Publication: Performance validation of quantitative polymerase chain
reaction assays for measuring swine proinflammatory
and immunomodulatory cytokine gene expression
Authors
García-Nicolás, Obdulio ; Juan José Quereda ; Jaime Gómez-Laguna ; Irene Magdalena Rodríguez-Gómez ; Librado Carrasco ; Guillermo Ramis ; Francisco José Pallarés
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Publisher
Universidad de Murcia
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DOI
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info:eu-repo/semantics/article
Description
Abstract
ABSTRACT: RT-qPCR is the method of choice for the accurate detection of low quantities of mRNA due to its higher
sensitivity and specificity. Most of the previously published reports about swine cytokine gene expression lack
information regarding the validation of the technique, which impedes the potential implementation by new
users. This study was focussed on the technical validation of already published RT-qPCR assays for swine
proinflammatory (IFN-α, IFN-γ, IL-12p35, IL-12p40 and TNF-α) and immunomodulatory (IL-10 and TGF-β) cytokines, and on defining the best qPCR amplification conditions for simultaneous amplification of the selected
cytokines from several porcine tissue samples. The tested RT-qPCR assays here are sensitive (Efficient close
to 2, Correlation coefficient higher than 0.95 and a Limit Of Detection below 305-100 mRNA copies), robust
(Coefficint of Variation and Factor of Discrimination means were lower than 5 and 3%, respectively) and highly
useful for the study of immune swine responses.
RESUMEN: La alta sensibilidad y especificidad de la RT-qPCR le hacen el método de elección para la detección precisa de bajas cantidades de ARNm. La mayoría de artículos previamente publicados sobre expresión de citocinas porcinas carecen de información acerca de la validación de la técnica empleada, lo que dificulta su aplicación por nuevos usuarios. El presente estudio se centra en la validación de técnicas de RT-qPCR previamente publicadas para citocinas proinflamatorias (IFN-α, IFN-γ, IL-12p35, IL-12p40 y TNF-α) e inmunomoduladoras (IL-10 y TGF-β). Además se definen las mejores condiciones de amplificación simultánea para qPCR de las citadas citocinas en tejidos porcinos. Los ensayos de RT-qPCR evaluados son sensibles (Eficiencia cercana a 2, coeficiente de correlación mayor de 0.95 y un límite de detección entre 305-100 copias de ARNm), son robustas (coeficiente de variación y factor de discriminación menores de 5 y 3%, respectivamente), y don altamente útiles para el estudio de la respuesta inmune en el cerdo.
RESUMEN: La alta sensibilidad y especificidad de la RT-qPCR le hacen el método de elección para la detección precisa de bajas cantidades de ARNm. La mayoría de artículos previamente publicados sobre expresión de citocinas porcinas carecen de información acerca de la validación de la técnica empleada, lo que dificulta su aplicación por nuevos usuarios. El presente estudio se centra en la validación de técnicas de RT-qPCR previamente publicadas para citocinas proinflamatorias (IFN-α, IFN-γ, IL-12p35, IL-12p40 y TNF-α) e inmunomoduladoras (IL-10 y TGF-β). Además se definen las mejores condiciones de amplificación simultánea para qPCR de las citadas citocinas en tejidos porcinos. Los ensayos de RT-qPCR evaluados son sensibles (Eficiencia cercana a 2, coeficiente de correlación mayor de 0.95 y un límite de detección entre 305-100 copias de ARNm), son robustas (coeficiente de variación y factor de discriminación menores de 5 y 3%, respectivamente), y don altamente útiles para el estudio de la respuesta inmune en el cerdo.
Citation
Anales de Veterinaria de Murcia, vol. 31, (2015)
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