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    Estudio de factores pronóstico en una serie de pacientes con leucemia linfática crónica : desarrollo de un nomograma e índice pronóstico
    (2012-10-19) González Serna, Ana Dolores; Ortuño Giner, Francisco José; Osma Córdoba, María del Mar; Facultad de Medicina
    La LLC-B es una enfermedad compleja con una supervivencia global variable. En los últimos años se han producido considerables avances en el tratamiento. Sin embargo, muchos pacientes fallecen a consecuencia de la enfermedad. Por otro lado, la caracterización de nuevos marcadores biológicos con implicación pronóstica (anomalías cromosómicas, CD38, ZAP70 y estado mutacional de las IgVH), ha definido subgrupos dentro de esta entidad. Por lo tanto, la estratificación de los pacientes a partir de la combinación de varios marcadores pronóstico sería crucial para desarrollar una guía terapeútica ajustada al pronóstico de los pacientes. El objetivo de nuestro estudio es analizar un grupo de paciente con LLC evaluando los factores pronósticos clínicos y biológicos, y su impacto en la supervivencia global. Además, desarrollamos un índice pronóstico incorporando las nuevas estrategias diagnósticas disponibles en nuestro medio (Citogenética, FISH, CD38 y ZAP70). Abstract B-CLL is a heterogeneous disease with a variable overall survival. In the last years notable advances in the treatment have been introduced; nevertheless many patients still die from causes related to the disease. The recent characterization of new prognostic factors: chromosome abnormalities, CD38 and/or ZAP70 expression and mutational status of IgVH have allowed to define prognosis subgroups within this entity. Therefore, the stratification of these patients through combination of those prognostic factors might be crucial to adjust treatment options to patients' prognosis. The aim of our study was to analyze a group of patients diagnosed with CLL. In this population a number of clinical and biological parameters were evaluated with particular emphasis in their impact on overall survival. In addition, a prognostic index including cytogenetic, FISH, CD38 and ZAP70 among other parameters was developed and demonstrated significant prognostic usefulness.
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    Estudio de la función del gen DOCK10, inducible por IL-4 en linfocitos B, como factor de intercambio de nucleótidos de guanina y de los perfiles de expresión génica y microRNA en leucemias linfocíticas crónicas tratadas con IL-4 in vitro
    (Universidad de Murcia, 2018-02-15) Ruiz Lafuente, Natalia; Parrado González, Antonio; Facultad de Medicina
    En estudios previos, nuestro grupo identificó a DOCK10 como un gen cuya expresión se induce por IL-4 en linfocitos B normales (LBN) y en leucemias linfocíticas crónicas (LLC). Dada su pertenencia a la familia de proteínas DOCK, se sugiere un posible papel como regulador de las GTPasas Rho. En la publicación 1 tratamos de responder algunas preguntas esenciales sobre la función de DOCK10, tales como: (1) su especificidad para interaccionar con las GTPasas Rho “clásicas”, que abordamos mediante la realización de ensayos “pulldown” tras transfección transitoria en la línea celular 293T; (2) su papel potencial como GEF activador de estas proteínas, que también abordamos mediante ensayos “pulldown” pero realizados en este caso en un sistema de clones con expresión estable e inducible generado en la línea celular HeLa; y (3) su papel en la morfología celular, dinámica del citoesqueleto de actina y protrusiones de membrana mediante microscopía de fluorescencia en este mismo sistema. Pudimos demostrar que las isoformas de primer exón mutuamente excluyente DOCK10.1 y DOCK10.2 interaccionan in vitro de forma específica con las GTPasas Cdc42 y Rac1 en condición libre de carga de nucleótido y que DOCK10.1 incrementa los niveles de activación de ambas GTPasas. DOCK10.1 induce la transición desde una forma elongada y poligonal, hasta una forma más redondeada, no poligonal, con incremento de filopodios y ondulaciones de membrana, cambios compatibles con la activación de dichas GTPasasLa patogenia de la LLC es poco conocida, y la IL-4, como factor de crecimiento de los linfocitos B, podría jugar un papel. La IL-4 ejerce un papel anti-apoptótico en la LLC, y algunos estudios sugieren la hipótesis de que podría jugar un papel oncogénico. Puesto que una parte importante de la acción de la IL-4 es muy probablemente ejercida a través de cambios inducidos en la expresión génica, y ésta no ha sido suficientemente estudiada en LBN y LLC, planteamos un análisis mediante microarrays en ambos tipos celulares (publicación 2). La IL-4 regula la expresión de al menos 229 genes, 189 en LLC y 123 en LBN, siendo 89 comunes, la mayoría inducidos, y con mayor diferencia que los genes reprimidos, y también mayor intensidad en LLC, sugiriendo que esta ruta es muy activa en esta patología. La mayoría de estos genes no eran dianas conocidas de la IL-4. Además la respuesta génica a la IL-4 es diferente en función de la expresión del factor pronóstico ZAP-70, a través de un mecanismo que implica al factor de transcripción NFκB. También identificamos genes que se correlacionan con la protección anti-apoptótica, tales como HOMER2 y BCL6. En la publicación 3 estudiamos mediante microarrays la respuesta a la IL-4 de un tipo de genes no convencionales denominados miRNAs, importantes en la regulación de laexpresión proteica. Identificamos 8 miRNAs maduros, miR-21 (5p y 3p), miR-362 (3p y 5p), miR-500a-3p, miR-502-3p, y miR-532 (3p y 5p), que se inducen por la IL-4 en LLC, y esto ocurre probablemente por un mecanismo “pasivo”, siendo miR-21 intragénico a VMP1, el resto de miRNAs intragénicos a CLCN5, y ambos genes inducidos por la IL-4, de modo que los miRNAs se inducirían incrustados dentro de los tránscritos primarios de ambos. Puesto que la IL-4 juega un papel crucial en la evasión de la apoptosis y la resistencia a quimioterapia, la identificación de los genes y miRNAs regulados por la IL-4 contribuiría a un mayor esclarecimiento de los mecanismos moleculares de la señalización por la IL-4, lo que podría aprovecharse para buscar alternativas terapéuticas mediante la manipulación de esta vía, con inhibidores específicos o con nuevos abordajes más experimentales como el empleo de miRNAs.
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    Estudio del proceso de sensibilidad colateral en células leucémicas murinas y humanas con fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR).
    (2013-09-25) Cerezo Fernández, David; Martín-Orozco Santiago, María Elena; Departamento de Bioquímica y Biología Molecular e Inmunología
    INTRODUCCIÓN: La adquisición del fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) en células tumorales las convierte en resistentes a fármacos antineoplásicos y es una de las principales causas del fracaso de la quimioterapia en algunos tumores. La expresión de glicoproteína P (MDR-1, P-gp, ABCB1) contribuye a esta resistencia expulsando los fármacos o regulando la muerte celular programada. Por otro lado, la sobreexpresión de miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 observada en tumores sanguíneos se ha asociado a la resistencia a quimioterapia en varios cánceres humanos. También es importante estudiar alteraciones en las rutas de señalización de MAPKs y la secreción de citocinas en las células con fenotipo MDR. OBJETIVOS: El propósito de este trabajo fue encontrar un estímulo capaz de inducir sensibilidad colateral en células leucémicas murinas y humanas con fenotipo MDR, y caracterizar el tipo de muerte celular inducida. El segundo propósito fue estudiar la contribución de MDR-1, caspasas, proteínas de la familia Bcl-2, MAPKs y citocinas al proceso de sensibilidad colateral. MATERIALES Y MÉTODOS: Para alcanzar nuestros objetivos, usamos células leucémicas murinas L1210 y su sublínea celular resistente L1210R, así como una línea celular procedente de la línea L1210 transfectada con un plásmido que contenía el gen MDR-1 (CBMC-6). Se realizó western-blot para estudiar la expresión de proteínas, inhibición de MAPKs y caspasas y silenciamiento de ARN de MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 y Bax para estudiar el papel de estas proteínas. RESULTADOS: Se encontró que las células leucémicas resistentes con sobreexpresión de P-gp, pero no sus parentales sensibles, son hipersensibles a estrés hipotérmico produciéndose apoptosis a temperaturas por debajo de 4ºC. La transfección de la línea celular parental con un plásmido que contiene P-gp las convierte en sensibles a estrés hipotérmico, demostrando la asociación entre la expresión de P-gp y la muerte celular provocada por el frío. También observamos un incremento de la expresión basal y actividad del fragmento activo de caspasa 3 a temperatura fisiológica (37ºC) en las células MDR. La inhibición de caspasa 3 rescató parcialmente a las células leucémicas MDR de la apoptosis inducida por el frío, lo que sugiere que el mecanismo de muerte celular depende de caspasa 3. Esto demuestra que la expresión de P-gp juega un papel importante en la supervivencia de las células MDR y es acompañada por un proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico. Se observó que la línea parental leucémica (L1210) y la línea celular CBMC-6 presentan una alta expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL, mientras que la expresión de Bcl-2 es baja. Por el contrario, en las células L1210R se observó una disminución de la expresión de Bcl-xL y un aumento de Bcl-2. La inhibición de dirigida de proteínas anti-apoptóticas confirma que la expresión de Bcl-xL es un regulador clave de la supervivencia de las células leucémicas. En contraste, el silenciamiento de Bcl-2 muestra que la supervivencia de las células L1210R no depende del nivel de expresión de Bcl-2. Así, nuestros datos demuestran que la supervivencia de la línea celular parental depende de la expresión de Bcl-xL, pero la adquisición del fenotipo MDR elimina esta dependencia y podría depender de varios miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2. Además, los resultados obtenidos en las células CBMC-6 demuestran que P-gp tiene poca influencia sobre las proteínas de la familia Bcl-2. Resultados similares se obtuvieron bajo condiciones de estrés hipotérmico y exposición al fármaco daunomicina. En relación a la ruta de señalización de MAPKs, demostramos su importancia en el desarrollo del fenotipo MDR, así como en el desarrollo de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico, demostrando que la inhibición de ERK y JNK puede proteger, parcialmente, de la muerte celular inducida por el frío en las células L1210R y CBMC-6. CONCLUSIONES: El proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico está asociado al fenotipo MDR en células murinas, y ocurre a través de un proceso de apoptosis dependiente de caspasas. La expresión y funcionalidad de MDR-1 está asociada a la sensibilidad a hipotermia en células murinas. El desarrollo del fenotipo MDR está acompañado de cambios en la expresión de proteínas Bcl-2, pero éstas no influyen en la sensibilidad colateral. La señalización a través de ERK y JNK está implicada en la sensibilidad colateral observada en las células MDR. La señalización a través de citocinas podría tener un papel importante en la respuesta a estrés de las células MDR. TITLE: STUDY ABOUT COLLATERAL SENSITIVITY PROCESS IN MURINE AND HUMAN LEUKEMIC CELLS WITH MULTIDRUG RESISTANCE PHENOTYPE (MDR) AUTHOR: DAVID CEREZO FERNÁNDEZ INTRODUCTION: The acquisition of a multidrug-resistant (MDR) phenotype by tumor cells that renders them unsusceptible to anti-neoplasic agents is one of the main causes of chemotherapy failure in human malignancies. The increased expression of P-glycoprotein (MDR1, P-gp, ABCB1) in tumor cells contributes to drug resistance by extruding chemotherapeutic agents or by regulating programmed cell death. In the other hand, over-expression of anti-apoptotic Bcl-2 family members has been reported in hematologic malignancies and has been associated with chemotherapy resistance in various human cancers. As these findings, it is important to study alterations in MDR cells on MAPKs pathway and citokines secretion. OBJECTIVES: The aim of this work was to find a stimulus able to induce collateral sensitivity in murine and human leukemic MDR cells, and to characterize the type of death induced. The second aim was to study the contribution of MDR-1, caspases, family Bcl-2 proteins, MAPKs and citokines to this collateral sensitivity process. MATERIALS AND METHODS: To reach our objectives we used L1210 murine leukemia cells and its resistant derived cell line L1210R, as well as a transfected with a plasmid containing MDR-1 cell line obtained from L1210 (CBMC-6). It was used western-blot to study proteins expression, inhibition of MAPKs and caspases and RNAm silencing of MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 and Bax family to study the role of this proteins. RESULTS: It was found that resistant leukemic cells with P-gp over-expression, but not their sensitive counterparts, are hypersensitive to cold-induced cell death when exposed to temperatures below 4ºC. Transfection of parental cells with a P-gp-expressing plasmid makes these cells sensitive to cold stress, demonstrating an association between P-gp expression and cell death at low temperatures. Furthermore, we observed increased basal expression and activity of effector caspase-3 at physiological temperature (37ºC) in MDR cells. Treatment with a caspase-3 inhibitor partially rescues MDR leukemic cells from cold-induced apoptosis, which suggests that the cell death mechanism may require caspase-3 activity. Taken together, these findings demonstrate that P-gp expression plays a role in MDR cell survival, and is accompanied by a collateral sensitivity to cold stress. We demonstrate that parental leukemic (L1210) and CBMC-6 cells display high constitutive expression of anti-apoptotic Bcl-xL protein, while Bcl-2 protein expression was very low. By contrast, leukemic cells L1210R display a decrease of Bcl-xL and up-regulation of Bcl-2 protein expression levels. Furthermore, targeted inhibition of individual anti-apoptotic proteins by RNA silencing confirms that Bcl-xL expression is a key regulator of leukemic cells survival. In contrast, the silencing of Bcl-2 shows that L1210R survival doesn’t depend on Bcl-2 expression level. Together, our data demonstrate that parental leukemic cells survival are largely dependent on Bcl-xL protein expression, but acquisition of MDR phenotype by such cells abrogate such survival dependence and suggests that resistant cells became probably dependent on more than one anti-apoptotic protein for survival at physiological conditions. Additionally, the results obtained with CBMC-6 cells demonstrate that P-gp exert slight influence in the expression level of Bcl-2 family members. Similar results were obtained under cold stress and drug exposure. Related to MAPKs signaling pathway, we have addressed it importance in MDR phenotype development, as well as in hypothermia collateral sensitivity, showing that ERK and JNK inhibition can protect, partially, against stress-cold induced-death in L1210R and CBMC-6 cell lines. CONCLUSIONS: Collateral sensitivity to cold stress is associated to MDR phenotype in murine cells, and it occurs by a caspase-dependent apoptosis process in murine cells. Expression and functionality of MDR-1 is strongly associated to hypothermia sensitivity in murine cells. MDR phenotype development is accompanied by changes in Bcl-2 family proteins expression, but it is not shown an association with collateral sensitivity. ERK and JNK signaling pathways are implicated in collateral sensitivity process observed in MDR cells. Citokines signaling could play an important role on MDR cells stress response.
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    Modelo de interacción célula NK-célula tumoral en la leucemia aguda en la infancia
    (Universidad de Murcia, 2020-01-30) Martínez Sánchez, María Victoria; Minguela Puras, Alfredo; Escuela Internacional de Doctorado
    Introducción: La leucemia aguda es el cáncer más frecuente en la infancia, representa el 27,1 % de todas las neoplasias que se diagnostican en niños de cero a catorce, entre ellas la leucemia linfoblástica aguda (LLA) comprende el 80 % de todas las leucemias, mientras que la leucemia mieloblástica aguda (LMA) representa el 16,5 %. La mejora de los tratamientos ha permitido el aumento de la tasa de supervivencia a cinco años de estos pacientes, situándolas en el 84 % en la LLA y en el 61 % en la LMA. Pero un 20 % de los pacientes con LLA y hasta un 50% de los pacientes con LMA recae y en estos casos la tasa de curación disminuye drásticamente, por lo que para estos pacientes son necesarias nuevas estrategias y aproximaciones terapéuticas que permitan conocer y seleccionar a aquellos con mayor riesgo de recaída. En este sentido cabe destacar que las células Natural Killer (NK) tiene una potente actividad antitumoral innata, tanto las células NK autólogas (del propio paciente) como las alogénicas en el contexto del trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH), debido a que determinadas combinaciones genéticas entre donante y receptor regulan la función de las células NK favoreciendo la lucha del injerto frente a la leucemia. A esto se une que las células NK son las más resistentes a la quimioterapia citotóxica, por lo que parece apropiado profundizar en el estudio de estas células y su interacción con las células leucémicas, para un mejor conocimiento de los mecanismos que regulan la función de la respuesta antitumoral que podría contribuir al desarrollo de nuevas terapias antitumorales personalizadas sin efectos secundarios indeseables. Objetivos: El objetivo principal de esta tesis es analizar el papel de la interacción entre la célula NK y la célula tumoral en pacientes pediátricos diagnosticados de leucemia aguda. Para ello se propone: 1) analizar el perfil genético los receptores KIR de células NK y la de sus ligandos HLA en pacientes y controles sanos para determinar su relación con la patología leucémica; 2) analizar el fenotipo de las células malignas en los diferentes tipos de leucemias agudas y su expresión de ligandos para receptores activadores (CD112, CD155, MICA/B y ULBP-1) e inhibidores (HLA-I y HLA-C) de las células NK, tratando de establecer su relación con la susceptibilidad y evolución de los pacientes; y 3) estudiar en pacientes y controles sanos la expresión de receptores inhibidores (KIR2DL1, KIR2DS1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1 y NKG2A) y activadores (CD16 y DNAM-1) en células NK de sangre periférica (SP), para investigar su papel en la susceptibilidad y la evolución de los pacientes. Metodología: La metodología utilizada en esta tesis ha sido, la tipificación de los genes KIR y HLA en muestras de ADN con sistema Luminex mediante PCR-SSO. Para analizar el inmunofenotipo y la expresión de ligandos en muestras de MO se ha utilizado un citómetro BD FACSCanto-II (de 3 láseres y 8 detectores) y para analizar la expresión de receptores de células NK en muestras de SP se ha utilizado un citómetro BD LSR-II (de 3 láseres y 13 detectores). Todas las variables analizadas se incluyeron en una base de datos Excel 2003 anonimizando la identidad de los pacientes y para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS v20.0. Conclusiones: 1. En nuestra serie de pacientes no se evidencia asociación entre los diferentes genotipos KIR y HLA o sus potenciales interacciones y el riesgo de padecer leucemia aguda en la infancia. 2. En pacientes pediátricos con LLA-B, la interacción KIR2DL2/C1 se asocia a SG y SLE más cortas. Esta asociación es independiente de la presencia de alteraciones citogenéticas de mal pronóstico, pero está relacionada con la presencia de un mayor número de interacciones iKIR/ligando, por lo que podría ser la suma de interacciones inhibidoras la que impacte negativamente en la supervivencia. 3. Las LLA-B y -T de nuestra serie presentan un patrón de expresión de ligandos de receptores de células NK opuesto. Las LLA-B conservan la expresión de ligandos inhibidores (HLA-I y HLA-C) y aumentan la de ligandos activadores (CD112 y ULBP-1), mientras que las LLA-T sin excepción, muestran pérdidas muy significativas de la expresión de ligandos inhibidores, sin incremento de la expresión de ligandos activadores. Esta diferencia, de ser confirmada, sugiere que los mecanismos que regulan la inmunovigilancia frente a ambos tipos de leucemias son diferentes, y podría ser de utilidad para potenciar la respuesta antitumoral en la selección de donantes de progenitores hematopoyéticos. 4. En la LLA-T infantil la pérdida de expresión de HLA-C en la población patológica se asocia a supervivencias prolongadas, lo que sugiere que el reconocimiento de pérdida de lo propio por parte de las células NK podría contribuir a la inmunovigilancia en este tipo de leucemia. 5. La expresión basal elevada de HLA-C en los linfocitos sanos residuales de los pacientes con LLA-B infantil se asocia aparentemente a supervivencias más reducidas, lo que podría indicar un estado de menor respuesta de las células citotóxicas de estos pacientes, posiblemente inducido por un exceso de señales inhibidoras. Estos resultados deberían ser demostrados en ensayos in vitro. 6. Las interacciones educadoras iKIR/ligando favorecen ratios elevados de expresión CD226/iKIR en las células NK de pacientes pediátricos y controles sanos. Sin embargo, la interacción educadora NKG2A/HLA-E, induce ratios reducidos de CD226/NKG2A en las células NK de los niños con leucemia aguda, pero no en los controles sanos de nuestro estudio. Esta disminución podría ser un mecanismo supresor de células NK desarrollado específicamente en la leucemia aguda infantil, importante al tratarse de la subpoblación de células NK mayoritaria en niños.