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    Biodisponibilidad in vitro de residuos de fungicidas en vinos : influencia de su presencia en la capacidad antioxidante y biodisponibilidad de compuestos fenólicos
    (2016-05-31) Martínez Orenes, Gracia; Oliva Ortiz, José; Cámara Botía, Miguel Ángel; Facultad de Química
    Se ha estudiado la influencia de los residuos de fungicidas (metrafenona, mezcla boscalid+kresoxim-metil) aplicados en campo bajo condiciones de buenas y críticas prácticas agrícolas (BPA y CPA) y añadidos en bodega antes de la vinificación (ciafozamida, fenhexamida y mepanipirim), en la actividad antioxidante, compuestos fenólicos y su biodisponibilidad en vinos Tempranillo y Graciano (DO Rioja), durante las vendimias 2012, 2013 y 2014. En primer lugar se ha validado la metodología analítica para la determinación de los fungicidas en uva y vino, mediante extracción multirresiduos QuEChERS con acetonitrilo y análisis por HPLC-MS/MS (triple cuadrupolo). Alcanzando un límite de cuantificación de 0,01 ppm, una linealidad de respuesta (R2 >0,998) y exactitud (70-110%) y precisión con SD< 20%. En los vinos procedentes de uvas tratadas en campo bajo BPA no se superan los LMR establecidos en uva. En los vinos Tempranillo procedentes de tratamientos CPA, kresoxim-metil y metrafenona superan ligeramente el LMR (1,48 y 0,84 frente a 1 y 0,5 ppm, respectivamente). En los vinos fortificados en bodega con fenhexamida, mepanipirim y ciazofamida no se superan los LMR. La presencia de residuos de fungicidas en los vinos Tempranillo no influye significativamente en su actividad antioxidante. En el caso de Graciano, boscalid+kresoxim-metil y metrafenona, presentan diferencias significativas en su capacidad antioxidante. La presencia de residuos de boscalid+kresoxim-metil, fenhexamida y ciazofamida disminuyen los polifenoles totales (índice Folin-Ciocalteu) en Tempranillo. Mientras que metrafenona lo incrementa ligeramente en Graciano. La fracción fenólica más destacada en Tempranillo y Graciano es la de antocianos (70,45 y 77,50 % respectivamente) seguidos de los derivados hidroxicinámicos (18,31 y 13,64 %) y flavonoles (14,62 y 9,95 %). Los estilbenos en vinos Graciano presentan porcentajes ligeramente superiores que en Tempranillo (6,34 frente al 4,98%). La biodisponibilidad in vitro de los fungicidas en vino Graciano presenta un efecto matriz positivo respecto a Tempranillo. Los porcentajes de diálisis oscilan entre 6,1% para kresoxim-metil en Tempranillo, hasta 36,6% para boscalid en Graciano. Mepanipirim en Tempranillo y boscalid en Graciano presentan la mayor biodisponibilidad. Se comprueba que la clarificación tiene un ligero efecto positivo en su biodisponibilidad. En los vinos procedentes de uvas tratadas bajo CPA, los porcentajes de dialización de boscalid y kresoxim-metil se sitúan entre 21-31%, mientras que metrafenona no presenta dialización. En el caso de ciazofamida añadida al mosto no se produce dialización. Se ha constatado que la presencia de residuos de plaguicidas afecta a la biodisponibilidad tanto de la fracción fenólica como de la actividad antioxidante; no encontrando claras diferencias en la dialización de la fracción fenólica para los dos vinos. Los estilbenos son los compuestos fenólicos que presentan mayor porcentaje de dialización (50%). El contenido en polifenoles totales, después del proceso de digestión in vitro del vino, descendió una media del 10% respecto a su contenido inicial en Tempranillo tratado en campo y algo más de un 18% en el caso de ciazofamida añadida antes de la vinificación. Análogamente ocurre en el caso de Graciano, excepto en los tratados con la mezcla boscalid y kresoxim-metil en los que aumenta la biodisponibilidad de los polifenoles hasta un 25%. La presencia de residuos de los fungicidas estudiados afecta la biodisponibilidad de la actividad antioxidante de vinos Tempranillo; lo que no ocurre en Graciano. Por último, se ha constatado que para todos los plaguicidas estudiados la biodisponibilidad in vitro, en general, no supera el 37 % dializado respecto la concentración inicialmente presente en el vino, lo que indica un claro margen de seguridad desde el punto de vista toxicológico. ABSTRACT This paper studies the influence of fungicide residues (metrafenone, boscalid+kresoxim-methyl mix) applied in the field under good agricultural practice conditions (GAP and CAP) and those added in the winery prior to vinification (cyazofamid, fenhexamid and mepanipyrim) on antioxidant activity, phenolic compounds and their bioavailability in wines made from Tempranillo and Graciano grapes (D.O. Ca. Rioja), during the wine harvests of 2012, 2013 and 2014. First the analytical methodology was validated for the determination of fungicides in grape and wine using the QuEChERS multiresidue extraction method with acetonitrile and HPLC-MS/MS (triple quadrupole) analysis up to a maximum quantification of 0.01 ppm, a response linearity (R2 >0,998) and an accuracy (70-110%) and precision with SD< 20%. In the wines made from grapes treated in the field under GAP, the LMR established for grapes were not surpassed. In the Tempranillo varieties under CPA treatments, kresoxim-metyl and metrafenone slightly exceeded the el LMR (1.48 and 0.84 versus 1 and 0.5 ppm, respectively). In the wines fortified in the winery with fenhexamid, mepanipyrim and cyazofamid, the LMR were not exceeded. The presence of fungicide residues in the Tempranillo wines had no significant effect on their antioxidant activity. In the Graciano wines, boscalid+kresoxim-methyl and metrafenone presented significant differences in their antioxidant capacity. Residues of boscalid+kresoxim-methyl, fenhexamid and cyazofamid reduce the total polyphenols (Folin-Ciocalteu index) in Tempranillo. In contrast, metrafenone slightly increases it in Graciano. The most notable phenolic fraction in Tempranillo and Graciano is the antocianos (70.45 and 77.50 % respectively), followed by the hidroxicinnamic derivatives (18.31 and 13.64 %) and flavonols (14.62 and 9.95 %). The stilbenes in Graciano wines show slightly higher percentages than in Tempranillo (6.34 versus 4.98%). The in vitro bioavailability of the fungicides in Graciano wine shows a positive matrix effect with respect to Tempranillo. Dialysis percentages range from 6.1% for kresoxim-metil in Tempranillo to 36.6% for boscalid in Graciano. Mepanipyrim in Tempranillo and boscalid in Graciano present the greatest bioavailability. It is confirmed that the clarification has a slight positive effect on bioavailability. In wines made from grapes treated under CPA, the dialyzation percentages of boscalid and kresoxim-methyl stood between 21 and 31%, while metrafenone did not present dialyzation. No dialyzation occurred for cyazofamid added to the must. It has been shown that fungicide residues affect the bioavailability of both the phenolic fraction and the antioxidant activity, but no clear differences were found in the dialyzation of the phenolic fraction for either wine. The stilbenes were the phenolic compounds that showed the highest percentage of dialyzation (50%). The total polyphenol content after the in vitro digestion of wine fell on average by 10% with respect to the initial content in Tempranillo treated in the field and by more than 18% in the case of cyazofamid added prior to vinification. The results were similar for Graciano, except in the treatments with the boscalid and kresoxim-methyl mix, where the bioavailability of the polyphenols increased by up to 25%. The presence of the fungicides studied affects the bioavailability of the antioxidant activity of the Tempranillo wines, but not that of the Graciano ones. Finally, it has been shown that, in general, for all the pesticides studied the in vitro bioavailability does not exceed 37% dialyzation with respect to the initial concentration present in the wine, which indicates a clear safety margin in toxicological terms.
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    Caracterización de la producción de resveratrol y análisis de proteínas en cultivos celulares de Vitis vinífera cv Monastrell
    (2012-11-02) Belchí Navarro, Sarai; Pedreño García, María Ángeles; Pedreño García, María Ángeles; Departamento de Biología Vegetal
    En esta memoria de investigación se han utilizado cultivos celulares de Vitis vinifera cv Monastrell para la producción de trans-resveratrol. En este sentido se ha realizado la caracterización del crecimiento de suspensiones celulares de Monastrell en diferentes medios minerales y concentraciones de sacarosa. Asimismo se caracterizó la producción extracelular de trans-resveratrol mediante la utilización de distintos elicitores tales como ciclodextrinas de distinta naturaleza, jasmonato de metilo, luz UV, fosetil de aluminio, ácido salicílico y etefón. Asimismo, se realizó el estudio de la implicación del calcio, del peróxido de hidrógeno, el óxido nítrico así como los eventos de fosforilación y desfosforilación de proteínas en los fenómenos de señalización desencadenados por la elicitación de suspensiones celulares de Monastrell que conducen a la producción de trans-resveratrol. Finalmente, se realizó el análisis de las proteínas extracelulares tanto en condiciones control como elicitadas con distintos compuestos con el fin de determinar las respuestas de defensa inducidas en estas condiciones. In this memory Vitis vinifera cv Monastrell cell cultures were used to produce trans-resveratrol. The growth of Monastrell cell cultures were characterized using different mineral media and sucrose concentrations. Extracellular production of trans-resveratrol was also characterized using different elicitors such as different nature cyclodextrins, methyl jasmonate, UV light, fosetyl aluminum, salicylic acid and ethephon. Moreover it was study the involvement of calcium, hydrogen peroxide, nitric oxide and phosphorylation and dephosphorylation of proteins in the signaling events triggered by elicitation of Monastrell cell cultures leading to trans-resveratrol production. Finally, it was analyzed extracellular proteins in control and elicited cell cultures in the presence of different elicitors to determine defense responses induced in these conditions.
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    Identificación de regiones cromosómicas implicadas en el control genético de caracteres de interés para la mejora genética de la uva de mesa
    (2012-10-29) Carreño Ruiz, Iván; Ruiz García, Leonor; Carreño Espín, Juan; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Genética y Microbiología
    La mayoría de los caracteres de interés en viticultura están controlados por un gran número de genes de efecto menor. La identificación temprana de individuos portadores de las combinaciones alélicas deseadas, reduce los costes de mantenimiento y evaluación producidos en el desarrollo de nuevas variedades. Utilizando una progenie de uva de mesa procedente del cruzamiento entre Ruby Seedless y Moscatuel, hemos realizado un análisis cuantitativo de los principales caracteres de interés. Se ha construido un mapa genético para cada variedad parental, y un mapa integrado de 1190 cM. El análisis QTL (Quantitative Trait Loci) se ha realizado utilizando un modelo múltiple QTL (MQM) en base a los QTLs detectados al menos durante dos campañas mediante un mapeo simple de intervalos. Se han identificado varios QTLs relacionados con estados fenológicos y caracteres de calidad. Además, se han localizado genes candidatos dentro de los intervalos de confianza de algunos de estos QTLs. Most of the grapevine characters that are significant in viticulture are controlled by a large number of genes of minor effect. Early identification of individuals carrying the desired allele combinations allows decrease maintenance and evaluation costs in the development of new cultivars with improved attributes. We have carried out the quantitative genetic analysis of the major genetic determinants for a given trait in a table grape progeny from a cross between cultivars Ruby Seedless and Moscatuel. A linkage map was constructed for each parent. The homologous linkage groups were used to generate an integrated map spanning 1190 cM. QTL (Quantitative Trait Loci) analyses were carried out using a multiple QTL model (MQM) based on QTLs detected at least during two previous seasons via interval mapping. Several QTLs for phenological stages and quality fruit traits were identified. Candidate genes were found in the confidence intervals of some of the detected QTLs.
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    Influencia de diversos procesos enoténicos y nuevos productos enológicos en la eliminación de residuos de los fungicidas ciprodinil, fludioxinil, pirimetanil y quinoxifen.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Química Agricola, Geología y Edafología,, 2004) Fernández Llamas, María José
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    Las poblaciones de vid silvestre de la Península Ibérica y el origen de las variedades actuales
    (Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 2005) Carreño, Encarnación
    Geografía, selección e hibridación.
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    Mejora genética de la uva de mesa : obtención de variedades de semilla / Ernesto García Martínez ; director Juan Carreño Espín.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Genética y Microbiología,, 1999) García Martínez, Ernesto
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    El Midi de los viñedos. Desde Carlomagno al Mercado Común
    (Murcia : Editora Regional de Murcia, 1990) Gavignaud, Geneviéve; Editora Regional de Murcia
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    Optimization of the agrobacterium-mediated transformation process of grapevine cell cultures and evaluation of its effect on secondary metabolism= Optimización del proceso de transformación mediada por agrobacterium de cultivos celulares de vid y evaluación de su efecto sobre el metabolismo secundario
    (2017-06-02) Chu, Mingyu; Burgos Ortiz, Lorenzo; Pedreño García, María Ángeles; Facultad de Biología
    Objetivos: El objetivo de este trabajo fue mejorar la producción de trans-resveratrol utilizando dos estrategias diferentes: el establecimiento de líneas celulares transgénicas que sobre-expresan el gen de la estilbeno sintasa (sts) implicado en la biosíntesis de trans-resveratrol y la utilización de la elicitación con ciclodextrinas y/o metil jasmonato en las líneas transgénicas producidas. Para ello es necesario desarrollar un protocolo de transformación eficiente y estable de suspensiones celulares de Monastrell utilizando la metodología de transformación mediada por Agrobacterium y asistida por ultrasonidos, y optimizar todos los factores que afectan la eficiencia de transformación. Este protocolo de transformación eficiente y estable se utilizará para transferir el gen sts a células de Monastrell para obtener diferentes líneas celulares transgénicas que serán elicitadas con ciclodextrinas (CD) y/o metil jasmonato (MJ). Estas líneas celulares transgénicas serán evaluadas para determinar si son capaces de producir niveles de trans-resveratrol más elevados que las líneas celulares no transgénicas. Metodología: Las suspensiones celulares (SCC) de V. vinifera cv. Monastrell se infectaron con la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 portando el plásmido pMOG800-nptII-eyfp/IV2 que se había cultivado en medio líquido de levaduras con extracto de manitol (YM). Se estudiaron diferentes factores que podrían afectar el proceso de transformación tal como diferentes tiempos de aplicación de ultrasonidos durante la infección con Agrobacterium (SAAT), la fase óptima de crecimiento de las células en el momento de la infección, la densidad celular de siembra óptima, la selección con antibióticos apropiada, etc. Para comprobar la transformación de los SCC se extrajo el ADN genómico y se realizaron PCRs con diferentes cebadores diseñados para amplificar específicamente los transgenes nptII y eyfp/IV2. Además, se llevaron a cabo hibridaciones Southern para comprobar la integración del transgen y se estudió la viabilidad celular de varias líneas transgénicas en presencia de diferentes concentraciones de paromomicina. Una vez que se dispuso de un protocolo optimizado, se utilizó la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, portando el plásmido pMOG800-nptII-sts-eyfp/IV2, para introducir el gen de la estilbeno sintasa en SCCs. Para evaluar la transformación de los SCC con el sts se extrajo el ADN genómico y se realizaron PCRs con cebadores para amplificar los transgenes marcadoresasi como el 35s-sts (cebadores específicos para el sts transgénico). Para estudiar el efecto de este gen se cuantificó la producción de trans-resveratrol y se estudió la expresión del sts endógeno y transgénico tras elicitar con CD y/o MJ. Para hacer esto el ARN total fue aislado, el cDNA sintetizado y amplificado con cebadores específicos para el transgen sts mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Results: Se ha desarrollado un protocolo eficiente de transformación de SCC no diferenciados de Monastrell mediante la utilización de SAAT. La densidad celular de siembra, el agente selectivo y el estado de desarrollo del SCC fueron factores cruciales para determinar la eficiencia de transformación. Los mejores resultados se obtuvieron cuando las células se infectaron en la fase exponencial y se cultivaron después del co-cultivo con elevada densidad (500 mg/placa) en medio selectivo con paromomicina. Este protocolo se utilizó para introducir el gen sts en SCC de Monastrell consiguiéndose más de 50 líneas SCC transgénicas. Estas células fueron elicitadas con ciclodextrinas y/o metil jasmonato para optimizar la producción de trans-resveratrol. Una línea (F2) produjo los niveles más elevados de trans-resveratrol en comparación con otras líneas transgénicas y con las líneas celulares silvestres. En la SCC transgénica F2 aunque el perfil de expresión del gen sts (endógeno + transgénico) fue similar al del gen endógeno en la línea silvestre, los niveles de expresión fueron mucho más elevados en la línea transgénica. De hecho, los niveles de expresión de sts fueron más elevados tras 6 h de cultivo en todos los tratamientos evaluados y decrecieron rápidamente después. Sin embargo, la expresión del gen sts se incrementó después de 72 h de cultivo en condiciones de elicitación con CD y MJ en combinación y se mantuvo hasta el final del experimento. Conclusions: Por primera vez se ha desarrollado un protocol de transformación para cultivos celulares no diferenciados de Vitis vinífera que se basa en la utilización de la transformación mediada por Agrobacterium y asistida por ultrasonidos (SAAT) y en la optimización de todos los factores que afectan la eficiencia de transformación (específicamente la fase de crecimiento celular, la densidad de siembre y la selección con antibióticos). El sistema de transformación desarrollado en este estudio ha permitido la introducción de genes implicados en el metabolismo secundario en las células de vid. Mediante elicitación con CD y MJ como segunda estrategia para mejorar la producción de trans-resveratrol hemos obtenido una línea celular que produjo elevados niveles de trans-resveratrol. Por lo tanto la elicitación de suspensiones celulares transgénicas de Vitis vinífera cv Monastrell podría utilizarse para una producción sostenible de elevados niveles de trans-resveratrol. Summary Objectives: The aim of this work was to improve the production of trans-resveratrol using two different strategies: the establishment of transgenic cell lines which overexpressed the stilbene synthase, sts gene, involved in trans-resveratrol biosynthesis, and using elicitation with cyclodextrins and/or methyl jasmonate in these transgenic cell lines. For this, it is needed to develop a stable and efficient transformation protocol of Monastrell suspension cultured cells using Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation, and optimizing all the factors affecting transformation efficiency. This stable and efficient transformation protocol will be used to transfer sts gene to Monastrell cells, in order to obtain different transgenic cell lines, which will be elicited with cyclodextrins (CD) and/or (MJ). These transgenic cell lines will be screened in order to determine if they are able to produce higher levels of trans-resveratrol in comparison to non-transgenic cell lines. Material and Methods: Suspension-cultured cells (SCC) of V. vinifera L. cv. Monastrell were infected with Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 harboring the plasmid pMOG800-nptII-eyfp/IV2 grown in yeast extract-mannitol (YM) liquid medium. Different factors that may be affecting the transformation process were studied such as different times of Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated infection, optimum growth phase of cells to be infected, optimum plating density, antibiotic selection, etc. To check transformation of SCC genomic DNA was extracted and specific primers to amplify nptII and eyfp/IV2 were used to run PCRs. Also, Southern blot hybridizations were carried out to check the integration of the transgene. Additionally, cell viability in the presence of different paromomycin concentrations was studied in different transgenic lines. Once an optimum protocol was developed, Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 harboring the plasmid pMOG800-nptII-sts-eyfp/IV2 was used to introduce the stilbene synthase gene, sts, in SCCs. To evaluate sts transformation of SCC, genomic DNA was extracted and primers for the marker transgenes as wells as specific primers to amplify 35s-sts (specific primers for the transgenic sts) were used to run PCRs. To study the effect of this gene, the production of trans-resveratrol was quantified and the expression of the endogenous and transgenic genes was studied after elicitation with CD and/or MJ. To do this RNA was isolated, cDNA synthetized and amplified with specific primers for the sts transgene in a real-time quantitative PCR. Results: An efficient transformation protocol has been developed for undifferentiated Monastrell SCC using Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated transformation (SAAT). The plating cell density, selective agent, and the development stage of the SCC were crucial factors for the transformation efficiency. Best results were obtained when cells were infected at the exponential phase and were plated with high cell density (500mg/dish) after co-culture on paramomycin selection medium. This protocol was used for introducing sts genes to Monastrell SCC, and more than 50 transgenic SCC lines containing sts were obtained. These transgenic cells were elicited with CD and/or MJ in order to improve the production of trans-resveratrol, and one line (F2) produced the higher level of trans-resveratrol in comparison with other transgenic and non-transgenic cell lines. In the F2 transgenic SCC, although the expression profile of sts gene (endogenous + transgenic) was similar to the expression profile detected for the endogenous sts gene in non-transgenic cell line, the levels of sts expression were much higher in the transgenic line. In fact, the expression levels of sts gene were higher at 6 h of cultivation in all treatments tested and then, quickly decreased. However, sts gene expression increased its levels at 72 h of cultivation in elicited conditions with CD and MJ in combination and then, it was maintained until the end of the experiment. Conclusions: We have developed for the first time, a transformation protocol to be applied to undifferentiated Vitis vinifera cell cultures which is based on the use of a Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation method and on the optimization of all the factors which control the transformation efficiency (specifically growth phase of cells, plating cell density and the selection media with antibiotics). The efficient transformation system developed in this study has been used for the introduction of genes involved in the secondary metabolism in the grapevine cells. Using elicitation with CD and MJ as the second strategy to improve the production of trans-resveratrol, we have obtained a transgenic cell line which produced high levels of trans-resveratrol. Therefore, elicited transgenic suspension-cultured cells of Vitis vinifera cv Monastrell could be used for the sustainable production of a high-level of trans-resveratrol.
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    Proantocianidinas de uvas y vinos de las variedades Monastrell,Cabernet Sauvignon y Syrah.
    (2013-04-08) Busse Valverde, Naiara; Gómez Plaza, Encarna; Bautista Ortín, Ana Belén; Facultad de Veterinaria
    En esta Tesis doctoral se han estudiado las proantocianidinas de pieles y semillas de uvas de las variedades Monastrell, Cabernet Sauvignon y Syrah, así como la transferencia de las mismas al vino y el efecto de algunas técnicas enológicas en la modulación de su extracción. Los resultados obtenidos muestran que la concentración de estos compuestos es máxima al inicio de la maduración, disminuyendo conforme se acerca el momento de la vendimia. La cantidad de proantocianidinas en los vinos depende tanto de la variedad como de la técnica enológica aplicada. Tiempos de maceración largos y técnicas como la maceración prefermentativa en frío o el uso de enzimas de maceración promueven una mayor extracción de proantocianidinas, aunque las de las uvas de la variedad Syrah son mucho más fácilmente extraíbles que las de Monastrell, en igualdad de condiciones. Palabras clave: proantocianidinas, uva, vino, técnicas enológicas SUMMARY In this thesis, skin and seed proanthocyanidins of Monastrell, Cabernet Sauvignon and Syrah grape varieties have been studied, as well as their transfer from grapes to wine and the effect of some oenological techniques in modulating their extraction. The results show that the concentration of these compounds was maximum at the beginning of ripening, decreasing up to moment of harvest. The concentration of proanthocyanidins in wines depends both on the variety and the applied oenological technique. Long maceration times and techniques such as cold soak or the use of maceration enzymes promote a large extraction of proanthocyanidins, although, under similar conditions, the proanthocyanidins of Syrah grapes are more easily transferred to must/wine than those of Monastrell grapes. Keywords: proanthocyanidins, grape, wine, oenological techniques