García-Galán Pérez, Ana

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Anatomía y Anatomía Patológica Comparadas

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The Addition of Lactobacillus spp., Enrofloxacin or Doxycycline Negatively Affects the Viability of Mycoplasma bovis in Diluted Bovine Semen
(MDPI, 2020-05-13) Gómez-Martín, Ángel; Bataller, Esther; Gomis Almendro, Jesús; Sánchez López, Antonio; Gadea Mateos, Joaquín; Vieira, Luis Alberto; García Roselló, Empar; de la Fe Rodríguez, Christian; García-Galán Pérez, Ana; Sanidad Animal
Mycoplasma bovis is an important etiologic agent of bovine mycoplasmosis in cattle. Different transmission routes have been described, including those related to reproduction. The presence of mycoplasma in semen has led to its appearance in infection-free areas through artificial insemination (AI). Semen was recently reported to be the initial source of two M. bovis mastitis outbreaks in two closed dairy herds in Finland. This questions the effectiveness of the antimicrobials currently used in semen extenders to control the pathogens in contaminated semen. They should be re-evaluated, or alternative measures to antimicrobials should be tested to obtain M. bovis-free semen. This in vitro study aimed to assess different strategies to reduce the risk of transmission of M. bovis through AI technologies. The viability of M. bovis (PG45, NCTC 10131) in bull semen diluted (DS) in a Tris-citrate-fructose solution was tested, after the addition of enrofloxacin, doxycycline or a Lactobacillus spp.-based probiotic. The data show the susceptibility of the pathogen to the addition of 0.125 μg/mL of enrofloxacin or 0.0625 μg/mL of doxycycline and to the addition of the probiotic at a concentration of 3.24 × 106 colony forming units (CFU)/mL or 3.24 × 108 CFU/mL in DS. The Tris-citrate-fructose medium negatively affected the viability of M. bovis, although this effect was lower than that observed after the addition of the probiotic and antimicrobials (p < 0.05). Our results may support new strategies for reducing the risk of M. bovis transmission through AI.
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Mycoplasma bovis infection in Spanish cattle herds and evaluation of new control strategies
(Universidad de Murcia, 2022-11-25) García-Galán Pérez, Ana; Fé Rodríguez, David Christian de la; Gómez Martín, Ángel; Xavier Nouvel, Laurent; Laurent
El objetivo general de esta tesis por compendio es contribuir a una mejor comprensión de la infección por Mycoplasma bovis y de la biología del patógeno, así como al establecimiento de nuevas medidas de control. Los objetivos específicos y la metodología seguida fueron: 1) Evaluar la presencia y circulación de M. bovis en rebaños bovinos españoles, empleando una gran colección de muestras obtenidas de ganado bovino de carne y de leche, y de distintas fuentes; 2) Investigar la circulación de diferentes subtipos mediante secuenciación unilocus del gen polC, estudiando diferencias de susceptibilidad antimicrobiana entre los subtipos y la presencia de mutaciones genéticas que confieren resistencia; 3) Evaluar el papel de M. bovis en la enfermedad respiratoria clínica sin respuesta al tratamiento antimicrobiano en terneros de cebo en España, mediante bacteriología, histopatología e inmunohistoquímica, y determinar los valores de concentración mínima inhibitoria de los aislamientos obtenidos al set de antimicrobianos empleados para el tratamiento in vivo; 4) Investigar si la transferencia cromosómica de los micoplasmas puede ocurrir en el campo, analizando la presencia de genomas en mosaico en aislamientos de M. bovis mediante secuenciación del genoma completo; 5) Evaluar la viabilidad de M. bovis en semen diluido tras la adición de un antimicrobiano (enrofloxacino o doxiciclina), o un probiótico a base de Lactobacillus spp. a diferentes concentraciones en condiciones in vitro; 6) Evaluar la viabilidad de M. bovis en moco cervical tras la adición de un probiótico a base de Lactobacillus spp. a diferentes concentraciones en condiciones in vitro. Los resultados obtenidos permiten concluir que: 1) M. bovis se encuentra ampliamente distribuido en los rebaños españoles de bovino de carne y está implicado en casos de mastitis en los rebaños de leche; 2) Los aislamientos españoles de M. bovis se dividen en dos grupos, el ST2 y el ST3, siendo ambos resistentes a los macrólidos, lincosamidas y tetraciclinas. La mayoría de los aislamientos del ST3 son resistentes a las fluoroquinolonas, situación que ilustra la notable capacidad del ST3 de acumular mutaciones en las regiones determinantes de resistencia a quinolonas y la presión selectiva impuesta por el uso indiscriminado de estos antimicrobianos. La valnemulina ha mostrado ser eficaz frente a ambos subtipos in vitro; 3) M. bovis juega un papel importante en casos clínicos de enfermedad respiratoria en terneros de cebo en España. La bronconeumonía caseonecrótica es el patrón morfológico más frecuentemente observado en los animales infectados con M. bovis y los patrones indicativos de otras especies bacterianas y virus pueden ser detectados simultáneamente; 4) Los aislamientos de M. bovis recuperados de animales con enfermedad respiratoria clínica son resistentes in vitro a la mayoría de los antimicrobianos empleados para el tratamiento in vivo; 5) La coexistencia de linajes de M. bovis a nivel de rebaño e incluso a nivel de animal permite eventos de transferencia genética horizontal como la transferencia cromosómica de los micoplasmas. Estos eventos contribuyen a la amplia diversidad del genoma y podrían tener un impacto negativo en el diagnóstico y control de la enfermedad; 6) En las condiciones analizadas, la adición de Lactobacillus spp., enrofloxacino o doxiciclina afecta negativamente a la viabilidad de M. bovis en semen diluido, lo que podría ser de utilidad para el tratamiento de las dosis seminales y reducir el riesgo de transmisión de M. bovis durante la inseminación artificial. La dilución con el diluyente seminal Tris-citrato-fructosa también afecta negativamente a la viabilidad del agente, aunque en menor medida que la adición del probiótico y antimicrobianos; 7) En las condiciones analizadas, la adición de Lactobacillus spp. afecta negativamente a la viabilidad de M. bovis en moco cervical, lo que podría ser de utilidad para controlar la proliferación de M. bovis el tracto cérvico-vaginal de las vacas.
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Genome Mosaicism in Field Strains of Mycoplasma bovis as Footprints of In-Host Horizontal Chromosomal Transfer
(AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, 2022-01-11) Baranowski, Eric; Hygonenq, Marie-Claude; Walch, Matilda; Croville, Guillaume; Citti, Christine; Fé Rodríguez, Christian de la; Nouvel, Laurent Xavier; García-Galán Pérez, Ana; Sanidad Animal
Horizontal gene transfer was long thought to be marginal in Mollicutes, but the capacity of some of these wall-less bacteria to exchange large chromosomal regions has been recently documented. Mycoplasma chromosomal transfer (MCT) is an unconventional mechanism that relies on the presence of a functional integrative conjugative element (ICE) in at least one partner and involves the horizontal acquisition of small and large chromosomal fragments from any part of the donor genome, which results in progenies composed of an infinite variety of mosaic genomes. The present study focuses on Mycoplasma bovis, an important pathogen of cattle responsible for major economic losses worldwide. By combining phylogenetic tree reconstructions and detailed comparative genome analyses of 36 isolates collected in Spain (2016 to 2018), we confirmed the mosaic nature of 16 field isolates and mapped chromosomal transfers exchanged between their hypothetical ancestors. This study provides evidence that MCT can take place in the field, most likely during coinfections by multiple strains. Because mobile genetic elements (MGEs) are classical contributors of genome plasticity, the presence of phages, insertion sequences (ISs), and ICEs was also investigated. Data revealed that these elements are widespread within the M. bovis species and evidenced classical horizontal transfer of phages and ICEs in addition to MCT. These events contribute to wide-genome diversity and reorganization within this species and may have a tremendous impact on diagnostic and disease control.
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Isolation of Mycoplasma auris from milk of goats with clinical mastitis
(Elsevier, 2020-03-07) García-Galán Pérez, Ana; García Romero, Edgar; Sánchez López, Antonio; Corrales Romero, Juan Carlos; Contreras de Vera, Antonio; Fé Rodríguez, David Christian de la; Sanidad Animal; Facultades de la UMU::Facultad de Veterinaria
The unexpected presence of Mycoplasma auris was evidenced in mastitis samples collected from a dairy goat herd under surveillance programmes of contagious agalactia (CA), a serious disease affecting Mediterranean small ruminant herds. Thus, control programs based on permanent analysis of milk from bulk tank and clinical mastitis, as well as ear swabs, are currently conducted in affected areas. In order to analyze the presence of CAcausing species, three, 11 and 18 of these samples were respectively collected from the same goat herd. Mycoplasmas were isolated in four milk samples from clinical mastitis and two ear swabs samples and no other pathogen was detected. The presence of CA-causing mycoplasmas was discarded by PCR. However, M. auris was identified in all the positive samples after the amplification and posterior PCR product sequencing of a partial fragment of their 16S-ribosomal ARN gene. As far as we know, these are the first isolations of M. auris from milk of goats with clinical mastitis.
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Estudio cropológico de parasitosis en gatos del área periurbana de la ciudad de Murcia y sus implicaciones zoonósicas
(2017) Muñoz, C; Ortuño, M; Ortiz, J; Risueño, J; Berriatua Fernández de Larrea, Eduardo; Bernal, A; García-Galán Pérez, Ana; Goyena Salgado, Elena
Se realizó un estudio coprológico para estimar la prevalencia y abundancia de formas parasitarias en heces de 61 gatos de la zona periurbana de Murcia (España), mayoritariamente callejeros. Tras la exploración clínica de los animales, se recogieron muestras de heces del recto que se examinaron macroscópicamente para detectar proglótidos de cestodos y nematodos adultos. Seguidamente, se analizaron con la técnica de Bailinger, examinándose a continuación la muestra mediante tres métodos: estudio del sedimento, examen del mismo con una solución de Sheather (d=1,27) y con una solución de sulfato de zinc (d = 1,) para la detección microscópica de parásitos, de forma cualitativa y cuantitativa (con recuento en cámara de McMaster). La prevalencia (IC95%) de gatos parasitados fue 59% (47-71%) y varió según la especie parasitaria, siendo 18% (8-28%) de proglótidos de Dipylidium caninum, 34% (23-46%) de huevos de Toxocara cati, 20% (10-30%) de larvas de Aelurostrongylus abstrusus, 15% (6-24%) de huevos de Ancylostomatidae, 13% (5-22%) de huevos de Taenia spp., 8% (1-15%) de huevos de Dipylidium caninum y ooquistes de Isospora rivolta y 2% (0-5%) de huevos de Trichuris spp.. La prevalencia de T. cati fue superior a la de otros parásitos excepto A. abstrusus y Ancylostomatidae, y la prevalencia de Trichuris spp. fue inferior a la de estos dos últimos y de Taenia spp. (p<0.05). Los recuentos de parásitos fueron bajos por lo general, siendo los más elevados los de T. cati (6500 huevos/g de heces) seguidos de Ancylostomatidae (2450 h/g) e I. rivolta (1400 ooquistes/g). No se observaron diferencias significativas en la prevalencia y en la abundancia de parásitos entre las técnicas microscópicas. Tampoco se asoció la parasitosis a variables demográficas ni a la presencia de signos clínicos, excepto que la prevalencia de Taenia spp. fue mayor en hembras gestantes que en otros gatos (p>0.05). El estudio demuestra una elevada prevalencia de parasitos y justifica la necesidad de mejorar su control en la población estudiada. Destaca la ausencia en las heces de los protozoos zoonósicos Giardia duodenalis, Cryptosporidium parvum y Toxoplasma gondii que podría estar relacionado con la sensibilidad limitada de las técnicas coprológicas clásicas empleadas y también al hecho de que estos parásitos tienen un periodo de patencia limitado.
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The addition of Lactobacillus spp. negatively affects Mycoplasma bovis viability in bovine cervical mucus
(BMC, 2020-07-20) de la Fe Rodríguez, Christian; Gomis Almendro, Jesús; Bataller, Esther; Sánchez López, Antonio; Quereda Torres, Juan José; García Roselló, Empar; Gómez Martín, Ángel; García-Galán Pérez, Ana; Sanidad Animal
Background Mycoplasma bovis is an important pathogen for the cattle industry worldwide causing significant economic losses. Several transmission routes, including those related to reproduction, have been described. Indeed, the pathogen can colonize the female reproductive tract after artificial insemination (AI) with contaminated semen. Lactobacillus spp.-based probiotics have been used for vaginal dysbiosis treatment in women and cows although their role in controlling cervico-vaginal infections due to M. bovis is unknown. The objective of the present work is to assess the viability of M. bovis (PG45, NCTC 10131) in experimentally contaminated cervical mucus after the addition of Lactobacillus spp. at different concentrations as a competing agent and pH acidifier. Results The addition of probiotic at a concentration higher than 108 colony forming units (CFU/mL had a detrimental effect (P < 0.05) on mycoplasma viability in cervical mucus. This coincided with a significant LAB growth and an important decrease in pH from 8.4 to 5.6 (P < 0.05). However, after the addition of less concentrated probiotic, M. bovis survival was not affected and there was no significant LAB growth despite the drop of pH from 8.4 to 6.73 (P < 0.05). Conclusion The addition of concentrations higher than 108 CFU/mL of Lactobacillus spp. negatively affects M. bovis viability in bovine cervical mucus under in vitro conditions. Although the effect observed on the pathogen viability seems to be related to the pH decrease after LAB proliferation in cervical mucus, further studies are necessary to elucidate if other factors are implicated. Nevertheless, the administration of Lactobacillus spp.-based probiotics might be used in the future to control M. bovis proliferation in the cervico-vaginal tract of cows.
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Mycoplasma bovis in Spanish Cattle Herds: Two Groups of Multiresistant Isolates Predominate, with One Remaining Susceptible to Fluoroquinolones
(MDPI, 2020-07-07) Nouvel, Laurent-Xavier; Baranowski, Eric; Gómez-Martín, Ángel; Sánchez López, Antonio; Citti, Christine; de la Fe Rodríguez, Christian; García-Galán Pérez, Ana; Sanidad Animal
Mycoplasma bovis is an important bovine pathogen causing pneumonia, mastitis, and arthritis and is responsible for major economic losses worldwide. In the absence of an efficient vaccine, control of M. bovis infections mainly relies on antimicrobial treatments, but resistance is reported in an increasing number of countries. To address the situation in Spain, M. bovis was searched in 436 samples collected from beef and dairy cattle (2016–2019) and 28% were positive. Single-locus typing using polC sequences further revealed that two subtypes ST2 and ST3, circulate in Spain both in beef and dairy cattle, regardless of the regions or the clinical signs. Monitoring of ST2 and ST3 isolates minimum inhibitory concentration (MIC) to a panel of antimicrobials revealed one major difference when using fluoroquinolones (FQL): ST2 is more susceptible than ST3. Accordingly, whole-genome sequencing (WGS) further identified mutations in the gyrA and parC regions, encoding quinolone resistance-determining regions (QRDR) only in ST3 isolates. This situation shows the capacity of ST3 to accumulate mutations in QRDR and might reflect the selective pressure imposed by the extensive use of these antimicrobials. MIC values and detection of mutations by WGS also showed that most Spanish isolates are resistant to macrolides, lincosamides, and tetracyclines. Valnemulin was the only one effective, at least in vitro, against both STs.
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Prevalencia de leishmaniosis canina en perros abandonados del ámbito periurbano de Murcia: evaluación de diferentes técnicas de diagnóstico
(2017) Ortuño, M; Risueño, J; Muñoz, C; Bernal, A; García-Galán Pérez, Ana; Berriatua Fernández de Larrea, Eduardo; Ortiz, J; García-Galán Pérez, Ana; Goyena Salgado, Elena
El presente trabajo investiga la prevalencia y la validez de técnicas de diagnóstico de la Leishmaniosis canina causada por el protozoo Leishmania infantum, en 43 perros abandonados del ámbito periurbano de la Región de Murcia. Esta infección, transmitida por artrópodos flebotominos, cursa en muchos animales de forma asintomática, en los que predomina una respuesta inmunológica celular sin producción de anticuerpos frente al parásito. Los perros se examinaron para detectar síntomas compatibles con la enfermedad, y se tomaron muestras de sangre y tejido linfoide (bazo, ganglio linfático y médula ósea) para analizar la presencia del parásito por microscopía óptica y cultivo in vitro, así como la detección de ADN parasitario mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de anticuerpos anti-Leishmania en suero mediante la técnica “Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay” (ELISA). El porcentaje de perros con síntomas fue del 16%, y el de resultados positivos a las distintas técnicas diagnósticas fue 37% en la microscopía óptica, 64% a PCR, 25% al cultivo y 40% al ELISA. El porcentaje de muestras positivas a la PCR es similar al descrito en perros asintomáticos de otras zonas endémicas, mientras que el de muestras positivas por microscopía óptica y ELISA fueron superiores al de otras zonas endémicas, incluido un estudio anterior en Murcia. Esto podría deberse a la presencia en este estudio de perros con síntomas y al elevado tiempo dedicado a la observación microscópica de preparaciones de hasta tres tejidos por animal, lo que aumentaría la sensibilidad del diagnóstico. Los resultados de este trabajo corroboran la elevada prevalencia de la Leishmaniosis en el ámbito periurbano de la Región de Murcia y la utilidad de la microscopía en el diagnóstico de la infección como una técnica que, si bien requiere experiencia del observador, es sencilla y económica.
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PK/PD analysis of marbofloxacin by Monte Carlo Simulation against Mycoplasma agalactie in plasma and milk of lactating goats after IV, SC and SC-long acting formulations administration
(MDPI, 2021-04-12) García Romero, Edgar; Cárceles Rodríguez, Carlos; García-Galán Pérez, Ana; Cárceles-García, Carlos; Fernández, Rocío; Muñoz, Cristina; Fé Rodríguez, David Christian de la; Fernández Varón, Emilio; Serrano Rodríguez, Juan Manuel; Farmacología; Facultad de Veterinaria
Contagious agalactia is a mycoplasmosis affecting small ruminants that have become an important issue in many countries. However, PK/PD studies of antibiotics to treat this problem in lactating goats affected by Mycoplasma (M.) agalactiae, the main CA-causing mycoplasma are almost non-existent. The aims of this study were to evaluate the plasma and milk disposition of marbofloxacin in lactating goats after intravenous (IV), subcutaneous (SC) and subcutaneous poloxamer P407 formulations with and without carboxy-methylcellulose (SC-P407-CMC and SC-P407) administration. Marbofloxacin concentrations were analysed by the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method. Minimum inhibitory concentrations (MIC) of M. agalactiae field isolates from mastitic goat’s milk were used to calculate surrogate markers of efficacy. Terminal half-lives of marbofloxacin after IV, SC, SC-P407 and SC-P407-CMC administration were 7.12, 6.57, 13.92 and 12.19 h in plasma, and the half-lives of elimination of marbofloxacin in milk were 7.22, 7.16, 9.30 and 7.74 h after IV, SC, SC-P407 and SC-P407-CMC administration, respectively. Marbofloxacin penetration from the blood into the milk was extensive, with Area Under the Curve (AUCmilk/AUCplasma) ratios ranged 1.04–1.23, and maximum concentrations (Cmax-milk/Cmax-plasma) ratios ranged 0.72–1.20. The PK/PD surrogate markers of efficacy fAUC24/MIC and the Monte Carlo simulation show that marbofloxacin ratio (fAUC24/MIC > 125) using a 90% of target attainment rate (TAR) need a dose regimen between 8.4 mg/kg (SC) and 11.57 mg/kg (P407CMC) and should be adequate to treat contagious agalactia in lactating goats.