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Acto de bienvenida grado en Biotecnología
(2019-04-09) OMEGA, FOTOS; Facultad de Biología
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Agricultura transgénica e impactos socioambientales: una lectura a partir del Cerrado/Brasil
(Murcia: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Murcia, 2018) Mendonça Oliveira de Souza, Murilo; De Melo e Silva Neto, Carlos; Melgarejo, Leonardo
La modernización de la agricultura tuvo como base un movimiento de artificialización de las relaciones con la naturaleza. La adopción del paquete tecnológico de la revolución verde a mediados de los años 1960 y, más recientemente (la segunda revolución verde) con el paquete de los transgénicos, facilitó el camino para la concentración de poder del agronegocio y para una infinidad de impactos socioambientales. Los Estados del Cerrado Brasilero han representado la mayor área cultivada con transgénicos en el país (63%) acumulando impactos sociales y ambientales provenientes de este proceso. Este texto se propone reflexionar sobre estas cuestiones, con especial interés en los impactos socioambientales derivados del avance de los cultivos transgénicos en esta parte del territorio. Los resultados muestran que no ocurrió el esperado aumento en la productividad con la utilización de plantas genéticamente modificadas. Por el contrario ocurrió una elevación del consumo de abonos químicos y agrotóxicos relacionada a la adopción de las semillas transgénicas. Se redujeron oportunidades de ocupaciones productivas, concentrando las actividades económicas en cadenas del agronegocio refractarias al perfil de los campesinos, pueblos y comunidades tradicionales que constituyen la mayor parte de la población regional. Los impactos ambientales agravan las condiciones socioeconómicas dadas las debilidades y particularidades de éste, que es el más antiguo y especializado bioma del continente sur americano.
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Alimentos transgénicos : factores culturales que explican su adaptación o rechazo
(Universidad de Murcia, 2019-05-10) Álvarez de Luis, Amaia; Antón Hurtado, Josefa María; Escuela Internacional de Doctorado
El objetivo principal de este trabajo de investigación se centra en analizar desde un punto de vista sociocultural la aceptación o rechazo de los alimentos transgénicos en diferentes sectores poblacionales. Así mismo y de manera específica se tratarán de cubrir otros objetivos como son el conocimiento de la información y el interés que tienen estos sectores sobre los alimentos transgénicos y el estudio del peso que cuatro factores culturales: simbólico, tecno-económico, socio-político y ecológico, tienen en la actitud que las personas muestran a la hora de aceptar o rechazar un alimento transgénico. Para llevar a cabo dicho estudio utilizo una metodología basada en los métodos mixtos en los que se combinan las técnicas cualitativas y cuantitativas. La primera parte del capítulo metodológico refiere a las técnicas cualitativas. A lo largo de la realización de esta tesis doctoral he tenido la oportunidad de poder realizar 17 entrevistas etnográficas en profundidad que intentan reunir las percepciones sociales, británicas y españolas, de diferentes sectores poblacionales: agricultores, biotecnólogos, consumidores, trabajadores del sector alimentario, etc. A continuación, se expone las técnicas cuantitativas. Este capítulo, utiliza una comunidad de estudio de estudiantes de las universidades de Murcia (España) y Oxford Brookes (Reino Unido). El análisis que muestro compara y contrasta los resultados obtenidos a través de un cuestionario basado en 27 ítems. Diferencias de opinión que existen entre grupos de estudiantes universitarios atendiendo a su origen y el tipo de carrera universitaria que están realizándolo, tomando aquellos ítem del cuestionario que muestren diferencias porcentuales en los resultados descriptivos obtenidos (gráficos de barras y tablas de contingencia). El último capítulo de la metodología combina ambas técnicas expuestas, con el objetivo de obtener unos resultados más globales y enriquecidos a través de la combinación de las perspectivas sociales obtenidas a partir de la etnografía y los descriptivos del cuestionario. De esta manera se logra alcanzar un mayor entendimiento de los motivos que la sociedad actual tiene para aceptar o rechazar el uso de alimentos transgénicos, utilizando en todo momento como hilo conductor los cuatro factores culturales descritos. Una vez expuestos los resultados de mi estudio, termino este trabajo exponiendo las conclusiones que paso a resumir a continuación. La Ingeniería Genética es a día de hoy una de las áreas más prometedoras dada la gran cantidad de oportunidades que puede ofrecer al ser humano. De ella surge una de sus aplicaciones más controvertidas: los alimentos transgénicos. El objetivo principal de este estudio era dar respuesta a los motivos de aceptación y rechazo de esta controvertida aplicación y los resultados obtenidos a partir de la metodología utilizada, muestran el importante papel que estos cuatro factores culturales están desempeñando a la hora de poder explicar dichos motivos. Cuatro factores que quedan entrelazados atendiendo al principio de la causalidad circular. Además, el conocimiento se incluye en esta investigación como potencial factor de predisposición. En conclusión podemos afirmar que persiste la controversia sobre los alimentos transgénicos y se recrudece con la aparición de novedosas y prometedoras técnicas de edición génica (CRISPR). En este contexto sociocultural salud humana, crecimiento poblacional, cambio climático, globalización, sostenibilidad y soberanía nacional deben ser considerados como los elementos clave para pensar en cómo debe ser la futura producción y distribución de alimentos. Es el único camino a seguir si de verdad se quieren atajar los actuales problemas de seguridad alimentaria (safety & security) que a escala global plantea la invención, el cultivo y la comercialización de los alimentos transgénicos.
Embargo
Betalaínas con actividad frente a Alzheimer y cáncer : bioprospección, diversificación estructural y caracterización funcional
(Universidad de Murcia, 2026-04-28) Martínez Rodríguez, Pedro; Gandía Herrero, Fernando; Guerrero Rubio, Alejandra; Sin departamento asociado; Escuela Internacional de Doctorado
La presente Tesis Doctoral abordó de manera integral el estudio de las betalaínas, superando las limitaciones impuestas por el uso habitual de extractos complejos de fuentes convencionales como Beta vulgaris y Opuntia ficus-indica. La investigación exploró desde el origen y la presencia de pigmentos hasta ahora no considerados en la naturaleza hasta su potencial terapéutico en enfermedades de alto impacto como el Alzheimer y el cáncer. Así, la Tesis se estructuró en tres ejes principales: la bioprospección de betalaínas singulares, la modificación estructural del ácido betalámico para la obtención de nuevas familias de pigmentos a partir de sustratos no convencionales, y la caracterización funcional de la bioactividad de moléculas individuales tanto in vitro como in vivo utilizando el modelo animal Caenorhabditis elegans. La investigación comenzó expandiendo las fronteras conocidas de estos pigmentos, documentando por primera vez la amplia distribución (29 compuestos identificados) de betalaínas descarboxiladas, derivadas de la dopamina, en especies de la familia Amaranthaceae, especialmente en la quinoa (Chenopodium quinoa), consolidándolas como una familia de fitoquímicos relevante para la fisiología de estas plantas. Asimismo, se exploró la biosíntesis de betalaínas en el hongo "fósil viviente" Neolecta irregularis. Mediante la caracterización de su enzima 4,5-DOPA-extradiol-dioxigenasa (NiDODA), se demostró la capacidad formadora de betalaínas en este ascomiceto basal, expandiendo así la distribución filogenética de esta ruta biosintética fuera del reino vegetal. Por otro lado, se llevó a cabo la modificación química de la unidad estructural y funcional de las betalaínas: el ácido betalámico. En este ámbito, se describió la síntesis y caracterización de una nueva familia de betalaínas metiladas mediante la incorporación de un grupo metilo para formar el ácido 6-metil-betalámico. Además, se sintetizaron betalaínas hidroxiladas utilizando como molécula precursora la noradrenalina, resultando en pigmentos con mayor polaridad. Así, la investigación llevada a cabo representa el inicio de la era de la química del núcleo central de las betalaínas, abriendo una vía para el diseño de nuevos pigmentos bioactivos hechos a medida. Asimismo, se evaluó la actividad biológica de estos pigmentos utilizando el modelo animal Caenorhabditis elegans. Respecto a la enfermedad de Alzheimer, se demostró que las betalaínas poseen propiedades anti-amiloidogénicas; 22 moléculas redujeron la agregación del péptido amiloide in vitro, y los ensayos in vivo confirmaron una mejora significativa en el comportamiento quimiotáctico en estirpes de C. elegans que son modelo de Alzheimer, respaldada además por estudios de docking molecular. En cuanto a la actividad antitumoral, las betalaínas metiladas mostraron una potente capacidad para reducir la proliferación de células tumorales en C. elegans. Entre ellas, la prolina-6-metil-betaxantina destacó como el pigmento más efectivo, logrando reducir el tamaño tumoral en un 48,4 %. Como estrategia para trasladar estos hallazgos a una aplicación real, se desarrollaron liposomas cargados con betalaínas que garantizan su biodisponibilidad. Estos sistemas no solo preservaron las propiedades antioxidantes de los pigmentos, sino que liposomas cargados con betalaínas aumentaron la vida media de C. elegans hasta en un 21,8 %, demostrando ser un sistema eficaz de administración. En conjunto, esta Tesis posiciona a las betalaínas, tanto tradicionales como modificadas estructuralmente, como candidatas prometedoras para el desarrollo de nutracéuticos y agentes farmacológicos. Los resultados obtenidos proporcionan una base sólida que va desde la caracterización más básica hasta la evidencia preclínica, destacando el papel de las betalaínas como potenciales moléculas de interés en la lucha contra enfermedades neurodegenerativas y oncológicas.
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Bioavailability of oleuropein from olive leaf extract in humans : impact of enzymatic pre-treatment and probiotic co-administration
(Universidad de Murcia, 2023-01-31) Polia, Franck; Tomás Barberán, Francisco; García Villalba, Rocio; Horcajada, Marie-Noëlle; Escuela Internacional de Doctorado
La oleuropeína es un compuesto fenólico que se encuentra principalmente en las hojas de olivo y se utiliza como nutracéutico en forma de extracto de hoja de olivo (OLE). Es la forma glucosídica de la oleuropeína aglicona (OEa), compuesta de hidroxitirosol (HT) unido al ácido elenólico (EA). OLP muestra una amplia gama de actividades in vitro y con animales, pero los datos en humanos son menos claros y no confirman las expectativas. Una causa es la biodisponibilidad de la OLP. Este parámetro es difícil de medir debido al escaso conocimiento sobre su mecanismo de absorción, su metabolización, etc. Esta complejidad aumenta cuando se consideran los metabolitos de la OLP que tienen un comportamiento diferente. Aún así, la OLP tiene una baja absorción debido a su gran estructura y alta polaridad, lo que impide su absorción pasiva, a diferencia de sus metabolitos más pequeños como el HT y la OEa. En consecuencia, el principal objetivo de esta tesis fue aumentar el conocimiento sobre la bioeficacia y biodisponibilidad de la OLP y sus metabolitos, y mejorarla mediante dos procesos biotecnológicos: un pretratamiento enzimático y una coingestión probiótica. Utilizando modelos in vitro como la oxidación de la LDL o el cultivo de condrocitos encapsulados primarios, se estableció que los metabolitos de la OLP mostraban efectos similares a los de la molécula original, la OEa mostrando los mejores resultados. Las enzimas que poseían tanto actividad de β-glucosidasa como de esterasa se seleccionaron luego con sustrato modelo, OLP puro y OLE. Se obtuvo un rendimiento de reacción del 72% de la producción de metabolitos utilizando Rapidase® Fiber. Paralelamente, usando un cribado in silico y cultivos en medios empobrecidos en fuente de carbono pero ricos en OLP, se seleccionó el probiótico L. plantarum NCC 1171 por su capacidad para degradar más del 50% del contenido de OLP en sus medios en 8 horas. Un obstáculo en la comprensión de la biodisponibilidad de OLP es la falta de homogeneidad dentro de su análisis. En esta tesis se desarrolló un nuevo método analítico para cuantificar los metabolitos de la OLP bajo sus formas conjugadas sin la presencia de estándares analíticos comerciales. El enfoque se basó en el cálculo de un factor de respuesta entre el sistema de detección UV y MS, lo que permitió la cuantificación de metabolitos conjugados utilizando estándares de aglicona tanto en plasma como en orina. Gracias a este método, se confirmó que el intestino delgado es el principal sitio de absorción de los metabolitos de la OLP. El sulfato de hidroxitirosol mostró la AUC plasmática más alta, mientras que el dihidro-OEa-glucurónido fue el metabolito más concentrado en la orina. Se confirmó la variabilidad interindividual, mientras que se observó un efecto de género, mostrando las mujeres un AUC y excreción más alto que los hombres. La ingesta crónica condujo a una disminución en el AUC de los metabolitos totales como se observó en PK2 en comparación con PK1. Los tratamientos no tuvieron un impacto significativo en la OLP, aunque se encontró una tendencia con el tratamiento probiótico mitigando la disminución en el AUC total en comparación con el grupo de control. Los resultados del análisis de microbiota indican que la ingestión crónica de OLE no cambió la población o diversidad microbiana, ni la producción de SCFA. Estos resultados, asociados con el Tmax rápido, indican que la microbiota colónica afecta pobremente los parámetros de absorción, distribución, metabolización y excreción de OLP, y es probable que sea absorbida o metabolizada antes de llegar al colon, ya sea a partir de la enzima LPH o de la microbiota del intestino delgado.
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Biomateriales: De lo macro a lo nano. María Vallet Regí, Universidad Complutense de Madrid. Sala de Grados de la Facultad de Química
(Servicio de Comunicación y Proyección Universitaria, 2013-04-10) Urbina, Luis
Biomateriales: De lo macro a lo nano. María Vallet Regí, Universidad Complutense de Madrid. Sala de Grados de la Facultad de Química
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Biosynthesis, production and biological activity of singular betalain pigments
(Universidad de Murcia, 2022-07-13) Henarejos Escudero, Paula; Gandía Herrero, Fernando; García Carmona, Francisco; Escuela Internacional de Doctorado
Tradicionalmente se ha considerado que la unidad estructural que compartían todas las betalaínas era el ácido betalámico, el cual se obtiene tras la ciclación espontánea de 4,5-seco-DOPA, molécula resultante de la acción de la enzima 4,5-DOPA-extradiol-dioxigenasa (DODA) sobre el aminoácido aromático L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). Sin embargo, los trabajos realizados en esta Tesis Doctoral cambian este paradigma, mostrando una nueva unidad estructural y descubriendo fuentes alternativas de pigmentos betalámicos singulares. Los objetivos de esta Tesis fueron: 1- Búsqueda de fuentes alternativas de betalaínas en plantas. 2- Caracterización fisicoquímica de nuevas betalaínas y estudio de sus rutas biosintéticas. 3- Desarrollo de procesos biotecnológicos para la producción de betalaínas, tanto con estrategias microbiológicas como de origen vegetal. 4- Caracterización del potencial promotor de la salud de betalaínas singulares en el modelo animal Caenorhabditis elegans. En la búsqueda de nuevas fuentes de betalaínas, los pigmentos de Dionaea muscipula Ellis, también conocida como Venus atrapamoscas, fueron estudiados. El establecimiento inequívoco de antocianinas en D. muscipula apoya la exclusión de la familia Droseraceae del orden Caryophyllales desde un punto de vista fitoquímico y su inclusión en el orden Nepenthales. Se han establecido las condiciones para el desarrollo de líneas de callos de Chenopodium quinoa en medio sólido que producen diferentes betalaínas. Indicando que el aumento de la hormona 6-benzilaminopurina y la disminución de nitrógeno en el medio de cultivo son factores clave para activar la ruta biosintética de las betalaínas. La detección de dos betaxantinas derivadas de dopamina en granos de quinua abrió la posibilidad de la existencia de múltiples pigmentos derivados de dopamina en la naturaleza. Probablemente ocultos como compuestos menores en los registros de HPLC de plantas. Se ha descrito una nueva ruta biosintética capaz de producir betalaínas descarboxiladas in planta, como se ha demostrado en C. quinoa. La enzima clave en la ruta derivada de dopamina es una 4,5-extradiol-dioxigenasa (DODA) que escinde el anillo de esta amina, y que se ha caracterizado a nivel cinético y molecular. La proteína es una enzima dual y expresa actividad frente a los sustratos de relevancia fisiológica, L-DOPA y dopamina. Con la sola expresión de la enzima DODA, se reprodujo biotecnológicamente el perfil de betalaínas presentes de forma natural en los granos de quinua. Esto se considera una clara demostración de la simplicidad de la ruta biosintética, propuesta con forma cuadrada, necesaria para producir los pigmentos. Se ha descubierto, descrito y caracterizado toda una nueva familia de betalaínas, las 6-descarboxibetalaínas. Todos los miembros caracterizados presentan propiedades de color similares y una fuerte fluorescencia. Sin embargo, las doce betalaínas descarboxiladas estudiadas en esta Tesis presentan diferentes comportamientos in vivo en ensayos de capacidad antioxidante y promotora de la salud en el animal modelo Caenorhabditis elegans. Además, se ha estudiado el potencial de las 6-descarboxibetalínas como moléculas antiagregantes de β-amiloide in vitro. Cuatro betalaínas descarboxiladas han mostrado resultados prometedores con valores IC50 en el rango micromolar, de posible interés en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Alzheimer. También se ha estudiado como betalaínas carboxiladas tradicionales y extractos naturales reducen el crecimiento tumoral in vivo y amplían la vida media del modelo tumoral de Caenorhabditis elegans (gld-1). La molécula más eficaz en la reducción del tamaño tumoral es la L-triptófano-betaxantina. Las betalaínas actúan no solo como antioxidantes, sino también regulando el factor de transcripción DAF-16. Así, las betalaínas se revelan como potenciales fitoquímicos anticancerígenos, de posible importancia en las estrategias de quimioprevención y tratamiento. Profundizando en esta actividad, se han diseñado nuevas betaxantinas que parten de L-triptófano-betaxantina como molécula líder. Los nuevos pigmentos se han producido biotecnológicamente y se han caracterizado sus propiedades. Todos estos nuevos pigmentos muestran una reducción significativa del tamaño de las gónadas tumorales en C. elegans (gld-1).
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Biotechnological production of antioxidant pigments betalains and evaluation of their functional capacity in the in vivo model Caenorhabditis elegans
(Universidad de Murcia, 2020-10-01) Guerrero Rubio, Mª Alejandra; Gandía Herrero, Fernando; Escuela Internacional de Doctorado
La metodología biotecnológica desarrollada en esta Tesis Doctoral ha permitido estudiar las propiedades promotoras de la salud de diecisiete betalaínas individuales empleando el modelo animal Caenorhabditis elegans. Los resultados mostraron que los gusanos alimentados con betalaínas puras experimentaron un aumento en su tiempo de vida útil. El mecanismo molecular subyacente a este efecto se analizó usando cepas mutantes y realizando ensayos de microarrays a partir de extracción de ARN. Los resultados mostraron que las betalaínas modulan la expresión de daf-16 o skn-1, genes ortólogos a FOXO y Nrf2 humanos, respectivamente. En ambas especies, estos genes están involucrados en vías relacionadas con la longevidad y la resistencia al estrés oxidativo y conducen a la sobreexpresión de HSPs, proteínas involucradas en la resistencia al cáncer y al Alzheimer. Estos resultados pueden abrir nuevas líneas de investigación en la búsqueda de tratamientos efectivos basados en estas moléculas de origen vegetal
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Biotechnological Synthesis and Molecular Encapsulation of Natural Stilbenes and Lipophilic Derivatives for Biomedical and Food Applications
(Universidad de Murcia, 2024-07-15) Navarro Orcajada, Silvia; Matencio Durán, Adrián; López Nicolás, José Manuel; Escuela Internacional de Doctorado
Los estilbenos son compuestos fenólicos con numerosas bioactividades que los hacen de interés para la salud humana, como su actividad antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatoria, cardioprotectora, anticancerígena o anti-obesidad. Se trata de metabolitos secundarios producidos por determinadas plantas para protegerlas frente a situaciones de estrés biótico o abiótico, siendo la enzima estilbeno sintasa clave en este proceso de biosíntesis. Dentro de este grupo de compuestos bioactivos, destaca el resveratrol por ser el más investigado, sin embargo, existen otros estilbenos menos conocidos con mayor actividad. No obstante, la limitada producción, baja solubilidad en agua, facilidad para degradarse, así como baja biodisponibilidad de esta familia de compuestos bioactivos dificultan su correcta aplicación en la industria alimentaria, cosmética o farmacéutica. En esta Tesis Doctoral se han investigado varias estrategias con el objetivo de hacer frente a estas limitaciones mediante el empleo de diversas metodologías. Con el fin de abordar los problemas en la obtención de estilbenos naturales, se ha desarrollado un método para aumentar la síntesis enzimática de piceatanol y se ha optimizado la expresión de una nueva proteína estilbeno sintasa recombinante encontrada mediante análisis filogenéticos, los cuales también permitieron descubrir el origen y la evolución de estas proteínas en distintos reinos. Además, se caracterizaron y encapsularon algunos de los análogos del resveratrol más prometedores, logrando incrementar su solubilidad y estabilidad en disoluciones acuosas mediante complejos de inclusión con ciclodextrinas, determinando la estequiometria y las constantes de encapsulación, así como el tipo de ciclodextrina que formaba los complejos más estables. Por otra parte, para hacer frente a los problemas de biodisponibilidad de los estilbenos, se sintetizaron derivados hidrofóbicos de estilbenos que podrían actuar como precursores de estos para vehiculizarlos mejor a los tejidos diana. Los procesos de síntesis optimizados lograron rendimientos elevados con alta especificidad. Los derivados obtenidos fueron caracterizados fisicoquímicamente y encapsulados en ciclodextrinas para después analizar sus propiedades biológicas in vitro e in vivo. Se pudo observar que los derivados hidrofóbicos de estilbenos podían ser susceptibles de ser hidrolizados durante el proceso digestivo. No obstante, el uso de inhibidores contrarrestó eficazmente esta hidrólisis, ayudando a su mejor conservación. El efecto de la adición de agentes encapsulantes en este proceso también fue evaluado, caracterizando los complejos formados. En general, los derivados hidrofóbicos de estilbenos fueron más estables, menos metabolizables y más permeables que sus estilbenos originales, respaldando la modificación estructural de estilbenos. También se descubrió que las ciclodextrinas interfieren con los métodos de determinación de actividad antioxidante in vitro, pudiendo dar lugar a malinterpretaciones de actividad en su presencia. Esta interferencia parece estar causada por la encapsulación de los reactivos implicados en las reacciones. Por otra parte, se establecieron relaciones estructura-actividad entre la actividad citotóxica de varios análogos del resveratrol, permitiendo seleccionar aquellos estilbenos con un mayor potencial terapéutico. Los estudios in vivo con los derivados hidrofóbicos de estilbenos libres y/o encapsulados mostraron efectos beneficiosos sobre la obesidad y el cáncer, sin llegar a observarse efectos nocivos en los individuos tras su administración. Finalmente, se desarrollaron modelos de alimentos funcionales enriquecidos con uno de estos derivados, en su forma libre y encapsulada, monitorizando los parámetros de calidad y estabilidad del ingrediente bioactivo en distintas condiciones de almacenamiento, con el fin de evaluar la viabilidad de su aplicación en industria. En general, los resultados de esta Tesis Doctoral presentan distintos enfoques innovadores para abordar la problemática actual que restringe el uso de estilbenos, consiguiendo aumentar su producción, caracterización, solubilidad, estabilidad y biodisponibilidad, para poder ser utilizados de manera eficaz en biomedicina y en alimentación.
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Biotecnología y el modelo c. elegans en el laboratorio de compuestos bioactivos
(2019-05-17) OMEGA, FOTOS; Unidad de Cultura Científica
Conferencia enmarcada en las actividades de la Unidad de Cultura Científica en el Ámbito Cultural de El Corte Inglés a cargo del Dr. Fernando Gandía Herrero, Profesor del departamento de Bioquímica y Biología Molecular A de la Universidad de Murcia, investigador del grupo “Bioquímica y Biotecnología Enzimática”. En el grupo de investigación de “Bioquímica y Biotecnología Enzimática” de la Universidad de Murcia trabajamos en la caracterización de la ruta biosintética de pigmentos vegetales bioactivos, como las betalaínas, estudiando las enzimas clave y las reacciones que los producen. La aplicación biotecnológica de estos trabajos nos ha permitido pasar de plantas a biorreactores y contar con nuevas proteínas y con una librería de compuestos cuyas propiedades bioactivas han despertado un gran interés científico y aplicado.
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Biotecnología: ciencia al servicio de la sociedad
(2011-04-15) Urbina, Luis
Biotecnología: ciencia al servicio de la sociedad. Manuel Rey Barrera, Director Gerente de Newbiotechnic S.A. NBT. Facultad de Biología. Campus de Espinardo.
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-Biotecnología: New roles of T cells in bacterial clearance. Esteban Veiga Chacón. Centro Nacional de Biotecnología & Instituto Investigación Sanitaria Princesa. Hospital de Santa Cristina, Madrid. Aulario 1 Campus de Espinardo
(Servicio de Comunicación y Proyección Universitaria, 2014-02-25) Urbina, Luis
-Biotecnología: New roles of T cells in bacterial clearance. Esteban Veiga Chacón. Centro Nacional de Biotecnología & Instituto Investigación Sanitaria Princesa. Hospital de Santa Cristina, Madrid. Aulario 1 Campus de Espinardo
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Caracterización de la producción de compuestos bioactivos y análisis de proteínas en cultivos celulares de brócoli
(Universidad de Murcia, 2020-11-12) Sánchez Pujante, Pedro Joaquín; Almagro Romero, Lorena; Pedreño García, María Ángeles; Escuela Internacional de Doctorado
El consumo de brócoli se ha visto incrementado en todo el mundo debido a su alto valor nutritivo. Además, el brócoli contiene una compleja mezcla de compuestos bioactivos con actividad antioxidante, entre los que destacan los glucosinolatos y sus derivados, así como los compuestos fenólicos. Debido a los beneficios para la salud que presentan estos metabolitos secundarios, el objetivo principal de este trabajo de investigación fue la utilización de suspensiones celulares de brócoli para incrementar la producción de estos compuestos de interés. En primer lugar, se realizó una revisión sobre la biosíntesis, la regulación y las funciones biológicas de los glucosinolatos en las plantas. Además, se profundizó en las diferentes estrategias biotecnológicas para su obtención, principalmente las basadas en las técnicas de cultivo de plantas in vitro. Posteriormente, se utilizó la elicitación como estrategia para incrementar la producción de glucosinolatos en suspensiones celulares de brócoli y se analizaron los niveles de expresión de los genes que codifican enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis de los glucosinolatos en estas suspensiones celulares de brócoli bajo condiciones de elicitación. También se realizaron experimentos de elicitación modificando diferentes condiciones de cultivo, con el fin de determinar cuáles fueron las condiciones óptimas para incrementar la producción de glucosinolatos en las suspensiones celulares de brócoli. Otro de los objetivos propuestos en este trabajo de investigación fue analizar el efecto de los elicitores sobre el metabolismo antioxidante de las células de brócoli. Para ello, se realizaron medidas de la actividad de enzimas implicadas en el metabolismo antioxidante, así como el contenido en glutatión y los niveles de peroxidación de lípidos en las suspensiones celulares de brócoli sometidas a elicitación. Finalmente, se estudió el patrón de bandas de proteínas expresadas diferencialmente bajo condiciones de elicitación en células de brócoli mediante SDS-PAGE, con el fin de identificar proteínas relacionadas con la defensa vegetal. La principal conclusión obtenida de este trabajo de investigación fue que la elicitación de suspensiones celulares de brócoli con coronatina incrementó en gran medida la producción de glucosinolatos, constituyendo esta estrategia un sistema biotecnológico de producción de estos compuestos alternativo a la extracción tradicional de compuestos bioactivos a partir de materia prima vegetal. Además, la cantidad de sacarosa, junto con la composición nutricional del medio de cultivo, la densidad celular utilizada y la adición de triptófano como precursor de la ruta de biosíntesis, fueron factores clave que limitaron la producción de glucosinolatos en las suspensiones celulares de brócoli. Entre los efectos desencadenados por la coronatina sobre las suspensiones celulares de brócoli destacó el incremento en los niveles de expresión de genes implicados en la ruta de biosíntesis y la regulación de los glucosinolatos. En relación a los compuestos fenólicos, tanto la coronatina como el jasmonato de metilo fueron efectivos, ya que incrementaron la producción de estos compuestos bioactivos en las suspensiones celulares de brócoli. El incremento en la producción de compuestos bioactivos conseguido por el tratamiento con elicitores se correlacionó con alteraciones en las actividades enzimáticas implicadas en el metabolismo antioxidante y en el estado redox del glutatión. Estos resultados, combinados con el incremento observado en la peroxidación de lípidos, sugirieron que la elicitación con coronatina y jasmonato de metilo condujo al establecimiento de un estrés oxidativo moderado en las suspensiones celulares de brócoli. Además, el estrés oxidativo indujo la síntesis de una serie de polipéptidos relacionados con la defensa vegetal en las suspensiones celulares de brócoli.
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Caracterización de nuevas moléculas y enzimas que regulan los niveles de NAD+
(Universidad de Murcia, 2019-03-25) García Saura, Antonio Ginés.; Sánchez Ferrer, Álvaro; Escuela Internacional de Doctorado
En la Tesis Doctoral titulada “Caracterización de nuevas moléculas y enzimas que regulan los niveles de NAD+”, los objetivos fueron; el diseño de un método para la clasificación del gran número de nicotinamidasas presentes en las bases de datos; el desarrollo de un método para la producción biotecnológica de compuestos precursores del NAD+, usando una nueva NAD+ difosfatasa bacteriana; el estudio in silico y posterior caracterización de una nueva NAD+ difosfatasa no bacteriana; la caracterización de una poli-ADP-ribosa polimerasa bacteriana con alta eficiencia catalítica; y la caracterización de un macrodominio bacteriano, capaz de eliminar las modificaciones proteicas por polímeros de ADP-ribosa. Para la clasificación de los miembros de la familia de las nicotinamidasas, un nuevo patrón compatible con Prosite fue desarrollado. Este patrón basado en el sitio de unión a metal, común a todas las nicotinamidasas, permitió identificar más de diez mil secuencias. Basados en este patrón, otros cuatro nuevos patrones más específicos fueron desarrollados, incluyendo el tipo Firmicutes, Mycobacteria, Archaea y Multi-origen. La clasificación establecida en base al sitio de unión a metal correlaciona bien con la obtenida al considerar las secuencias completas, indicando este sistema como un método útil para la clasificación de nicotinamidasas. Para la producción de precursores de NAD+, una nueva NAD+ difosfatasa bacteriana fue purificada e inmovilizada en forma de BSA-CLEAs. El importante incremento en su estabilidad operacional y reusabilidad tras la inmovilización hicieron posible su aplicación para la producción de precursores de NAD+ (NMN). El uso combinado de esta enzima con una NMN deamidasa de E. coli, permitió una sencilla producción de NaMN. Este compuesto fue testado en dos líneas celulares diferentes de hepatocitos y adipocitos, produciendo un claro incremento en los niveles de NAD+. Siguiendo con el interés despertado por la producción de precursores de NAD+, una nueva NAD+ difosfatasa obtenida de hongos fue caracterizada bioquímicamente, tras un profundo estudio bioinformático. La enzima alcolófila, mostró una alta eficiencia catalítica, varias veces superior a la de las enzimas descritas en la bibliografía incluyendo las bacterianas, con excepción de la humana NUDT12. Sin embargo, la razón de eficiencia catalítica NAD+/NADH fue mayor en la enzima aislada en esta tesis que en la enzima humana, señalando el potencial biotecnológico de esta nueva enzima. La búsqueda de una nueva poli-ADP-ribosa polimerasa bacteriana condujo al descubrimiento de la enzima de Clostridioides difficile CD160 (CdPARP). Esta posee una alta actividad, que es tres veces superior a la de la enzima descrita de la bacteria Herpetosiphon auranticus. Además, se llevó a cabo un análisis filogenético de PARPs bacterianas, mostrando una organización de dominios atípica en CdPARP comparada con otras enzimas de clostridios. Esto puede ser debido a una larga divergencia de C. difficile CD160, relacionada con la presencia de un toxigenotipo único (A-B+CDT-). Este organismo tiene gran interés, debido a su capacidad de un metabolismo de PAR completo, apoyado no solo por una poli-ADP-ribosa polimerasa y una PAR glicohidrolasa, sino también por un macrodominio. El mayor hito de este estudio fue el descubrimiento de un nuevo inhibidor, altamente selectivo para la PARP1 humana. Finalmente, un nuevo macrodominio bacteriano de Fusobacterium mortiferum ATCC 9817 fue descrito, siendo el primero de origen bacteriano en pertenecer al tipo OARD1. Los macrodominios del tipo OARD1 se caracterizan por ser capaces de catalizar tres reacciones enzimáticas distintas, la desacetilación de OAADPr, de-MARilación y de-PARilación. La capacidad de este nuevo macrodominio para eliminar las modificaciones de poli-ADP-ribosa es de gran importancia, debido a que esta actividad solo ha sido descrita en un macrodominio humano (hOARD1).
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Caracterización del eyaculado del delfín mular (Tursiops truncatus) a través del estudio de la conservación y morfometría espermática, e identificación de proteínas en espermatozoides y plasma seminal
(Universidad de Murcia, 2023-12-21) Fuentes Albero, María del Carmen; García Vázquez, Francisco Alberto; Escuela Internacional de Doctorado
El delfín mular (Tursiops truncatus) es un mamífero acuático ampliamente conocido por su comportamiento social y su distribución global en los mares y océanos. Sin embargo, su hábitat natural se enfrenta a graves amenazas, principalmente debido a la actividad humana, como la contaminación de las aguas, la sobreexplotación de los recursos y la pesca ilegal. Así mismo, el calentamiento global está llevando a una reducción de los peces que conforman la dieta diaria de estos delfines, lo que requiere un mayor gasto de recursos fisiológicos para obtener alimento. Además de su presencia en su hábitat natural, el delfín mular es comúnmente alojado en zoológicos y acuarios en todo el mundo. Esto plantea el desafío de mantener la variabilidad genética en estas poblaciones en cautiverio para evitar la consanguineidad. En 2017, la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN) clasificó al delfín mular como vulnerable, lo que ha limitado su movimiento entre países. Esto ha destacado la necesidad de intercambiar muestras seminales entre centros para la conservación de esta especie. Por lo tanto, las técnicas de reproducción asistida (TRAs) se han tornado de gran interés en la conservación de esta especie y otros cetáceos. El objetivo general de la presente tesis doctoral ha sido analizar las características seminales y la funcionalidad espermática del delfín mular a través del estudio de su conservación, morfometría y composición proteica. Para alcanzar este propósito, se emplearon tres delfines mulares machos, todos maduros sexualmente, que residían en el Oceanogràfic de Valencia en España. Previamente, el personal de cuidadores y veterinarios especializados había entrenado a estos animales para colaborar en la obtención de muestras seminales de manera no invasiva, basándose en la disposición voluntaria de los propios delfines. En el Artículo 1, se llevaron a cabo experimentos para desarrollar un método de refrigeración espermática que permita mantener la viabilidad de los espermatozoides durante varios días, facilitando así el intercambio de muestras entre centros para programas de inseminación artificial. Los resultados indicaron que el semen de delfín mular puede refrigerarse durante al menos 7 días, manteniendo la funcionalidad de los espermatozoides, especialmente a una temperatura de 5°C y una concentración de 100x10⁶ espermatozoides/ml, manteniendo la calidad microbiológica de las muestras seminales. En el Artículo 2, se analizaron las características morfométricas de los espermatozoides de delfín mular. El análisis de componentes principales (PCA) reveló que cuatro componentes principales (PC) representaron más del 91% de la varianza acumulada determinados por los 13 parámetros morfométricos de los espermatozoides analizados, siendo PC1 el que proporcionó la mayor varianza explicada (47.21%), seguido por PC2 (25.65%), PC3 (11.17%) y PC4 (7.72%). Se identificaron principalmente dos subpoblaciones espermáticas con diferencias entre individuos, y se establecieron correlaciones, tanto positivas como negativas, entre la morfometría de los espermatozoides y los niveles de testosterona en sangre. Además, se observó que las principales diferencias morfométricas se debieron al tiempo de almacenamiento y no a la temperatura de almacenamiento. En el Artículo 3, se proporcionó un inventario de proteínas en el semen por primera vez en un cetáceo. Se identificaron un total de 722 proteínas diferentes perteneciendo 419 de ellas a los espermatozoides y 303 al plasma seminal, de las cuales 111 proteínas fueron comunes a ambos, espermatozoides y plasma seminal. Se compararon estos perfiles proteicos con el de otras especies (humano, bovino, canino), revelando proteínas comunes entre ellas. En conclusión, este estudio ha proporcionado una valiosa información sobre la conservación y características espermáticas del delfín mular, incluyendo aspectos morfométricos y proteicos. Estos hallazgos no solo son fundamentales para la conservación de esta especie, sino que también tienen implicaciones para mejorar las TRAs en mamíferos acuáticos en general.
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Caracterización estructural y funcional de proteínas quinasas C y su interacción con proteínas moduladoras y sustratos
(Universidad de Murcia, 2022-05-31) Baltanás Copado, Jesús; Gómez Fernández, Juan Carmelo; Corbalán García, Senena; Escuela Internacional de Doctorado
En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el análisis biofísico y estructural de importantes proteínas pertenecientes a la familia de las quinasas PKCs. Además, también se ha relacionado el estudio con proteínas con las que interaccionan, Fascin1, un importante sustrato de PKCα con un papel fundamental en la dinámica espaciotemporal dentro del citoesqueleto de F-actina y, por otra parte, una proteína con un papel fundamental en la localización celular en membrana de las PKCs, RACK1. Todo ello en conjunto con diversas combinaciones de aditivos (CaCl2, el éster de forbol P13A, ADP y MgCl2), que tienen importancia modulando la actividad de estas quinasas. Por medio de técnicas de cristalografía de rayos X y criomicroscopía electrónica, se realizó un amplio estudio de cribados de cristalización y preparación de rejillas de CryoEM para las quinasas PKCs junto con las proteínas moduladoras y sustratos anteriormente mencionados. Desafortunadamente, no se obtuvieron cristales con la presencia de alguna de las PKCs objeto de estudio ni datos por medio de CryoEM que permitiera la determinación estructural atómica o casi atómica de las proteínas PKCs. No obstante, a través de CryoEM conseguimos determinar condiciones preliminares, que resultaron en clasificaciones 2D en las que podíamos interpretar un posible modelo de interacción para el complejo PKCα-Fascin1 y con un gran potencial de poder determinar estructuralmente a nivel atómico dicho complejo mediante la mejora de la toma de datos inicial. También se realizaron diversas técnicas biofísicas tales como Thermal Shift Assay que permitieron inferir modos de unión diferentes para PKCα y Fascin1 dependiendo de la combinación de aditivos añadidos al medio. Por medio de SPR también se determinó que la mayor afinidad entre Fascin1 y PKCα se producía con la versión silvestre de Fascin1 junto con todos los aditivos que se probaron (CaCl2, el éster de forbol P13A y ADP-MgCl2). Estudios de tomografía por medio de CryoEM permitieron determinar la unión de Fascin1 a los filamentos de F-actina de forma discreta mediante el empleo de un mutante de Fascin1 que afecta a uno de los dos sitios principales de interacción con F-actina. En la actualidad, el proyecto se encuentra en una fase avanzada previa a la determinación estructural atómica de dicha interacción. Por otra parte, también se realizaron ensayos de rescate de fármacos que fueran capaces de interaccionar con el bolsillo de unión a PIP2 del dominio C2 de PKCα y que pudiera tener algún efecto en la capacidad de la quinasa en reconocer la membrana. Sin embargo, después de realizar ensayos biofísicos de FRET y sedimentación lipídica, así como ensayos celulares acoplados a microscopía confocal, no se consiguió asignar a ninguno de los fármacos un papel interfiriendo en la habilidad de la proteína reconociendo la membrana. No obstante, por medio de cristalografía de rayos X se determinó que uno de los compuestos estudiados era capaz de interaccionar con el bolsillo de unión al fosfoinosítido PIP2. A pesar de los enormes retos estructurales que presentan estas proteínas PKCs (asimetría, pequeño tamaño y la capacidad de adoptar múltiples conformaciones haciendo de ellas proteínas muy flexibles) y que hacen que hasta la fecha no haya información estructural completa para ninguna de sus isoformas, se ha conseguido obtener información de gran valor y con potencial de poder avanzar con el estudio estructural para acercarnos a la resolución atómica del complejo PKCα-Fascin1. Esto podría ayudar a resolver el gran problema que existe hoy día en el desarrollo de fármacos específicos de diana para esta familia de quinasas y así poder luchar contra el cáncer, una de las principales enfermedades en las que las proteínas PKCs se encuentran involucradas.
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Conferencia 'Biotecnología en Medicina'
(2011-05-06) Urbina, Luis
Conferencia 'Biotecnología en Medicina', a cargo de Pablo Escrivá. Salón de Grados de la Facultad de Biología. Campus de Espinardo.
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Conocimientos, actitudes e intereses de estudiantes de educación secundaria obligatoria y bachillerato hacia la biotecnología
(Universidad de Murcia, 2021-02-23) Ruiz González, Cristina; López Banet, Luisa; Ayuso Fernández, Enrique; Escuela Internacional de Doctorado
La biotecnología es un área de la ciencia con multitud de aplicaciones en diferentes ámbitos (médico, nutricional, medioambiental, industrial…) que generan bienes y servicios que el ser humano utiliza, pero que, en ocasiones, están relacionados con controversias sociocientíficas. Los estudiantes de educación secundaria deben adquirir durante su período de educación formal, conocimientos que les permitan comprender la ciencia que les rodea, es decir, una alfabetización científica y tecnológica. Pero no solo deberían adquirir conocimientos, sino también habilidades tales como la argumentación, que les ayuden a poder expresar y debatir adecuadamente su actitud o decisión ante determinadas situaciones relacionadas con la ciencia. OBJETIVOS Los principales objetivos de este trabajo son cuatro: conocer qué conocimientos tienen los estudiantes que se encuentran finalizando la ESO acerca de la genética; cuáles son los conocimientos de los estudiantes de 1º de Bachillerato sobre genética y las aplicaciones de la biotecnología y de qué manera están relacionados; y cuáles son los conocimientos, las actitudes e intereses de los estudiantes de 2º de Bachillerato sobre la biotecnología, así como la determinación de la correlación entre ambos. Finalmente, el cuarto objetivo se centra en estudiar cómo argumentan los estudiantes sus puntos de vista sobre la biotecnología y de qué manera emplean los conocimientos y actitudes anteriormente determinados. METODOLOGÍA Para los tres primeros objetivos de la investigación, se han empleado tres cuestionarios diferentes, elaborados para los diferentes fines de la investigación, y que fueron administrados a una muestra de estudiantes de 4º de ESO, 1º de Bachillerato y 2º de Bachillerato. El análisis de los cuestionarios se realizó empleando estrategias tanto cualitativas como cuantitativas, pero predominando estas últimas, con análisis estadísticos a partir del programa SPSS. Para el último objetivo de la investigación, se diseñaron cuatro entrevistas semiestructuradas sobre diferentes ámbitos de la biotecnología y fueron administradas a 20 estudiantes de 2º de Bachillerato. El análisis de los resultados de esta última parte, se llevó a acabo de manera cualitativa, empleando el programa Atlas.Ti. RESULTADOS Y CONCLUSIONES Los estudiantes de 4º de ESO tienen ideas acerca de algunas nociones relacionadas con la Herencia Biológica, a pesar de no haberlos estudiado antes. Estos puntos de vista podrían ser construidos por influencias extraescolares y algunos conocimientos desarrollados en el ámbito educativo (la célula, por ejemplo). Aunque algunas de estas ideas coinciden con las correctas, muchas se alejan del pensamiento científico y la mayoría se mantienen después de la enseñanza de estos contenidos. En 1º de Bachillerato, hay conocimientos básicos sobre genética para poder comprender a nivel elemental las aplicaciones de la biotecnología, que son mejorables. Además, en este ámbito, los estudiantes muestran escasos conocimientos (en cuanto al número de aplicaciones que son capaces de identificar y también, a la naturaleza de las mismas, incluso de aquellas socialmente más divulgadas). Por otra parte, los institutos de enseñanza secundaria con mejores conocimientos de genética y de las aplicaciones de la biotecnología, no siempre coinciden. Los estudiantes de 2º de Bachillerato conocen algunas aplicaciones biotecnológicas, pero aún presentan errores importantes que muestran que hay conceptos que no trasfieren del aprendizaje en genética que han realizado previamente, a la biotecnología, lo cual va a dificultar que profundicen en las aplicaciones biotecnológicas más allá de citar los típicos ejemplos que suelen presentarse en los libros de texto. Con respecto a las actitudes, destacamos que estas dependerán no solo de la aplicación y el propósito de la misma, sino también del tipo de organismo involucrado. Los estudiantes de nuestra muestra no están demasiado informados sobre biotecnología a través de los medios de comunicación, pero creen que les será útil en el futuro. Por último, aunque parece que sí hay correlación, es enormemente complejo determinar las relaciones entre conocimiento, actitud e interés porque se trata de constructos multidimensionales, determinados por factores cognitivos, afectivos y conductuales. En cuanto a la argumentación en biotecnología, es muy escaso el número de veces en las que los estudiantes aportan argumentos a favor y contra mostrando la contraposición y el contraste de ideas para finalmente posicionarse de cierta manera. Por el contrario, parece que una decisión del estudiante, suele estar asociada a una única justificación (pro o contra), de tipo cognoscitivo o actitudinal, o ambos (en ocasiones utilizan uno, pero llevan implícito el otro).
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Control asistido por magnetismo de ovocitos y embriones a través de nanopartículas unidas a la zona pelúcida
(Universidad de Murcia, 2024-11-08) Garrappa, Gabriela; García Vázquez, Francisco A.; Jíménez Movilla, María; Escuela Internacional de Doctorado
El uso de nanopartículas (NP) para aplicaciones biomédicas ha crecido enormemente en las últimas décadas. Entre estos, los desarrollos nanotecnológicos destinados a su aplicación en tecnologías de reproducción asistidas (TRA) se destacaron. A pesar de los importantes avances en este campo, aún no ha sido superada una de las mayores limitaciones de estas tecnologías: la necesidad de manipular los ovocitos y embriones de manera extremadamente delicada y precisa. El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue el desarrollo de un novedoso sistema para la manipulación de ovocitos y embriones mediante el uso de NP con capacidad de ser atraídas magnéticamente, utilizando como enlace con la zona pelúcida (ZP) a la proteína oviductina (OVGP1) y el análisis de la seguridad de su aplicación en TRA. En primer lugar, se evaluó la unión de NP superparamagnéticas con la OVGP1 (NPOv) y se analizó la estabilidad de esta unión. La exitosa conjugación fue confirmada, así como su estabilidad por hasta 31 días después de la conjugación. A continuación, se confirmó la capacidad del complejo NPOv de adherirse específicamente a la parte externa de la ZP de ovocitos madurados in vitro y a embriones producidos in vitro en diversos estadios de desarrollo (4 células, mórulas y blastocistos). En un siguiente estudio se evaluó la viabilidad de gametos y embriones en presencia de NPOv. Para ello, se trabajó primero con el biomodelo porcino en condiciones in vitro donde tras la exposición de gametos a NPOv evaluamos su actividad metabólica mediante un analizador de flujo extracelular, los efectos sobre espermatozoides mediante análisis de parámetros de calidad espermática, los efectos sobre la ZP de mediante el estudio del tiempo de digestión por proteasas, los efectos sobre la capacidad fecundante y sobre el desarrollo embrionario mediante un protocolo de Fecundación in vitro (FIV) y Cultivo embrionario in vitro (CE). Los resultados demostraron la ausencia de efectos de las NPOv sobre vialidad de gametos y desarrollo embrionario. Demostrada la ausencia de efectos sobre gametos y embriones porcinos in vitro, continuamos con el análisis de seguridad biológica sobre el biomodelo conejo. Se analizó el efecto de las NPOv unidas a embriones sobre el desarrollo embrionario in vitro, se estudió el efecto de la presencia de embriones con NPOv in vivo en oviducto y útero de coneja tras su transferencia. Adicionalmente se analizó la respuesta del tejido oviductal y uterino a la presencia de embriones con NPOv. Los resultados demostraron que no hubo efectos de la presencia de embriones con NPOv en el desarrollo embrionario tanto in vitro como in vivo, ni sobre la tasa de implantación y la tasa de nacidos vivos, ni su peso al nacimiento. Además, no se observaron efectos de la presencia de embriones con NPOv sobre el tejido oviductal ni uterino. Confirmada la inocuidad de las NPOv, se continuó con la validación de su aplicación para la manipulación de ovocitos y embriones. Primero, evaluamos la capacidad de ovocitos y embriones con NPOv de ser atraídos por un campo magnético. Los resultados demostraron que una tanto ovocitos como embriones fueron atraídos en un porcentaje cercano al 90%. Además, se observó que esta tecnología produce la atracción diferencial de ovocitos maduros por sobre los inmaduros. Seguidamente, analizamos el efecto del campo magnético sobre la viabilidad de ovocitos con NPOv tras someterlos a un protocolo de FIV y CE. Se analizó la viabilidad de embriones obtenidos mediante la secuenciación de su ARN. Adicionalmente, el estado oxidativo fue evaluado en ovocitos- NPOv atraídos y en embriones a mediante el estudio de genes relacionados con estrés oxidativo. Los resultados demostraron que no hubo efectos de las NPOv ni del campo magnético sobre los paramaros analizados (tasa de desarrollo embrionario, transcriptoma de los embriones obtenidos, genes relacionados a estrés oxidativo y la intensidad de ROS en ovocitos). En resumen, esta tesis doctoral ha desarrollado y validado una herramienta robusta e inocua, basada en la funcionalización de NP magnéticas con una proteína recombinante que actúa de nexo especifico con la ZP de ovocitos y embriones. Este trabajo ha demostrado que el sistema puede ser utilizado de manera segura para la manipulación ovocitos y embriones mediante campos magnéticos, permitiendo su direccionamiento y/o posicionamiento. Esta novedosa herramienta tiene un gran potencial en las TRA, para su aplicación en diferentes especies
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Criopreservación espermática en la especie porcina : optimización de la técnica
(2014-06-04) Martínez Alborcia, María José; Roca Aleu, Jorge; Parrilla Riera, Inmaculada; Facultad de Veterinaria
La inseminación artificial (IA) es una biotecnología ampliamente utilizada en la industria porcina, jugando un papel fundamental en la mejora de la productividad. Idealmente, los programas de IA en porcino, deberían utilizar espermatozoides congelados-descongelados dadas las ventajas adicionales que poseen en comparación con el semen refrigerado, en particular las relacionadas a la bioseguridad y comercio internacional. Sin embargo, los espermatozoides congelados-descongelados se utilizan con poca frecuencia en los programas de IA porcina comerciales debido a su menor eficiencia con respecto al semen refrigerado, ya que se requieren más espermatozoides por dosis de IA alcanzando por lo general peores resultados de fertilidad. La razón biológica de este hecho está relacionada con la gran sensibilidad de los espermatozoides porcinos a la criopreservación. Además, los espermatozoides que sobreviven a dicho proceso, poseen una vida funcional más corta. El principal objetivo de esta Tesis es el de optimizar el protocolo de criopreservación de espermatozoides de porcino con el fin de mejorar la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación. Para ello, se han desarrollado los siguientes estudios. En el primer estudio, se evaluó el impacto de los espermatozoides no funcionales presentes en los eyaculados de porcino sobre la capacidad de los espermatozoides funcionales para soportar el proceso de criopreservación. Para ello, se congelaron 15 fracciones ricas (FR) de 5 machos fértiles con diferentes proporciones de espermatozoides no funcionales (0- muestra de semen nativa, 25, 50 y 75 %). Tras la descongelación, se evaluaron los espermatozoides mótiles y viables que se recuperaron, así como la funcionalidad espermática en términos de fluidez de membrana de plasmática y producción intracelular de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS) en condiciones de capacitación in vitro. Además, se evaluó la peroxidación lipídica de la membrana plasmática mediante la medición indirecta de la producción de malondialdehído (MDA). Tanto la motilidad (evaluada mediante sistema CASA) como la viabilidad espermática normalizadas (evaluada mediante citometría de flujo y triple tinción de los espermatozoides con Hoechst 33342, H-42; yoduro de propidio, PI, y aglutinina de cacahuete conjugado con fluoresceína, PNA-FITC) fueron menores (p<0’01) cuanta mayor proporción de espermatozoides no funcionales había en las muestras seminales antes de la congelación, independientemente del verraco. Sin embargo, la magnitud del efecto fue diferente (p<0’01) entre los verracos. Las muestras de semen con la mayor subpoblación de espermatozoides no funcionales antes de la congelación mostraron los mayores (p<0’01) niveles de MDA tras la descongelación. En cuanto a la funcionalidad de los espermatozoides supervivientes a la descongelación, la muestra con 75 % de espermatozoides no funcionales antes de la congelación tuvo una generación intracelular de ROS (evaluada con 5-(y-6) clorometil-20,70-dichlorodihydrofluorescein éster acetil diacetato; CM-H2DCFDA) más alta (p<0’01) y un aumento (p<0’01) de la fluidez de la membrana espermática (Merocianina 540, M540) con respecto a la muestra control. El objetivo del segundo estudio fue determinar si los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen antes y durante la congelación influyen en la capacidad de fertilización in vitro (FIV) de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. Usando el mismo diseño experimental que en el estudio anterior, se prepararon y criopreservaron 4 muestras de semen procedentes de 15 FR con las mismas proporciones de espermatozoides no funcionales. Tras la descongelación, las muestras seminales fueron centrifugadas con PorciPureTM. La concentración (evaluada usando un Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) y viabilidad espermática (evaluada del mismo modo que en el estudio anterior) de cada pellet de espermatozoides fueron evaluadas para calcular la cantidad de espermatozoides viables totales en cada muestra de semen tras la centrifugación. La funcionalidad de los espermatozoides, en términos de generación intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear (Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), se evaluó antes y después de la centrifugación con el gradiente de PorciPureTM en condiciones de capacitación in vitro. La capacidad de FIV espermatozoides supervivientes al proceso de criopreservación se evaluó se evaluó de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma) y del desarrollo embrionario. Un total de 1.041 ovocitos madurados in vitro fueron inseminados utilizando un número fijo de espermatozoides viables purificados con PorciPureTM (ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1), independientemente de los diferentes porcentajes de espermatozoides no funcionales de las muestras. El desarrollo embrionario se evaluó a los 2 y 7 días después de la inseminación mediante la tasa de división (porcentaje de ovocitos divididos a 2-4 células/total cigotos putativos cultivados) y la formación de blastocistos (porcentaje de blastocistos/total cigotos putativos cultivados), respectivamente. El número total de células de los blastocistos resultantes se evaluó por tinción de los blastocistos con H-42. Los resultados revelaron que una alta proporción de espermatozoides no funcionales en muestras de semen antes y durante la congelación inducen un aumento (p <0’001) de la generación de intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear en espermatozoides congelados-descongelados. Estos cambios funcionales resultaron en bajas proporciones (p <0’01) de ovocitos penetrados y embriones desarrollados in vitro. En el tercer estudio, se evaluó la eficacia de la selección de espermatozoides usando un gradiente de centrifugación de una sola capa (Single Layer Centrifugation; SLC) antes de la congelación sobre la supervivencia espermática. Para ello, 24 FR recogidas de 24 verracos, se dividieron en 2 grupos en función de sus características seminales iniciales (concentración, morfología, motilidad y viabilidad espermática): estándar (n = 15) y sub-estándar (n = 9). Las muestras seminales de cada FR se dividieron en 2 alícuotas, una permaneció sin tratar (muestras control) y la otra se centrifugó con el gradiente de una sola capa (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 mL de Androcoll-P-Large® (muestras SLC). El rendimiento de espermatozoides totales, motiles (evaluados mediante CASA) y viables (evaluados mediante citometría como se mencionó anteriormente) después de SLC fue mayor (p<0’05) en las muestras estándar que en las sub-estándar. Las muestras de semen fueron criopreservadas. Tras la descongelación, la motilidad y viabilidad espermáticas fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control, independientemente de las características iniciales eyaculado. Además, los espermatozoides descongelados de las muestras SLC fueron más resistentes (p<0’05) a la peroxidación lipídica (Bioxytech MDA - 586 Kit de ensayo) que los de las muestras de control. El tratamiento con SLC también influyó en la funcionalidad de los espermatozoides descongelados bajo condiciones de capacitación in vitro. El porcentaje de espermatozoides viables que mostraron alta fluidez de membrana fue menor (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control. Los espermatozoides descongelados de las muestras SLC generaron menor (p<0’05) cantidad de ROS que los de las muestras control en los eyaculados sub-estándar. El objetivo del cuarto estudio experimental fue el de evaluar la idoneidad y eficacia de SLC, empleando el coloide Androcoll-P-XL®, como un procedimiento de rutina para la selección de los espermatozoides funcionales de los eyaculados de porcino para la criopreservación. Trece FR (una por verraco) se dividieron en tres alícuotas. Dos alícuotas de 15 y 150 mL se centrifugaron (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 y 150 mL (v/v) de Androcoll-P-Large® y Androcoll-P-XL®, respectivamente. La tercera alícuota se mantuvo sin procesa (control). Tras la centrifugación, los porcentajes de espermatozoides morfológicamente normales y con motilidad rápida y progresiva (CASA) fueron mayores (p<0’01) tras en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll -P® utilizado. Sin embargo, el porcentaje de espermatozoides con ADN nuclear fragmentado fue menor (p<0’01) en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll-P® utilizado. Las tasas de recuperación de espermatozoides totales, mótiles, viables y morfológicamente normales oscilaron entre el 20 y 100 %, mientras que los porcentajes de espermatozoides con ADN nuclear intacto oscilaron entre el 60 y 100 %, con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la SLC, las muestras espermáticas fueron criopreservadas. Tras la descongelación, los porcentajes de espermatozoides mótiles, viables y con ADN nuclear intacto, fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en el control con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la descongelación, se inseminaron 679 ovocitos madurados in vitro con un ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1. La SLC también mejoró (p<0’01) la capacidad de FIV de los espermatozoides congelados-descongelados, evaluada de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma). Sin embargo, no hubo ningún efecto de SLC sobre capacidad in vitro de los cigotos putativos para desarrollar a blastocistos. Tras todo lo anteriormente expuesto, podemos concluir que: Los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen de porcino antes de la congelación influyen negativamente en la congelabilidad de los espermatozoides funcionales. Lo cual se evidencia por una reducción en la proporción de espermatozoides funcionales recuperados tras la descongelación y por una menor capacidad fecundante y habilidad para desarrollar embriones in vitro por los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. La selección espermática mediante el gradiente de centrifugación de una sola capa Androcoll-P® utilizado antes de la congelación, mejora la congelabilidad espermática y la capacidad fecundante de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. Artificial insemination (AI) is extensively used by swine producers worldwide, playing a pivotal role in the improvement of herd productivity. Ideally, swine AI-programs should use frozen-thawed (FT) sperm, given its additional advantages compared to liquid-stored semen, particularly those concerning international trade and biosecurity. However, FT-sperm are infrequently used in commercial swine AI programs because of their lower efficiency with respect to liquid-stored semen; more FT-spermatozoa are required per AI dose to achieve typically lower fertility outcomes. The biological reason for the large number of spermatozoa required per AI dose is related to the high cryosensitivity of boar spermatozoa. In addition, the spermatozoa that survive the cryopreservation process exhibit an impaired and shortened functional lifespan. Therefore, this thesis was designed to optimize the boar sperm cryopreservation protocol in order to improve the sperm survival after thawing. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the impact of non-functional spermatozoa on the cryopreservation success of functional spermatozoa was assessed. Fifteen sperm-rich ejaculate fractions (SREF) collected from 5 fertile boars were frozen (following a standard 0.5-mL straw freezing protocol) with different proportions of induced non-functional sperm (0-native semen sample-, 25, 50 and 75% non-functional spermatozoa). After thawing, the recovery of motile and viable spermatozoa was assessed, and the functional of the spermatozoa was evaluated from plasma membrane fluidity and intracellular reactive oxygen species (ROS) generation upon exposure to capacitation conditions. In addition, the lipid peroxidation of the plasma membrane was assessed by the indirect measurement of malondialdehyde (MDA) generation. The normalized (with respect to a native semen sample) sperm motility (assessed by CASA) and viability (cytometrically assessed after staining with Hoechst 33342, H-42; propidium iodide, PI; and fluorescein-conjugated peanut agglutinin, PNA-FITC) decreased (p<0.01) as the proportion of functional spermatozoa in the semen samples before freezing decreased, irrespective of the semen donor. However, the magnitude of the effect differed (p<0.01) among boars. Moreover, semen samples with the largest non-functional sperm subpopulation before freezing showed the highest (p<0.01) levels of MDA after thawing. The thawed viable spermatozoa of semen samples with a high proportion of non-functional spermatozoa before freezing were also functionally different from those of samples with a low proportion of non-functional spermatozoa. These differences consisted of higher (p<0.01) levels of intracellular ROS generation (assessed with 5-(and-6) chloromethyl-20,70-dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester; CM-H2DCFDA) and increased (p<0.01) membrane fluidity (assessed with Merocyanine 540, M540). The objective of the second study was to evaluate the impact of non-functional spermatozoa on the in vitro fertilization (IVF) ability of FT-spermatozoa. Using the same experimental approach as the previous study, 4 sperm semen samples from 15 SREF with the same different proportions of induced non-functional sperm were also prepared and cryopreserved following the protocol indicated above. After thawing, the semen samples were centrifuged with PorciPureTM Bottom Layer. The sperm concentration (measured using a Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) and viability (as indicated in the previous study) of each sperm pellet were assessed to calculate the total viable sperm count in each semen sample. The functionality of the spermatozoa, in terms of intracellular ROS generation and nuclear DNA fragmentation (sperm chromatin dispersion test; Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), was assessed before and after the PorciPureTM centrifugation gradient in sperm samples incubated under capacitating conditions. The IVF ability of cryosurviving spermatozoa was assessed according to oocyte fertilisation (2 pronuclei and a sperm tail inside of the ooplasm) and embryo development. A total of 1,041 in vitro-matured oocytes were inseminated using a fixed number of PorciPureTM-purified viable spermatozoa (viable sperm: oocyte ratio of 300:1), regardless of the differing percentages among the 4 semen samples (native, 25 %, 50 %, and 75 % non-functional spermatozoa). Embryo development was evaluated at 2 and 7 days after insemination by the assessment of the cleavage rate (percentage of oocytes divided to 2–4 cells/total putative zygotes cultivated) and blastocyst formation (percentage of blastocyst/total putative zygotes cultivated), respectively. The total cell number of the resulting blastocysts was evaluated by staining the blastocysts with H-42. The results revealed that high proportions of dead spermatozoa in raw semen samples before and during freezing induce (p<0.001) increased ROS generation and nuclear DNA fragmentation in frozen-thawed spermatozoa. These dysfunctional changes resulted in low ratios (p<0.01) of in vitro penetrated oocytes and healthy developing embryos. The effectiveness of sperm selection using single-layer centrifugation (SLC) prior to freezing on the sperm cryosurvival of boar ejaculates was evaluated in the third study. Twenty-four SREF, collected from 24 boars, were divided into 2 groups according to their initial semen traits: standard (n=15) and substandard (n=9). Semen samples from each SREF were split in 2 aliquots, one remained untreated (control samples) and the other was single-layer centrifuged (500 g for 20 min) using 15 mL of Androcoll-P-Large® (SLC-samples). The yield of total, motile (assessed by CASA) and viable (cytometrically evaluated as mentioned above) sperm after SLC was higher (p<0.05) in standard than substandard semen samples. The semen samples were cryopreserved using a standard 0.5-mL straw freezing protocol. Post-thaw sperm motility and viability were higher (p<0.05) in SLC than in control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Additionally, thawed spermatozoa from SLC samples were more resistant (p<0.05) to lipid peroxidation (BIOXYTECH MDA-586 Assay Kit) than those from control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. The SLC-treatment also influenced the functionality of thawed spermatozoa undergoing an in vitro capacitation process. The percentage of viable sperm showing high membrane fluidity (assessed with M540) was lower (p<0.05) in the SLC than in the control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Thawed viable spermatozoa of SLC samples generated less (p<0.05) reactive oxygen species (assessed with CM-H2DCFDA) than those of control samples in the substandard ejaculates. The objective of the fourth experimental study was to evaluate the suitability and effectiveness of SLC as a routine procedure for selecting boar spermatozoa for cryopreservation. Thirteen sperm rich ejaculate fractions (one per boar) were split into three aliquots. Two aliquots of 15 and 150 mL were SLC-processed (500 g for 20 min) using 15 and 150 mL (v/v) of Androcoll-P-Large® and Androcoll-P-XL®, respectively. The third aliquot remained un-processed as a control. The percentages of spermatozoa that were morphologically normal and showed rapid and progressive motility (assessed by CASA) spermatozoa were higher (p<0.01) and those with fragmented nuclear DNA were lower (p<0.01) after SLC than control semen samples, regardless of the Androcoll-P® used. The recovery rates of total, motile, viable (flow cytometric evaluated after staining with H-42, PI and FITC-PNA) and morphologically normal spermatozoa ranged between 20 and 100% and those with intact nuclear DNA ranged between 60 and 100%, irrespective of the Androcoll-P® used. Thereafter, the semen samples were cryopreserved as mentioned above. Post-thaw percentages of sperm motility, viability and intact nuclear DNA were higher (p<0.05) in SLC-processed than in control semen samples, irrespective of the Androcoll-P® used. SLC-processing also improved (p<0’01) the IVF ability of FT-sperm (679 in vitro matured oocytes inseminated with a viable sperm:oocyte ratio of 300:1 following the same procedure mentioned above), measured as the percentage of penetrated oocytes and the mean number of swollen sperm heads and/or male pronuclei in penetrated oocytes. However, there was no effect of SLC-processing on the in vitro ability of putative zygotes to develop to blastocysts. The results achieved in these four experimental studies have generated the following conclusions: Non-functional spermatozoa present in boar semen samples before freezing negatively influence the cryopreservation of functional spermatozoa by reducing the proportion of recovered surviving spermatozoa after thawing and also by altering the functional and fertilisation ability of the sperm that survive the cryopreservation process. Single Layer Centrifugation prior to freezing improves the boar sperm cryopreservation and post-thaw fertilisation ability of cryosurvival spermatozoa. However, further studies aimed at optimising the yield of SLC procedure are needed.

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