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    Caracterización cinética y aplicaciones biotecnológicas de peroxidasas
    (2014-07-22) Parra Carrillo, Magdalena; Tomás Martínez, Virginia; Tudela Serrano, José; Facultad de Biología
    Objetivos • Estudio de la bibliografía especializada y realización de ensayos preliminares que permitan la proposición de un mecanismo de reacción sometido a análisis cinético, que aporte expresiones útiles para un diseño experimental , aplicable para comprobar la validez del mecanismo de reacción planteado, así como para la caracterización cinética de los sistemas enzimáticos investigados, superando a otros métodos descritos en la bibliografía. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación enzimática por peroxidasas, de los colorantes Índigo Carmín (IC) y Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR), mediante un método espectrofotométrico. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de IC, por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de RBBR por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la determinación de fenoles con aplicaciones biotecnológicas, mediante un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático. Metodología Ensayos espectrofotométricos Los espectros de absorción fueron registrados con un espectrofotómetro de visible-ultra violeta Perkin-Elmer Lambda 35, otros datos cinéticos o de punto final en la zona del visible fueron obtenidos mediante un lector de microplaca SpectraMax 340PC384. Ensayos de cromatografía líquida líquida de alta resolución (HPLC) Los cromatogramas realizados se llevaron a cabo con un cromatógrafo HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution. Las especies eluídas fueron monitorizadas a diferentes longitudes de onda, tomando el máximo de absorción para cada una de ellas. Biodegradación de IC con peroxidasas La reacción se realizó en tubos de plástico con una concentración de enzimas HRP y SBP que varió entre 2.5-30 nM , la concentración de contaminante entre 10-120 M y la de peróxido de hidrógeno también entre 10 y 120 M , todo ello a pH óptimo de 10 mM de tampón citrato de pH 5.0 y 4.0 para HRP y SBP respectivamente, a 25 ºC.Se analizaron las reacciones en el espectrofotómetro y en el HPL, determinando los parámetros cinéticos como la absorbancia máxima (Amax), la velocidad en estado estacionario VSS y la constante de biodegradación (). Biodegradación de IC con sistemas lacasa/peroxidasa-mediador Se comparó el estudio a 25 ºC de SBP con el de TvL para la degradación de IC entre con los mediadores MSG, ASG, SGA y SGO con el fin de contrastar los rendimientos de biodegradación del colorante. Biodegradación de RBBR con sistemas lacasa-mediador Se optimizaron las condiciones de reacción para la degradación de RBBR con sistemas EML a temperatura ambiente, eligiendo el sistema mediador más eficaz para dicha reacción. Bioanálisis enzimático de fenoles Se diseña y optimiza un método de análisis enzimático espectrofotométrico para el análisis de distintos tipos de fenoles industriales (fármacos, contaminantes y fitoquímicos). La reacción se realiza en presencia de AA como reductor acoplado y biomolécula detectora, catalizada por HRP. Conclusiones • Se ha caracterizado cinéticamente y optimizado la biodegradación enzimática de IC y RBBR por H2O2, catalizada por las peroxidasas HRP y SBP, mediante un método espectrofotométrico • Se ha conseguido la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática del IC, por varios sistemas enzima-mediador (EMS). En concreto, las enzimas SBP con H2O2 y TvL con O2, en presencia del premediador natural SGO, y de los mediadores naturales, MSG, ASG y SGA. • Se ha estudiado la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática de RBBR por TvL con O2, ante el premediador natural SGO y los mediadores naturales MSG, ASG y SGA. • Se ha desarrollado un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático, útil para la determinación de concentraciones nanomolares, de diferentes contaminantes, fármacos y fitoquímicos fenólicos de interés biotecnológico. En consecuencia, se han alcanzado satisfactoriamente, los objetivos propuestos al comienzo de esta Tesis Doctoral. Objectives • Kinetic characterization and optimization of a spectrophotometric method, for the enzymatic biodegradation by peroxidases, of the dyes Indigo Carmine (IC) and Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR). • Kinetic characterization and optimization of the IC biodegradation, by enzyme-mediator systems in the presence of natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the RBBR biodegradation, by enzyme-mediator systems with natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the determination of bioactive phenols, by using a spectrophotometric and ultrasensitive method of enzymatic bioanalysis. Methodology Spectrophotometric assays Absorption spectra were recorded in a visible-ultraviolet Perkin-Elmer Lambda 35 spectrophotometer and other data adquisition in endpoint or kinetic were recorded with an absorbance microplate reader SpectraMax 340PC384. Liquid chromatography Chromatograms were realized with an HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution chromatograph. The monitoring of the eluted species was performed at different wavelengths, taking the maximum absorbance wavelengths of the different substances. Biodegradation of the dyes IC and RBBR by POD. This chapter describes a new ecofriendly alternative for removal Remazol Brilliant Blue (RBBR) and Indigo Carmine by soybean (SBP) and horseradish (HRP) peroxidases. Thus, studies for optimization of reaction conditions (pH, concentration of enzymes/substrates/hydrogen peroxide) have been proposed. Biodegradation of IC by enzyme-mediator systems. A reaction mechanism is proposed beside the pH results. This mechanism involves enzymatic and nonenzymatic reactions, in which a premediator (PM), mediator (M) and the mediator radical (MR) are considered. Vss values were determined from enzymes, mediator and IC effects. Thus, the assay conditions for biodegradation of IC, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Vss values were determined from enzyme, mediator and RBBR effects. The experimental data obtained confirmed the reliability of the reaction mechanism proposed. Thus, the assay conditions for biodegradation of RBBR, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Biodegradation of RBBR by laccase-mediator systems. Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR) biodegradation was carried out by laccase from Trametes villosa (TvL) using the natural mediators ASG, MSG, SGA and SGO Enzymatic bioanalysis of phenols. A number of analytical methods with different sensitivity, complexity, quickness and cost have been proposed The aim of this chapter is the possible determination of phenols of biotechnological interest, in nanomolar concentrations, by using an enzymatic and spectrophotometric method of bioanalysis, easy, quick and with low cost. Conclusions • It has characterized kinetically and optimized the enzymatic biodegradation of IC and RBBR by H2O2, catalyzed by the peroxidases HRP and SBP, with a spectrophotometric method. • It has reached the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of IC, by several systems enzyme-mediator (EMS). In particular, the enzyme SBP with H2O2 and TvL with O2, in presence of the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has been studied the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of RBBR by TvL and O2, with the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has carried out a spectrophotometric and ultrasensible method of enzymatic biodegradation, useful for the determination of nanomolar concentrations of different phenolic contaminants, drugs and phytochemicals of biotechnological interest. In consequence, the proposed objectives at the beginning of this Doctoral Thesis have been successfully reached.
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    Caracterización funcional de mutantes de peroxidasas implicadas en la biosíntesis de ligninas en arabidopsis thaliana
    (2015-04-16) Fernández Pérez, Francisco; Novo Uzal, Esther; Pedreño García, María Ángeles; Facultad de Biología
    La lignificación de la pared de las células del xilema es un proceso extremadamente complejo, sometido a un estrecho control hormonal cuya función principal es la de conferir rigidez e impermeabilidad al sistema vascular. La lignificación es una secuencia de reacciones en cadena que conducen desde un metabolito primario, la fenilalanina, hasta los precursores inmediatos de las ligninas, los alcoholes hidroxicinamílicos (p-cumarílico, coniferílico y sinapílico). Estos alcoholes son oxidados, finalmente, por las peroxidasas para dar lugar a sus correspondientes radicales, que se ensamblan en la pared celular generando un polímero hidrofóbico y fuertemente polidisperso, que da rigidez e impermeabiliza la pared celular, constituyendo uno de los mayores sumideros metabólicos del CO2 fijado durante la fotosíntesis. Las peroxidasas siringilo son las enzimas responsables de la oxidación del alcohol sinapílico, lo que conduce a la formación de monómeros siringilo (S) que se incorporan al polímero de lignina. Estas enzimas han sido descritas como peroxidasas básicas que no presentan restricciones estéricas que impidan la entrada de alcohol sinapílico en el centro catalítico. Hasta el momento, las peroxidasas más estudiadas a nivel estructural han sido la ATP A2 de Arabidopsis y HRP A2 de rábano, las cuales son peroxidasas guaiacilo incapaces de oxidar el alcohol sinapílico. La peroxidasa siringilo mejor caracterizada hasta el momento es la de Zinnia elegans (ZePrx). En el genoma de Arabidopsis existen 73 peroxidasas pero ninguna de ellas ha sido identificada como una peroxidasa de tipo siringilo. Estudios previos buscaron en el genoma de A. thaliana peroxidasas que presentan una gran homología de secuencia con ZePrx, así como de estructura, carga superficial, punto isoeléctrico y regulación de su expresión. Teniendo en cuenta estos criterios se seleccionaron las peroxidasas AtPrx4, AtPrx52, y AtPrx72. En esta tesis, se muestra cómo la supresión de dichas peroxidasas en diferentes líneas mutantes de Arabidopsis afecta al contenido y a la composición de ligninas. En general, todas las líneas mutantes mostraron una disminución en el contenido de ligninas, medido con bromuro de acetilo, entre un 17 y un 37%. Además, la relación S/G, obtenida por tioacidolisis, indica una disminución en las unidades de S en todos los mutantes. Además, como se deduce de las tinciones de Wiesner y de Mäule, esta reducción en el contenido de monómeros S parece estar restringida a las fibras interfasciculares, pero no afecta a los vasos del xilema. Para analizar si este cambio en la composición de lignina era dependiente de la edad de la planta, también se realizaron análisis cualitativos y cuantitativos de ligninas en tallos en diferentes etapas de desarrollo. Nuestros resultados mostraron diferencias significativas en el contenido y la composición de ligninas entre plantas mutantes y WT solamente en las últimas etapas del desarrollo. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el tamaño de las plantas mutantes en comparación con el WT. Los análisis mediante qPCR revelaron que los genes implicados en la biosíntesis de ligninas, así como en la formación de la pared celular secundaria, redujeron su expresión en las plantas mutantes. Por otro lado, la expresión de genes implicados en la biosíntesis de ésteres sinapato y de flavonoides se incrementó en las plantas mutantes con respecto al WT lo cual indica que hay una reorientación de los esqueletos carbonados de la ruta de biosíntesis de las ligninas hacia otras rutas del metabolismo fenilpropanoide. En conjunto, nuestros resultados sugieren que AtPrx4, AtPrx52 y AtPrx72 son peroxidasas siringilo implicados en la síntesis de unidades S en las fibras interfasciculares y además, su represión afecta a toda la ruta fenilpropanoide y puede ser suficiente para alterar el metabolismo de la planta. Abstract The lignification of xylem cell walls is an extremely complex process, under strict hormonal control, whose main function is to confer rigidity and impermeability to the vascular system. Lignification is the result of several reactions from a primary metabolite, phenylalanine, until the immediate precursors of lignin, the hydroxycinnamyl (p-coumaryl, coniferyl and sinapyl) alcohols. These alcohols are finally oxidized by peroxidases to give their corresponding radicals, which will be further assembled in the cell wall, generating a hydrophobic polymer (lignin) which gives rigidity and waterproof cell wall. Lignin constitutes a major metabolic sink for the CO2 fixed during photosynthesis. Syringyl peroxidases are the enzymes responsible for sinapyl alcohol oxidation that eventually lead to syringyl monomers formation. They have been described as basic peroxidases which show no steric restrictions that hinder the entry of sinapyl alcohol into the catalytic centre. So far, the most studied peroxidases at the structural level, such as ATP A2 from Arabidopsis and HRP A2 from horseradish, are guaiacyl peroxidases, unable to oxidize sinapyl alcohol. Unfortunately, little is known regarding structure and catalytic properties of syringyl peroxidases. The best characterized is ZePrx from Zinnia elegans. Since such a peroxidase similar to ZePrx has not been identified in Arabidopsis, a search through A. thaliana genome was performed, in order to identify the peroxidases which showed the highest homology to ZePrx. Based on several structural and molecular characteristics, AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 were determined to be the most likely homologous to ZePrx in Arabidopsis. In this thesis, we show how the suppression of AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 in different mutant lines of Arabidopsis affects lignin content and composition. Overall, all the mutant lines showed a decreased in lignin content, measured with acetyl bromide, ranging from 17 to 37%. Furthermore, the S/G ratio, obtained by both nitrobenzene oxidation and thioacidolysis, indicated a decrease in S units in all the mutants. As deduced from Wiesner and mainly Mäule stainings, this reduction in S monomers content seems to be restricted to the interfascicular fibers, but it does not affect xylem vessels. To assay whether this shift in lignin composition was age-dependent, we also performed qualitative and quantitative analyses of lignins in stems at different stages of development. Our results showed significant differences in both content and composition only in late stages of development of mutant plants. However, no significant differences were found regarding mutant size in comparison with WT when plants reached maturity. qPCR revealed that genes involved in lignin biosynthesis as well as in secondary cell wall formation were down-regulated in mutant plants. On the other hand, expression of genes involved in sinapate esters and flavonoid biosynthesis was up-regulated in mutant plants, which indicates a reallocation of carbon from lignin biosynthetic pathway to other routes of phenylpropanoid metabolism. Taken together, our results indicate that AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 may be syringyl peroxidases involved in the synthesis of S units in interfascicular fibers. Moreover, the suppression of the last step of syringyl lignins biosynthesis affects the whole phenylpropanoid pathway and may be sufficient to alter plant metabolism.
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    Diseño, operación y modelización de procesos continuos biorreactor enzimático-módulo de membrana, aplicación a la eliminación de contaminantes fenólicos de efluentes industriales
    (2012-09-14) Barbosa Trillos, Dalje Sunith; Gómez Carrasco, José Luis; Máximo Martín, María Fuensanta; Facultad de Química
    Se estudia eliminar 4 clorofenol de efluentes industriales, utilizando tres peroxidasas procedentes de soja (SBP), rábano (HRP) y alcachofa (AKPC), y seleccionando SBP como la mejor. Dicha peroxidasa se utiliza, tanto libre como inmovilizada, en diversas configuraciones de reactor continuo (reactor tanque y lecho fluidizado), concluyéndose que el reactor tanque continuo asociado con módulo de membrana y la enzima soluble es la configuración más adecuada. Adicionalmente, se plantea y resuelve un modelo de diseño para estos reactores, ajustándose con una desviación típica del orden del 2.92%. La SBP se aplica a la eliminación de otros clorofenoles y se establecen las eficacias relativas de eliminación de los mismos. La eliminación en continuo de mezclas de compuestos fenólicos muestra que la concentración de uno de ellos puede afectar a la eliminación del resto. Por último, se establece que los extractos crudos de raíces transformadas de nabo y tabaco wt podrían constituir una alternativa a las peroxidasas purificadas para el tratamiento de efluentes industriales que contengan compuestos fenólicos.The 4-chlorophenol removal from industrial effluents using three peroxidases extracted from soybean (SBP), horseradish (HRP) and artichoke (AKPC) is studied, showing that SBP is the best option. This one is tested under its soluble and immobilized forms using different reactor configurations (tank reactor and fluidized bed), concluding that the most suitable configuration corresponds to the continuous tank reactor associated in series with a membrane module and using the soluble enzyme. A design model is developed for the optimal configuration, obtaining a good fitting with a standard deviation of 2.92%. In addition, the relative efficiency of SBP for the removal of various chlorophenols is established. The removal of blends of different chlorophenols shows that the concentration of one compound can disturb the removal efficiency of the others. Finally, it is shown that crude extracts from turnip and tobacco wt hairy-roots could be an interesting alternative for the chlorophenols removal.
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    Distribución de la aia-oxidasa y peroxidasa en hipocótilos etiolados de lupinus albus, L. Relación con el crecimiento
    (Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1990) Sánchez Bravo, José; Nuñez, C.; Facultad de Biología
    Se ha estudiado la actividad AIA-oxidasa y peroxidasa en extractos correspondientes a zonas con distinta localización en los hipocótilos etiolados de altramuz (Lupinus albus, L). En plantas de 9 días, con crecimiento activo, las actividades enzimáticas por g de peso fresco muestran una distribución decreciente desde el ápice, mientras que las actividades específicas presentan una distribución de campana, paralela a la del crecimiento. A los 15 días se aprecia una tendencia hacia una distribución uniforme de ambas actividades, como consecuencia de un descenso en las zonas apicales y un aumento en las basales. Las actividades por g de peso fresco se distribuyen de forma paralela al crecimiento, mientras que la distribución de las actividades específicas presenta oscilaciones, localizándose los valores más altos en la zona apical (con crecimiento ) y en la basal. Teniendo en cuenta estudios previos, se discute el papel de AIA-oxidasa en el control de los niveles de AIA durante el crecimiento de los hipocótilos de altramuz.
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    Efecto de fenoles y Mn.2* sobre la degradación de ácido indole-3-acético catalizada por peroxidasa
    (Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1981) Acosta Echevarría, Manuel; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Química
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    Eosinophils and human cancer
    (Murcia : F. Hernández, 1997) Samoszuk, M.
    Eosinophils are rare granulocytes that are normally associated with allergic diseases or responses to various parasitic infections. Many types of human cancer, however, are also associated with extensive eosinophilia, either within the tumor itself, or in the peripheral blood, or in both locations. Special techniques such as autofluorescence or immunohistochemistry are sometimes needed to detect the presence of intact and degranulating eosinophils within the tumors. With the help of these techniques, extensive eosinophilia is most often seen in hematologic tumors such as Hodgkin's disease and certain lymphomas; however, many other types of cancer such as colon, cervix, lung, breast, and ovary also contain eosinophilia if diligently sought. Although the presence or absence of eosinophilia within these tumors does not appear to have a major influence on the prognosis of the patient, eosinophils may play an important role in the host interaction with the tumor, perhaps by promoting angiogenesis and connective tissue formation adjacent to the cancer. In addition, tumor-related eosinophilia provides some interesting clues into tumor biology, particularly with regard to production of cytokines by the tumor cells.
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    Producción de proteínas-PR en la inducción de resistencia a Phytophthora capsici en plantas de pimiento (Capsicum annuum L.) tratadas con Trichoderma harzianum
    (Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 2005) Ezziyyani, Mohammed; Requena, María Emilia; Candela Castillo, María Emilia; Biología Vegetal; Facultad de Biología
    En este trabajo se evalúa la reacción defensiva que desarrollan las plantas de pimiento, cuando se noculan los tallos con el patógeno Phytophthora capsici y se adiciona a las raíces el hongo antagonista Trichoderma harzianum. Así mismo se comprueba que el tratamiento de las semillas con esporas de T. harzianum incrementa el porcentaje de germinación y el peso seco de las plántulas de pimiento. Las hifas del antagonista colonizan las raíces y la rizosfera de las plántulas crecidas de semillas tratadas, pero el hongo antagonista no alcanza la parte aérea de las plantas de pimiento. La infección de los tallos de pimiento con el patógeno produce una reacción de hipersensibilidad pero la progresión de la necrosis se ralentiza en las plantas tratadas con el antagonista T. arzianum lo que significa una reducción del avance del patógeno mediada por una inducción de resistencia. La adición del antagonista T. harzianum a las plantas de pimiento inoculadas con P. capsici, produce una reacción defensiva con producción de proteínas con actividad peroxidasa. El incremento de actividad afecta tanto a las enzimas constitutivas, como a las que se sintetizan “de novo”, pero el incremento de actividad que se detecta en las plantas control es debido al efecto de la herida y no al tratamiento, pues no progresa a lo largo del tiempo. El tratamiento con T. harzianum en las raíces produce una reacción sistémica en las hojas que se resuelve en producción de proteínas-PR con actividad peroxidasa, a pesar de que las hojas no han sido afectadas por el antagonista ni por el patógeno. Estas peroxidasas-PR son básicas de pI 7,2 y 8,7 y solo se detectan en hojas tratadas con T. harzianum viva y a las 96 horas de inoculación. También se observa incremento de la actividad peroxidasa de las raíces y se detecta la producción de una proteína-PR tanto a las 24 como a las 96 horas. Esta isoenzima es ácida de pI 4,3 y aparece debido al tratamiento con T. harzianum tanto viva como autoclavada, pero no aparece en el control ni en las raíces tratadas con agua-peptona. Esto significa que el elicitor es un componente del micelio del hongo que provoca la reacción defensiva con formación de las peroxidasas. La producción de proteínas-PR con actividad peroxidasa debe formar parte del mecanismo de defensa hipersensible de la planta de pimiento y es el responsable de la inducción de resistencia desarrollada por la planta, después del tratamiento con el hongo antagonista y la infección por el patógeno.