Browsing by Subject "Biosíntesis"

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    Biosynthesis, production and biological activity of singular betalain pigments
    (Universidad de Murcia, 2022-07-13) Henarejos Escudero, Paula; Gandía Herrero, Fernando; García Carmona, Francisco; Escuela Internacional de Doctorado
    Tradicionalmente se ha considerado que la unidad estructural que compartían todas las betalaínas era el ácido betalámico, el cual se obtiene tras la ciclación espontánea de 4,5-seco-DOPA, molécula resultante de la acción de la enzima 4,5-DOPA-extradiol-dioxigenasa (DODA) sobre el aminoácido aromático L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). Sin embargo, los trabajos realizados en esta Tesis Doctoral cambian este paradigma, mostrando una nueva unidad estructural y descubriendo fuentes alternativas de pigmentos betalámicos singulares. Los objetivos de esta Tesis fueron: 1- Búsqueda de fuentes alternativas de betalaínas en plantas. 2- Caracterización fisicoquímica de nuevas betalaínas y estudio de sus rutas biosintéticas. 3- Desarrollo de procesos biotecnológicos para la producción de betalaínas, tanto con estrategias microbiológicas como de origen vegetal. 4- Caracterización del potencial promotor de la salud de betalaínas singulares en el modelo animal Caenorhabditis elegans. En la búsqueda de nuevas fuentes de betalaínas, los pigmentos de Dionaea muscipula Ellis, también conocida como Venus atrapamoscas, fueron estudiados. El establecimiento inequívoco de antocianinas en D. muscipula apoya la exclusión de la familia Droseraceae del orden Caryophyllales desde un punto de vista fitoquímico y su inclusión en el orden Nepenthales. Se han establecido las condiciones para el desarrollo de líneas de callos de Chenopodium quinoa en medio sólido que producen diferentes betalaínas. Indicando que el aumento de la hormona 6-benzilaminopurina y la disminución de nitrógeno en el medio de cultivo son factores clave para activar la ruta biosintética de las betalaínas. La detección de dos betaxantinas derivadas de dopamina en granos de quinua abrió la posibilidad de la existencia de múltiples pigmentos derivados de dopamina en la naturaleza. Probablemente ocultos como compuestos menores en los registros de HPLC de plantas. Se ha descrito una nueva ruta biosintética capaz de producir betalaínas descarboxiladas in planta, como se ha demostrado en C. quinoa. La enzima clave en la ruta derivada de dopamina es una 4,5-extradiol-dioxigenasa (DODA) que escinde el anillo de esta amina, y que se ha caracterizado a nivel cinético y molecular. La proteína es una enzima dual y expresa actividad frente a los sustratos de relevancia fisiológica, L-DOPA y dopamina. Con la sola expresión de la enzima DODA, se reprodujo biotecnológicamente el perfil de betalaínas presentes de forma natural en los granos de quinua. Esto se considera una clara demostración de la simplicidad de la ruta biosintética, propuesta con forma cuadrada, necesaria para producir los pigmentos. Se ha descubierto, descrito y caracterizado toda una nueva familia de betalaínas, las 6-descarboxibetalaínas. Todos los miembros caracterizados presentan propiedades de color similares y una fuerte fluorescencia. Sin embargo, las doce betalaínas descarboxiladas estudiadas en esta Tesis presentan diferentes comportamientos in vivo en ensayos de capacidad antioxidante y promotora de la salud en el animal modelo Caenorhabditis elegans. Además, se ha estudiado el potencial de las 6-descarboxibetalínas como moléculas antiagregantes de β-amiloide in vitro. Cuatro betalaínas descarboxiladas han mostrado resultados prometedores con valores IC50 en el rango micromolar, de posible interés en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Alzheimer. También se ha estudiado como betalaínas carboxiladas tradicionales y extractos naturales reducen el crecimiento tumoral in vivo y amplían la vida media del modelo tumoral de Caenorhabditis elegans (gld-1). La molécula más eficaz en la reducción del tamaño tumoral es la L-triptófano-betaxantina. Las betalaínas actúan no solo como antioxidantes, sino también regulando el factor de transcripción DAF-16. Así, las betalaínas se revelan como potenciales fitoquímicos anticancerígenos, de posible importancia en las estrategias de quimioprevención y tratamiento. Profundizando en esta actividad, se han diseñado nuevas betaxantinas que parten de L-triptófano-betaxantina como molécula líder. Los nuevos pigmentos se han producido biotecnológicamente y se han caracterizado sus propiedades. Todos estos nuevos pigmentos muestran una reducción significativa del tamaño de las gónadas tumorales en C. elegans (gld-1).
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    Biotechnological production of antioxidant pigments betalains and evaluation of their functional capacity in the in vivo model Caenorhabditis elegans
    (Universidad de Murcia, 2020-10-01) Guerrero Rubio, Mª Alejandra; Gandía Herrero, Fernando; Escuela Internacional de Doctorado
    La metodología biotecnológica desarrollada en esta Tesis Doctoral ha permitido estudiar las propiedades promotoras de la salud de diecisiete betalaínas individuales empleando el modelo animal Caenorhabditis elegans. Los resultados mostraron que los gusanos alimentados con betalaínas puras experimentaron un aumento en su tiempo de vida útil. El mecanismo molecular subyacente a este efecto se analizó usando cepas mutantes y realizando ensayos de microarrays a partir de extracción de ARN. Los resultados mostraron que las betalaínas modulan la expresión de daf-16 o skn-1, genes ortólogos a FOXO y Nrf2 humanos, respectivamente. En ambas especies, estos genes están involucrados en vías relacionadas con la longevidad y la resistencia al estrés oxidativo y conducen a la sobreexpresión de HSPs, proteínas involucradas en la resistencia al cáncer y al Alzheimer. Estos resultados pueden abrir nuevas líneas de investigación en la búsqueda de tratamientos efectivos basados en estas moléculas de origen vegetal
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    Estudio de procesos de biosíntesis enzimática de ésteres aromáticos para su uso en cosméticos naturales
    (Universidad de Murcia, 2019-11-12) Sánchez Martínez, Arturo; Hidalgo Montesinos, Asunción María; Bódalo Santoyo, Antonio; Escuela Internacional de Doctorado
    Esta Tesis Doctoral, como hipótesis de partida, se basa en el hecho de que es posible realizar la síntesis biocatalítica de diferentes aditivos aromáticos, mediante procesos más respetuosos con el medio ambiente, para su uso en productos cosméticos que puedan ser clasificados como “naturales”. Asimismo, este estudio aborda modelos cinéticos para las reacciones implicadas, y, conjuntamente, establecer un método sistemático para determinar las cinéticas de los procesos, y entender los mecanismos mediante los cuales transcurre la reacción de síntesis enzimática. Para ello, se han seleccionado como aromas principales de este estudio el acetato de 2-feniletilo, que se relaciona con el aroma de rosas, y el acetato de 1-fenietilo, por su relación con el aroma de gardenia. Ambos acetatos se sintetizan enzimáticamente mediante reacciones de transesterificación. Los objetivos específicos de esta Tesis Doctoral son: - Seleccionar un dispositivo experimental donde alcanzar la síntesis de ésteres aromáticos mediante transesterificación enzimática. - Estudiar la influencia de los reactivos y biocatalizadores comerciales en la obtención de estos aromas. - Para los sistemas enzima/sustrato que hayan proporcionado buenos resultados, estudiar la influencia en el rendimiento de la reacción de las variables de operación más importantes del sistema. - Proponer modelos cinéticos que predigan el avance de las reacciones con el tiempo, ajustando los datos experimentales a tales modelos. - Realizar los estudios cinéticos correspondientes con el fin de obtener los parámetros cinéticos que posibiliten la simulación del sistema a otros niveles. Para la consecución de estos objetivos específicos, la metodología empleada en esta investigación se ha desarrollado en tres niveles. En un nivel teórico-conceptual, se han desarrollado todas las actividades que corresponden con las fases del planteamiento de la investigación y de la formulación de las hipótesis de partida. Este nivel concluye con la planificación del trabajo a realizar en los niveles siguientes. En un nivel técnico-metodológico, se desarrollan las actividades realizadas en el laboratorio con la finalidad de obtener una recopilación de datos experimentales. Las actividades realizadas en este nivel están expuestas en dos grupos, las correspondientes al método operativo de los ensayos a realizar, y las correspondientes al método analítico de los mismos, para obtener la información necesaria de ellos. En un nivel estadístico-analítico, se desarrollan las actividades que conllevan el tratamiento estadístico de los datos obtenidos para analizar, estudiar y obtener las conclusiones de la investigación. En base a los resultados obtenidos, se plantea y contrasta un modelo cinético que permita ajustar los datos teóricos a los datos experimentales conseguidos. Las conclusiones más importantes recogidas en esta Tesis Doctoral son las siguientes: - El reactor tanque discontinuo, es un dispositivo experimental adecuado para la biosíntesis de los ésteres acetato de 2-feniletilo y acetato de 1-feniletilo. - El derivado inmovilizado comercial Novozym® 435 presenta los mejores resultados en la síntesis de ambos ésteres, para las condiciones estudiadas. - Bajo las mismas condiciones de reacción, la síntesis de acetato de 2-feniletilo presenta mejores resultados que la síntesis de acetato de 1-feniletilo. También se ha estudiado el efecto de la concentración del catalizador sobre la conversión obtenida. - Un modelo cinético basado en la ecuación de velocidad para el mecanismo Bi Bi Ping-Pong, permite obtener una ecuación simplificada que predice el avance de la reacción en función del tiempo. - Se han obtenido los conjuntos de constantes cinéticas intrínsecas más importantes en la síntesis por transesterificación enzimática de estos dos ésteres. - Ha sido posible ajustar los datos experimentales a la ecuación propuesta presentando buenos coeficientes de correlación. - La ecuación completa del modelo cinético permite la simulación del proceso para entender mejor como influyen las variables más importantes del sistema. This Doctoral Thesis is based on the hypothesis that it is possible to perform the biocatalytic synthesis of different aromatic additives to be used in what might be classified as “natural” cosmetic products by means of more environmentally friendly processes. In addition, this study proposes a kinetic model for the reactions involved, and aims to establish a systematic method to determine the kinetics of the process and understand how the enzymatic synthesis reactions take place. To this end, the two main aromas selected for this study are 2-phenylethyl acetate, found in the aroma of roses, and 1-phenylethyl acetate, found in the aroma of gardenias. Both acetates are synthesized enzymatically by transesterification reactions. The specific objectives of this Doctoral Thesis are: - To select an experimental device to achieve the synthesis of aromatic esters by enzymatic transesterification. - To study the influence of various reagents and various commercial biocatalysts in the process of obtaining these aromas. - To study the influence of the variables in the system which have the biggest impact on the efficiency of the reaction, but only for those enzymes/substrates that have given good results. - To propose kinetic models that can predict what the progress of different reactions will be over time, adjusting the experimental data to those models. - To carry out the pertinent kinetic studies in order to obtain the kinetic parameters that make possible the simulation of the system at other levels. To achieve these specific objectives, the methodology used in this research has been developed on three levels: On a theoretical-conceptual level, all activities related to the stages of the approach adopted for this research and the formulation of hypothesis are developed. This level concludes planning the work to be carried out on the following levels. On a technical-methodological level, the activities carried out in the laboratory in order to obtain a collection of experimental data are developed. The activities carried out on this level are divided in two groups, those corresponding to the operational method of the tests to be carried out, and those corresponding to the analytical method used to obtain the necessary information. On a statistical-analytical level, the activities to statistically interpret the data are developed. These are used to analyse, study and obtain the conclusions of the research. Based on the results, a kinetic model is proposed and checked to adjust the theoretical data to the actual data obtained. The most important conclusions included in this Doctoral Thesis are the following: - The discontinuous tank reactor is an experimental device suitable for the biosynthesis of the esters of 2-phenylethyl acetate and 1-phenylethyl acetate. - The commercial immobilized biocatalyst Novozym® 435 presents the best results in the synthesis of both esters, under the studied conditions. - Under the same reaction conditions, the synthesis of 2-phenylethyl acetate has better results than the synthesis of 1-phenylethyl acetate. The effect of the catalyst concentration on the conversion obtained has also been studied. - A kinetic model based on the rate equation for the Bi Bi Ping-Pong mechanism provides a simplified equation that predicts the progress of the reaction based on time. - The most important sets of intrinsic kinetic constants in the synthesis by enzymatic transesterification of these two esters have been obtained. - It has been possible to adjust the experimental data to the proposed equation by presenting good correlation coefficients. - The complete equation of the kinetic model allows the simulation of the process to better understand what the influence of the most important variables in the system is.