 semanas), la estandarización de un protocolo electrorretinográfico en el Göttinger minipig y mediante el mismo, analizar los cambios producidos en el electrorretinograma como consecuencia del aumento sostenido de la presión intraocular. Esto nos permitirá crear un modelo de neurodegeneración producido por el glaucoma experimental. Por último, se analizará el modelo de neurodegeneración para encontrar patrones electrofisiológicos tempranos de dicho proceso. Todos estos datos se compararán con la bibliografía existente tanto a nivel de estudios realizados en humanos, como en otros biomodelos. Este estudio fue realizado en los ojos de 5 cerdos Göttingen minipig con edades en torno a los 5 meses. Tras confirmar la aptitud de los ojos para el estudio, a cada uno de los animales se les realizó un estudio clínico electrorretinográfico inicial, basado en las recomendaciones descritas por el ECVO y el ISCEV. El Test electroretinográfico se divide en tres pruebas, donde son recogidas las respuestas de la retina a estímulos de alta frecuencia (30Hz) y estímulos de baja frecuencia (4HZ) en condiciones fotópicas y en escotópicas. Una vez obtenidos los registros electrorretinográficos basales, se procede a la cauterización de las venas epiesclerales dorsales y ventrales de ojo izquierdo de cada animal. Este diseño experimental posibilita obtener en el mismo individuo un ojo control y un ojo experimental. Dicha cirugía permitió obtener una presión intraocular por encima de los valores normales, con un rango comprendido entre los 25 y 40 mmHg y mantenido a lo largo de todas las semanas de estudio. Nuevos estudios electrorretinográficos se repitieron posteriormente a los 2 y 4 meses tras la cirugía. El análisis de los resultados electrorretinográficos obtenidos, permitió mostrar una relación estadísticamente significativa entre el aumento de presión intraocular conseguida en el ojo a estudio, y el descenso de los valores de las ondas del electrorretinograma en dichos ojos. La comparativa realizada entre los valores electrorretinográficos basales y el ojo derecho control, con los datos obtenidos en el ojo izquierdo intervenido, evidencian la existencia de alteraciones en las ondas electrorretinográficas. Estas alteraciones quedan reflejadas primeramente en los valores de la onda-b, la onda-i y el PhNR del electrorretinograma y posteriormente se extienden al resto de los componentes electrorretinográficos. Estas ondas muestran un decrecimiento en su amplitud y latencia conforme avanza el tiempo de estudio y la presión intraocular elevada es mantenida. Dicho decrecimiento muestra un patrón, afectando primero a los componentes electrorretinográficos encargados de evaluar la función de las células ganglionares, así como también cuanto mayor es el tiempo de adaptación a condiciones escotópicas. Esta misma progresión de los valores electrorretinográficos de las ondas, ha sido ya descrita tanto en otros biomodelos de glaucoma experimental, como en personas afectadas por glaucoma crónico de ángulo abierto. Los hallazgos encontrados en nuestro estudio son homólogos a los que describe la bibliografía existente. Dentro de los parámetros cuyos valores muestran afectación debido al aumento sostenido de la presión intraocular, el componente PhNR presenta evidencias de una mayor precocidad en la detección los efectos producidos por dicha presión, en la respuesta de la retina. Los resultados obtenidos en nuestro estudio muestran que, en los ojos intervenidos, este componente posee un mayor número de valores fuera del rango normalidad desde el inicio del estudio electrorretinográfico y así mismo, no presenta alteración en el ojo control. Otros componentes como la onda-i y los valores de onda-b en condiciones escotópicas, presentan valores similares al PhNR pero no de forma tan precoz. Se representa así pues al componente PhNR como un importante marcador que permite el estudio y evaluación de los efectos que produce un aumento de presión intraocular sostenido, en la función electrofisiológica de la retina. The electroretinography is a technique that allows us, in an objective way, to test the function of the retina during the transformation process of a light stimulus into an electrical response. In this study, a biomodel of human chronic open-angle glaucoma is reproduced in Gottinguen minipigs. This glaucoma biomodel is made by the cauterization of episcleral veins in one of their eyes, this was previously described for pigs. Our main objectives include: Firstly, the evaluation of the intraocular pressure evolution throughout a period of nearly a year (50 weeks). Secondly, the standardization of an electroretinographic protocol in the Gottinguer minipig and, by means of it, the analysis of the changes produced in the electroretinogram after a sustained increase of the intraocular pressure. This will allow us to generate a model of neurodegeneration produced by the experimental glaucoma. And lastly, we will analyse the model of neurodegeneration in order to find early electrofisiological patterns in the mentioned process. All these data will be compared with the current bibliography about studies done in humans as well as in other biomodels. This test was done in the eyes of five gottinguen minipigs aged around five months. After verifying the suitability of the eyes for the study, a first electroretinografic clinic study was done to each animal, based on the detailed recommendations of the ECVO and ISCEV. The electroretinographic Test is divided into three different tests, in which we gather the responses of the retine to high(30Hz) and low (4HZ) frequency stimuli in photopic and scotopic conditions. Once we have obtained the basal electroretinographic values, we continue by cauterizing the dorsal and ventral episcleral veins in the left eye of each animal. This experimental design gives us the possibility of obtaining in the same individual a control eye and an experimental eye. Such surgery gave a result of an intraocular pressure above the standard values, with a rank of values between 25 and 40 mmHg, and were maintained all over the test period. New electroretinographic studies were repeated later, two and four months after the surgery. The analysis of the obtained electroretinographic results, gave us the possibility of showing a statistically significant relation between the increase of the intraocular pressure achieved in the eyes tested and the decrease of the electroretinogram wave values in those eyes. This comparison made between the basal electroretinographic values and the control right eye to the obtained data from the operated left eye, showed the presence of alterations in the electroretinographic waves. These alterations are showed first in the b-wave, the i-wave and the PhNR values of the electroretinogram and are later reflected on the rest of electroretinographic components. These waves show a decrease in their amplitude and latency as the time of the study progresses and the high intraocular pressure is maintained. Such a decrease shows a pattern: it first affects the electroretinographic components in charge of evaluating the ganglion cells function, and even more when the adaptation time to scotopic conditions is higher. This same progression of the wave electroretinographic values, has been already described in other biomodels of experimental glaucoma as well as in people affected by chronic open-angle glaucoma. The discoveries found in our study are a counterpart of what it is described in the current bibliography. Among the parameters whose values show affectation because of the sustained increase of intraocular pressure, the PhNR component gives evidence of a higher precocity in the detection of the effects produced by such pressure, in the retine response. The results obtained in our study show that, in the operated eyes, this component has a higher number of values out of the normal rank from the beginning of the electroretinographic study, and besides, there is no alteration in the control eye. Other components as the i-wave and the b-wave values in scotopic conditions, show values similar to the PhNR but not in such an early way. The PhNR is then presented as an important sign for allowing the study and evaluation of the effects produced by an increase of a sustained intraocular pressure in the electrophysiological function of the retine.
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Evaluación de la capacidad diagnóstica del software de polo posterior de Spectralis SD-OCT con la cuadrícula 8x8 inclinada a 7º y horizontalizada en ojos glaucomatosos
(Universidad de Murcia, 2023-10-20) Álvarez Sarrión, Aurora; García Medina, José Javier; Escuela Internacional de Doctorado
Introducción. La Spectralis SD-OCT contiene un software de polo posterior (PP) que proporciona el valor total del grosor de la retina en una cuadrícula 8x8 (con 64 cubos o celdas maculares), además, permite la cuantificación independiente de todas las capas de la retina en la mácula. Objetivo. Evaluación de la capacidad diagnóstica del software de PP de Spectralis SD-OCT, con la cuadrícula 8x8 inclinada a 7º y horizontalizada, para distinguir entre ojos sanos y ojos con glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA). Material y métodos. Se trata de un estudio observacional, trasversal, retrospectivo y descriptivo. Se han incluido un total de 299 ojos (136 de 81 sujetos sanos y 163 de 104 con GPAA). Las capas y agrupaciones de capas retinianas estudiadas han sido la mCFNR, mCCG, mCRI, mCRE, mCCGCPI, la retina macular completa, el complejo de células ganglionares maculares (mCFNR + mCCG + mCPI) y complejo formado por mCPE + mCNE de sujetos sanos y glaucomatosos. Los datos de análisis han sido obtenidos de cada ojo y en cada capa de los mapas de espesor de 64 celdas (8x8) del patrón de PP de la Spectralis SD-OCT alineado automáticamente con el eje disco-fóvea a 7º. Posteriormente, se ha realizado la horizontalización de todas las cuadrículas para cada ojo y se han vuelto a obtener del mismo modo los valores de espesor de las 64 celdas. La capacidad diagnóstica del espesor de cada una de las capas ha sido evaluada mediante el valor del área bajo la curva característica operativa del receptor (ABC) y representada en mapas de calor. El grosor de las celdas con valores del ABC ≥0,70 se combinó en cada inclinación obteniendo un índice global para cada una de las cuadrículas, inclinada a 7 grados y horizontalizada. Se estableció el punto de corte para clasificar a un paciente como sano o enfermo y se calcularon los índices de validez diagnóstica e intervalos de confianza al 95% en cada una de las capas. Las diferencias consideradas estadísticamente significativas son aquellas cuya p < 0.05. Resultados. Los patrones de los mapas de calor y los resultados de las comparaciones de los índices globales han presentado una capacidad diagnóstica de las segmentaciones estudiadas similar cuando se considera el cubo macular 8X8 inclinado a 7º u horizontalizado. La segmentación que ofrece mayor rentabilidad diagnóstica es la mCFNR con un ABC (IC 95%) de 0,796 (0,746 - 0,845), seguida respectivamente de mayor a menor por el complejo de células ganglionares maculares 0,785 (0,734 - 0,835), mCCG 0,784 (0,732 - 0,836), mCCGCPI 0,770 (0,717 – 0,824), mCRI 0,755 (0,701 - 0,809) y la retina macular en su conjunto 0,752 (0,698 - 0,806). Conclusiones. El cubo macular 8x8 del software de polo posterior en Spectralis SD-OCT ofrece una buena capacidad diagnóstica en diferentes capas y combinaciones de capas de la retina interna como método complementario a otras medidas para el diagnóstico del GPAA.
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Evaluation of the neuroprotective efficacy of the gramine derivative ITH12657 against NMDA-induced excitotoxicity in the rat retina
(Frontiers Media, 2024-02-13) Di Pierdomenico, Johnny; Gallego Ortega, Alejandro; Norte Muñoz, María; Vidal-Villegas, Beatriz; Bravo, Isaac; Boluda-Ruiz, María; Bernal-Garro, José Manuel; Fernández-Bueno, Iván; Pastor-Jimeno, Jose Carlos; Villegas Pérez, Maria Paz; Avilés Trigueros, Marcelino; Ríos, Cristobal de los; Vidal Sanz, Manuel; Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica; Facultad de Óptica y Optometría
Purpose: The aim of this study was to investigate, the neuroprotective effects of a new Gramine derivative named: ITH12657, in a model of retinal excitotoxicity induced by intravitreal injection of NMDA. Methods: Adult Sprague Dawley rats received an intravitreal injection of 100 mM NMDA in their left eye and were treated daily with subcutaneous injections of ITH12657 or vehicle. The best dose–response, therapeutic window study, and optimal treatment duration of ITH12657 were studied. Based on the best survival of Brn3a + RGCs obtained from the above-mentioned studies, the protective effects of ITH12657 were studied in vivo (retinal thickness and full-field Electroretinography), and ex vivo by quantifying the surviving population of Brn3a + RGCs, αRGCs and their subtypes α-ONsRGCs, α-ONtRGCs, and α-OFFRGCs. Results: Administration of 10 mg/kg ITH12657, starting 12 h before NMDA injection and dispensed for 3 days, resulted in the best significant protection of Brn3a + RGCs against NMDA-induced excitotoxicity. In vivo, ITH12657-treated rats showed significant preservation of retinal thickness and functional protection against NMDA-induced retinal excitotoxicity. Ex vivo results showed that ITH12657 afforded a significant protection against NMDA-induced excitotoxicity for the populations of Brn3a + RGC, αRGC, and αONs-RGC, but not for the population of αOFF-RGC, while the population of α-ONtRGC was fully resistant to NMDA-induced excitotoxicity. Conclusion: Subcutaneous administration of ITH12657 at 10 mg/kg, initiated 12 h before NMDA-induced retinal injury and continued for 3 days, resulted in the best protection of Brn3a + RGCs, αRGC, and αONs-RGC against excitotoxicity-induced RGC death. The population of αOFF-RGCs was extremely sensitive while α-ONtRGCs were fully resistant to NMDA-induced excitotoxicity.
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Melanopsin+RGCs are fully resistant to NMDA-induced excitotoxicity
(MDPI, 2019-06-20) Vidal-Villegas, Beatriz; Di Pierdomenico, Johnny; Miralles de Imperial-Ollero, Juan A.; Ortín-Martínez, Arturo; Nadal-Nicolás, Francisco Manuel; Bernal-Garro, José M.; Cuenca Navarro, Nicolás; Villegas Pérez, Maria Paz; Vidal Sanz, Manuel; Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica; Facultad de Óptica y Optometría
We studied short- and long-term effects of intravitreal injection of N-methyl-d-aspartate (NMDA) on melanopsin-containing (m+) and non-melanopsin-containing (Brn3a+) retinal ganglion cells (RGCs). In adult SD-rats, the left eye received a single intravitreal injection of 5µL of 100nM NMDA. At 3 and 15 months, retinal thickness was measured in vivo using Spectral Domain-Optical Coherence Tomography (SD-OCT). Ex vivo analyses were done at 3, 7, or 14 days or 15 months after damage. Whole-mounted retinas were immunolabelled for brain-specific homeobox/POU domain protein 3A (Brn3a) and melanopsin (m), the total number of Brn3a+RGCs and m+RGCs were quantified, and their topography represented. In control retinas, the mean total numbers of Brn3a+RGCs and m+RGCs were 78,903 ± 3572 and 2358 ± 144 (mean ± SD; n = 10), respectively. In the NMDA injected retinas, Brn3a+RGCs numbers diminished to 49%, 28%, 24%, and 19%, at 3, 7, 14 days, and 15 months, respectively. There was no further loss between 7 days and 15 months. The number of immunoidentified m+RGCs decreased significantly at 3 days, recovered between 3 and 7 days, and were back to normal thereafter. OCT measurements revealed a significant thinning of the left retinas at 3 and 15 months. Intravitreal injections of NMDA induced within a week a rapid loss of 72% of Brn3a+RGCs, a transient downregulation of melanopsin expression (but not m+RGC death), and a thinning of the inner retinal layers.
Open Access
Platelet-generated amyloid beta peptides in Alzheimer’s disease and glaucoma
(Universidad de Murcia. Departamento de Biología Celular e Histología, 2019) Inyushin, Mikhail; Zayas Santiago, Astrid; Rojas, Legier; Kucheryavykh, Yuri; Kucheryavykh, Lilia
Amyloid beta (Aβ) peptides have been implicated in both Alzheimer’s disease (AD) and glaucoma and have been shown to be the key etiological factor in these dangerous health complications. On the other hand, it is well known that Aβ peptide can be generated from its precursor protein and massively released from the blood to nearby tissue upon the activation of platelets due to their involvement in innate immunity and inflammation processes. Here we review evidence about the development of AD and glaucoma neuronal damage showing their dependence on platelet count and activation. The correlation between the effect on platelet count and the effectiveness of anti-AD and anti-glaucoma therapies suggest that platelets may be an important player in these diseases.
Open Access
Potential role of P2X7 receptor in neurodegenerative processes in a murine model of glaucoma
(Elsevier, 2019) Pérez de Lara, María J.; Avilés Trigueros, Marcelino; Guzmán-Aránguez, Ana; Valiente Soriano, Francisco Javier; de la Villa, Pedro; Vidal-Sanz, Manuel; Pintor, Jesús; Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica
Glaucoma is a common cause of visual impairment and blindness, characterized by retinal ganglion cell (RGC) death. The mechanisms that trigger the development of glaucoma remain unknown and have gained significant relevance in the study of this neurodegenerative disease. P2X7 purinergic receptors (P2X7R) could be involved in the regulation of the synaptic transmission and neuronal death in the retina through different pathways. The aim of this study was to characterize the molecular signals underlying glaucomatous retinal injury. The time-course of functional, morphological, and molecular changes in the glaucomatous retina of the DBA/2J mice were investigated. The expression and localization of P2X7R was analysed in relation with retinal markers. Caspase-3, JNK, and p38 were evaluated in control and glaucomatous mice by immunohistochemical and western-blot analysis. Furthermore, electroretinogram recordings (ERG) were performed to assess inner retina dysfunction. Glaucomatous mice exhibited changes in P2X7R expression as long as the pathology progressed. There was P2X7R overexpression in RGCs, the primary injured neurons, which correlated with the loss of function through ERG measurements. All analyzed MAPK and caspase-3 proteins were upregulated in the DBA/2J retinas suggesting a pro-apoptotic cell death. The increase in P2X7Rs presence may contribute, together with other factors, to the changes in retinal functionality and the concomitant death of RGCs. These findings provide evidence of possible intracellular pathways responsible for apoptosis regulation during glaucomatous degeneration.
Open Access
Respuesta de las neuronas retinianas a la lesión y su neuroprotección : caracterización de las células ganglionares alfa de la retina
(Universidad de Murcia, 2023-07-11) Gallego Ortega, Alejandro; Vidal Sanz, Manuel; Valiente Soriano, Francisco Javier; Villa Polo, Pedro de la; Escuela Internacional de Doctorado
Introducción: Las lesiones del sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos adultos causan, en la mayoría de los casos, daños irreparables y permanentes. El sistema visual y, en particular, la retina se utiliza a menudo como modelo para estudiar los procesos neurodegenerativos subyacentes a la fisiopatología del SNC, pero no siempre se dispone de las herramientas necesarias. Objetivos: Aquí proponemos una nueva herramienta para estudiar el flujo de calcio intracelular en las células bipolares de la retina (CB). También caracterizamos las células ganglionares retinianas alfa (CGRα) en la retina pigmentada de ratón y estudiamos la supervivencia de estas células en un modelo de sección intraorbitaria del nervio óptico (SNO) y excitotoxicidad inducida por la administración intravítrea de ácido N-metil-D-aspártico (NMDA). En estos modelos, evaluamos los efectos neuroprotectores de la administración sistémica de las moléculas 7,8-Dihidroxiflavona (DHF), que es un potente agonista del receptor TrkB, ITH12657, que es un bloqueante selectivo del canal calcio dependiente de voltaje, e ITH15004, que es un antagonista selectivo del receptor P2X7. Además, caracterizamos un modelo de hipertensión ocular aguda (HTOA) en la rata albina adulta y el ratón pigmentado. Analizamos las vías de muerte celular implicadas tras la HTOA y los efectos protectores de las moléculas DHF, ITH12657 e ITH15004. Materiales y métodos: Para estudiar el flujo de Ca2+ intracelular inyectamos el virus AAV2.Ple265.GCaMP6f.WPRE y analizamos los cambios que se producían en los terminales axonales de las células bipolares tras la iluminación in vivo con microscopía de 2 fotones. Para estudiar los efectos en la retina de SNO, NMDA o HTOA y su protección utilizamos técnicas in vivo como el electrorretinograma de campo completo (ERG) y la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) y técnicas ex vivo como la inmunohistoquímica y la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Resultados: i) el AAV2.Ple265. GCaMP6f es una buena herramienta para estudiar el flujo de calcio en los terminales CB, y se pudo observar que los microdominios de un mismo terminal no responden igual al mismo estímulo luminoso; ii) las CGRα representan el 5,23% de la población de CGR en la retina de ratones pigmentados. Las CGRα que responden a la luz de forma sostenida son más frecuentes en el cuadrante temporal superior, mientras que las que responden de forma transitoria pueblan principalmente la parte media-periférica de la retina; iii) la HTOA causa daños permanentes y severos tempranamente en la retina interna y posteriormente en la retina externa. Cursa con 6 tipos de muerte celular y la combinación de DHF, ITH12657 e ITH15004 previene la degeneración retiniana; iv) la excitotoxicidad NMDA provoca una degeneración desigual en los subtipos CGRα. Mientras que las CGRα-OFF casi desaparecen tras la excitotoxicidad NMDA, las CGRα-ONt no se ven afectadas, y la población de CGRα-ONs se reduce en un 73%. El ITH12657 rescata las CGRα-ONs hasta 21 días y la DHF hasta 7 días; v) la SNO resulta en una desaparición casi completa de la población CGRα-OFF y en la pérdida del 75% de las CGRα-ONs. La DHF rescata el 66% de las CGRα-ON hasta los 14 días y mejora la funcionalidad de las CGR hasta los 21 días. Conclusiones: La información visual que es percibida por una única célula bipolar de cono se clasifica en sus terminales axonales. Las CGRα representan el 5,2% de la población total de CGR de ratones pigmentados, y presentan diferente resiliencia dependiendo del subtipo y del tipo de lesión. Las moléculas DHF, ITH12657 e ITH15004 muestran efectos beneficiosos en los modelos de lesión retiniana de SNO, HTOA o NMDA y podrían utilizarse en el futuro para tratar el glaucoma.
Open Access
Shared and differential retinal responses against optic nerve injury and ocular hypertension
(Frontiers Media SA., 2017-04-26) Vidal Sanz, Manuel; Galindo Romero, Caridad; Valiente-Soriano, Francisco J.; Nadal-Nicolás, Francisco Manuel; Ortín-Martínez, Arturo; Rovere, Giuseppe; Salinas Navarro, Manuel Ángel; Lucas Ruiz, Fernando; Sánchez-Migallón, María C.; Sobrado Calvo, Paloma; Avilés Trigueros, Marcelino; Villegas Pérez, Maria Paz; Agudo Barriuso, Marta; Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica; Facultad de Medicina
Glaucoma, one of the leading causes of blindness worldwide, affects primarily retinal ganglion cells (RGCs) and their axons. The pathophysiology of glaucoma is not fully understood, but it is currently believed that damage to RGC axons at the optic nerve head plays a major role. Rodent models to study glaucoma include those that mimic either ocular hypertension or optic nerve injury. Here we review the anatomical loss of the general population of RGCs (that express Brn3a; Brn3a+RGCs) and of the intrinsically photosensitive RGCs (that express melanopsin; m+RGCs) after chronic (LP-OHT) or acute (A-OHT) ocular hypertension and after complete intraorbital optic nerve transection (ONT) or crush (ONC). Our studies show that all of these insults trigger RGC death. Compared to Brn3a+RGCs, m+RGCs are more resilient to ONT, ONC, and A-OHT but not to LP-OHT. There are differences in the course of RGC loss both between these RGC types and among injuries. An important difference between the damage caused by ocular hypertension or optic nerve injury appears in the outer retina. Both axotomy and LP-OHT induce selective loss of RGCs but LP-OHT also induces a protracted loss of cone photoreceptors. This review outlines our current understanding of the anatomical changes occurring in rodent models of glaucoma and discusses the advantages of each one and their translational value.