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    Comparación de la adición de bajas dosis de vitamina K al tratamiento con acenocumarol frente al tratamiento tradicional con acenocumarol sobre la estabilidad del efecto anticoagulante y sus complicaciones : influencia de los polimorfismos genéticos en la dosis de acenocumarol
    (2016-02-08) Martínez Penella, Mónica; Trujillo Santos, Antonio Javier; Soria Arcos, Federico; Departamento de Medicina Interna
    El tratamiento de la anticoagulación oral con AVK es complicado debido a que las propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas y su estrecho margen terapéutico, nos llevan a una respuesta variable e impredecible. La variabilidad interindividual al tratamiento con acenocumarol depende de factores no genéticos como la edad, peso, alcohol, tabaquismo, ingesta de vitamina K, interacciones farmacológicas, comorbilidad y factores genéticos siendo las variantes alélicas de los genes CYP2C9 y VKORC1 las más estudiadas en cuanto a la influencia que tienen sobre la respuesta al acenocumarol. Otras variantes alélicas en otros genes tales como Apoliporoteina E (ApoE), α-1 glicoproteina ácida (ORM1-2), Calumenina y Proteina C (PROC) pueden mostrar influencia en la respuesta anticoagulante con acenocumarol. El objetivo de nuestro estudio fue valorar la utilidad de un suplemento de vitamina K en pacientes con fibrilación auricular no valvular y enfermedad tromboembólica venosa, que empezaban tratamiento con acenocumarol, con el fin de optimizar el tiempo de anticoagulación en rango terapéutico (INR 2.0-3.0) tanto en la fase aguda como crónica de la anticoagulación. Además se evaluó la asociación entre los polimorfismos genéticos CYP2C9 (rs1799853, rs1057910), VKORC1 (rs 9923231), ApoE (rs429358, rs7412), ORM1-2 (rs1687390, rs3762055), Calumenina (rs2290228), PROC (rs2069919) tanto con el tiempo como con la dosis necesaria de acenocumarol para alcanzar y mantener el INR en rango terapéutico, permitiéndonos mejorar la eficacia del tratamiento, así como disminuir el número de visitas de control y la aparición de episodios de hemorragia severa consiguiéndose una monitorización más coste-efectiva. Estos objetivos se quisieron confirmar con la realización de un ensayo clínico, en el Hospital General Universitario Santa Lucia, aprobado por el Cómité Ético de Investigación Clínica de dicho hospital y por la Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios (AEMPS), la cual también permitió que se realizara en el Servicio de Farmacia la solución de vitamina K (100μg/ml) y placebo que se les dispensaba a los pacientes participantes en el ensayo tomándose diariamente junto con su dosis de acenocumarol. A todos los pacientes del ensayo se les controló la ingesta de vitamina K en la dieta y se realizó un seguimiento farmacoterapéutico para evitar posibles interacciones y la aparición de efectos adversos. La dosis de inicio de acenocumarol fue 2mg ó ≥3mg y los pacientes que empezaron con una dosis ≥3mg y llevaron solución de vitamina K alcanzaron más rápido el INR terapéutico (2.0-3.0). También se confirmó que los pacientes con un aporte de vitamina K necesitaron más dosis de acenocumarol. Con respecto a los polimorfismos, destacar CYP2C9 (*2 y*3) que alcanzaron en menos tiempo el INR terapéutico, y sobre todo pacientes con el genotipo CA en CYP2C9*3. No se observó asociación entre el TRT y los diferentes polimorfismos estudiados. En cuanto al polimorfismo rs2069919 en PROC destaca el genotipo AA que se asocia con menos mg de acenocumarol semanal necesarios para mantener el INR en rango terapéutico y el genotipo AG con una tendencia a necesitar menos mg de acenocumarol al inicio del tratamiento. Con respecto al estudio de los polimorfismos de los genes Calumenina, ApoE y ORM1-2 nos ofrecen cierta información sobre su relación con el acenocumarol. No se presentó durante el ensayo ningún acontecimiento adverso, ni de hemorragias, ni de sobrecoagulación por lo que no podemos asociar ningún polimorfismo como valor predictivo. Serían necesarios más estudios para clarificar el papel de la vitamina K y la influencia de los polimorfismos en la estabilidad de la anticoagulación con acenocumarol con el fin de mejorar la eficacia y seguridad. Treatment of oral anticoagulation with VKA is complicated because of the pharmacodynamic properties, pharmacokinetics and its narrow therapeutic margin, leading us to a variable and unpredictable response. The interindividual variability in acenocoumarol depends on non-genetic factors such as age, weight, alcohol, smoking, intake of vitamin K, drug interactions, comorbidities and genetic factors being allelic variants of the CYP2C9 and VKORC1 genes the most studied in terms of influence in the response to acenocoumarol. Other allelic variants in other genes such as Apolipoprotein E (ApoE), α -1 -Acid glycoprotein (ORM1-2), Calumenin and Protein C (PROC) can show influence in the anticoagulant response to acenocoumarol. The aim of our study was to assess the usefulness of vitamin K supplement in patients with non -valvular atrial fibrillation and venous thromboembolism, who began treatment with acenocoumarol, in order to optimize the time in therapeutic range of anticoagulation (INR 2.0-3.0) in both acute and chronic anticoagulation. Also the association was evaluated between CYP2C9 genetic polymorphisms ( rs1799853 , rs1057910 ) , VKORC1 (rs 9923231 ) , ApoE ( rs429358 , rs7412) , ORM1-2 ( rs1687390 , rs3762055 ) Calumenin ( rs2290228 ) , PROC ( rs2069919 )with both the time and the necessary dose of acenocoumarol to achieve and maintain the INR within the therapeutic range , allowing us to improve treatment efficacy and reduce the number of monitoring visits and the appearance of episodes of severe bleeding achieving a more cost - effective monitoring. The confirmation of these goals was intended by a clinical trial carried out at the University General Hospital Santa Lucia, approved by the Clinical Research Ethics Committee of the hospital and the Spanish Agency for Medicines and Health Products (AEMPS), which also allowed the production of vitamin K solution (100µg / ml) and placebo in the Pharmacy Service that were served to patients participating in the trial, taken daily along with the dose of acenocoumarol. The intake of vitamin K was controlled in all the patients in the trial and drugs treatments were followed to avoid possible interactions and the occurrence of adverse effects. The staring dose was 2 mg or ≥3mg of acenocoumarol with patients who had started with a dose ≥3mg of vitamin K solution reaching faster therapeutic INR`s (2.0-3.0). It was also confirmed that patients with vitamin K supplements needed more doses of acenocoumarol. Regarding polymorphisms, CYP2C9 (* 2 and * 3) reached the therapeutic INR in less time especially in patients with CA CYP2C9 * 3 genotype. None of the gene variables analyzed was associated with TRT. T As for the rs2069919 polymorphism in PROC it highlights the AA genotype that is associated with fewer weekly mg of acenocoumarol necessary to maintain the INR within the therapeutic range and genotype AG with a tendency to need less mg of acenocoumarol at baseline. Regarding the study of polymorphisms of Calumenin, and ApoE genes ORM1-2 it offers us specific information about the relationship with acenocoumarol. No adverse event was presented during the trial, neither bleeding, or excessive coagulation so we cannot associate any polymorphism as a predictive value. Further studies would be needed to clarify the role of vitamin K and the influence of polymorphisms in the stability of anticoagulation with acenocoumarol in order to improve the efficiency and safety.
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    Efecto del tratamiento con vitamina D sobre los niveles séricos de 25 hidroxivitamina D en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal y su influencia sobre la actividad de la enfermedad y la calidad de vida
    (Universidad de Murcia, 2022-07-18) Martínez Pascual, Cristina; Bernal Morell, Enrique; Escuela Internacional de Doctorado
    INTRODUCCIÓN La hipovitaminosis D es muy frecuente entre los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Cada vez se conocen más acciones de la vitamina D no relacionadas con la homeostasis del calcio. El déficit de 25(OH)D se ha implicado en varias patologías como la EII. Diferentes estudios lo asocian con una peor evolución de la enfermedad. Los suplementos de vitamina D se han postulado como un tratamiento esperanzador, aunque la evidencia es escasa y se desconoce la dosis óptima. METODOLOGÍA Se realizó un estudio transversal con pacientes ambulatorios de EII de dos hospitales de Murcia para analizar la prevalencia del déficit (<20 ng/ml) y niveles subóptimos de 25(OH)D (<30 ng/ml), así como los factores asociados a éstos. Posteriormente, se llevó a cabo un estudio ambispectivo durante 6 meses en aquellos pacientes con 25(OH)D <30 ng/ml que iniciaban tratamiento con vitamina D. El objetivo principal fue evaluar los cambios en la concentración de 25(OH)D a los 3 y 6 meses según el régimen de tratamiento empleado: continuado vs. en pulsos. Para ello se utilizó una ANOVA Mixta. Se analizó si el aumento en los niveles de 25(OH)D 30 ng/ml se asociaba a una mejoría en los índices de actividad clínica, de los parámetros analíticos de actividad (PCR y CPF) y en los cuestionarios de calidad de vida (IBDQ-9), severidad de la fatiga (FSS) y distrés psicológico (GHQ-12). RESULTADOS En el estudio transversal participaron 94 pacientes. La prevalencia de niveles subóptimos de 25(OH)D fue del 70,2%. Las cifras de CPF > 250 mcg/g se asociaron a niveles subóptimos de vitamina D (OR 4,04 (IC95% 1,06-15,31); p=0,04) y el menor número de horas de exposición solar se asoció al déficit de vitamina D (OR 0,922 (IC95% 0,85-0,99); p=0,047). En el estudio ambispectivo participaron 89 pacientes que recibieron 4 regímenes distintos de calcifediol: 1 y 3 donde se administraba la totalidad de la dosis en el primer trimestre; 2 y 4, repartidos en 2 trimestres. Se comparó el régimen 1 (Ampolla calcifediol 3 mg, 0-2 meses, n=20) con el 3 (2 cápsulas calcifediol 0,266 mg semanales durante 3 meses, n=16). Aunque presentaron similares cambios en las concentraciones de 25(OH)D, la proporción de pacientes con niveles óptimos de 25(OH)D a los 6 meses fue mayor con el régimen 3 (30% vs.62,5%, p=0,016). Se comparó el régimen 2 (Ampolla calcifediol 3 mg, 0-3 meses, n=24) con el 4 (1 cápsula calcifediol 0,266 mg semanal durante 3 meses y luego 1 cápsula cada 15 días, n=28). Este último consiguió a los 3 meses una proporción mayor de pacientes con concentraciones óptimas (96% vs. 53%) y una media mayor en los niveles de 25(OH)D (63,91 vs. 31,45 ng/ml) (p<0,001). No hubo diferencias a los 6 meses. Las variables que se asociaron a niveles subóptimos de vitamina D a los 3 meses fueron: el IMC elevado (OR 1,3 (IC95% 1,03-1,63); p=0,023), la puntuación baja en la escala IBDQ-9 (OR 0,73 (IC95% 0,57-0,93); p=0,01) y el régimen de tratamiento 2 (OR 66,9 (IC95% 2,17-2062); p=0,016). A los 6 meses fueron las cifras de CPF > 250 mcg/g (OR 4,01 (IC95% 1,19-13,54); p=0,025) y el régimen de tratamiento 1 (OR 12,03 (IC95% 2,39- 60,57); p=0,003). CONCLUSIONES La prevalencia de niveles subóptimos de 25(OH)D entre los pacientes con EII fue elevada y se asoció a mayor actividad de la enfermedad (CPF). El tratamiento con calcifediol fue seguro y con los regímenes empleados se consiguieron adecuados aumentos en la concentración de 25(OH)D, presentando el régimen continuado de 1 cápsula calcifediol 0,266 mg semanal durante 3 meses y luego 1 cada 15 días el mejor perfil de efectividad y seguridad.
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    Eficacia de la suplementación con calcifediol en el control del asma en pacientes asmáticos con déficit de vitamina D
    (2016-06-01) Salinero González, Lourdes; Illán Gómez, Fátima; Escuela Internacional de Doctorado
    Introducción: Existen numerosos estudios transversales en niños y adultos que indican que los niveles bajos de vitamina D en los pacientes asmáticos se correlacionan con un peor control, una peor función pulmonar, una disminución de la respuesta a glucocorticoides y más frecuentes exacerbaciones. Por otra parte, existe un grupo importante de pacientes asmáticos que presentan un control insuficiente a pesar de altas dosis de corticoides inhalados, ante lo que se han investigado nuevas alternativas de tratamiento, entre las que figura la vitamina D. Objetivo: Determinar la eficacia de la suplementación con vitamina D en pacientes asmáticos con dicho déficit vitamínico, sobre el grado control del asma. Material y método: Se realizó un estudio prospectivo, controlado, aleatorizado y a triple ciego con seguimiento de 6 meses. Se reclutaron pacientes mayores de 18 años con el diagnóstico médico de asma bronquial, y niveles séricos de 25-OH-D3 < 30ng/ml. Se excluyeron los pacientes con tabaquismo ≥ 10 paquetes-año, toma previa de suplementos con vitamina D, enfermedad renal (creat>2mg/dl), hipercalcemia (calcio corregido > 10.5mg/dl), cólicos renales de repetición, patologías intestinales que interfieran en la absorción de la vitamina D, gestación o lactancia, y problemas psico-sociales severos. Se aleatorizó a los pacientes en dos grupos: un grupo que recibía vitamina D (en forma de calcifediol -Hidroferol®- ampollas con 16.000 UI de forma semanal por vía oral) y otro grupo que recibía placebo, con una presentación idéntica y la misma pauta de administración. Se recogieron variables socio-demográficas, clínicas, analíticas y espirométricas. La variable de resultado principal fue el grado de control del asma determinado por el test validado internacionalmente Asthma Control Test (ACT). Las variables secundarias fueron agudizaciones asmáticas, dosis de corticoides inhalados, y calidad de vida medida mediante el mini-AQLQ (Asthma Quality of Life Questionnaire). Resultados: De 193 pacientes reclutados, se aleatorizaron 112 pacientes en 2 grupos, asignando 56 pacientes en cada uno de ellos, y de los cuales completaron el estudio 53 pacientes en cada grupo. De forma enmascarada, uno de los grupos recibió vitamina D y el otro grupo recibió placebo. La mayoría de pacientes fueron mujeres (87 casos (77,67%), con una edad de 55,59 ± 15,41 años. No hubo diferencias significativas al comparar en ambos grupos sus características basales. Se observó una mejoría clínica y estadísticamente significativa en la puntuación del ACT en el grupo de la vitamina D (+3,09±3,81), respecto al grupo placebo (-0,57±5,23) (p<0,001). La puntuación en el mini-AQLQ fue estadísticamente mejor en el grupo de la vitamina D (5,34 ± 1,29) frente al grupo placebo (4,64 ± 1,56) (p=0,013). Observamos también en el grupo de la vitamina D una diferencia pequeña aunque significativa en la reducción del número de agudizaciones asmáticas (p=0,04), en el número de consultas no programadas en Atención Primaria por asma (p=0,019) y en el número de ciclos de corticoides orales durante el estudio (p=0,024). No existieron diferencias significativas en la dosis final de corticoides inhalados, ni en el número de consultas en Urgencias o de hospitalizaciones por asma. No observamos reacciones adversas graves durante el estudio. Conclusiones: La suplementación con vitamina D en pacientes asmáticos con niveles séricos de 25-OH-D3 inferiores a 30ng/ml, mejoró el control del asma medido mediante el cuestionario ACT, la calidad de vida por el mini-AQLQ, redujo el número de agudizaciones de asma y el número de ciclos de corticoides orales. No hubo diferencias en cuanto a la dosis de corticoides inhalados ni de hospitalizaciones por asma. Introduction: There are many cross-sectional studies in children and adults indicating that low vitamin D levels in asthmatic patients are correlated with poorer asthma control, poorer lung function, decreased response to glucocorticoids and more frequent exacerbations. Moreover, as there is a significant group of asthmatic patients having insufficient control of their disease, despite high doses of inhaled corticosteroids, we have investigated new treatment alternatives, which include vitamin Objective: To determine the efficacy of vitamin D supplementation in asthmatic patients with vitamin D deficiency in degree of asthma control. Materials and methods: A prospective, controlled, randomised, triple-blind study was conducted with a follow-up of 6 months. The patients recruited were over 18 years of age with a medical diagnosis of bronchial asthma and serum 25(OH)D3 levels < 30 ng/ml. Patients were excluded if they had a smoking habit ≥ 10 pack-years, taking vitamin D supplements, kidney disease (creat. > 2 mg/dl), hypercalcaemia (corrected with proteins > 10.5 mg/dl), a repeat episodes of renal colic, any gastrointestinal disease that might interfere with vitamin D absorption, or severe psychosocial problems, or were pregnant or breast-feeding. The randomisation process assigned patients to one of two groups: a group that received vitamin D (in the form of calcifediol (Hidroferol®) in 16,000-IU ampoules taken weekly by the oral route) and another group that received placebo in a presentation with an identical appearance and the same administration regimen. Demographic, clinical, spirometry and laboratory endpoints were collected. The primary endpoint was degree of asthma control as determined by the internationally validated Asthma Control Test (ACT). The secondary endpoints were asthma exacerbations, dose of inhaled corticosteroids and quality of life as measured using the Mini-AQLQ (Asthma Quality of Life Questionnaire). Results: Of the 193 patients recruited, 112 patients were randomised to 2 groups, with 56 patients being assigned to each of them. Among these, 53 patients in each group completed the study. The study was blinded such that one group received vitamin D and the other received placebo. Most patients were female (87 cases [77.67%]), and mean patient age was 55.59 ± 15.41 years. When the two groups were compared, no significant differences were found with respect to baseline characteristics. Statistically significant clinical improvement as measured using ACT scores was observed in the group that received vitamin D (+3.09 ± 3.81) compared to the group that received placebo (–0.57 ± 5.23) (p < 0.001). Scores on the Mini-AQLQ were statistically better in the vitamin D group (80.15 ± 19.33) versus the placebo group (69.64 ± 23.40) (p = 0.013). A slight but significant difference was observed in the reduction in the number of asthma exacerbations (p = 0.04), in the number of unscheduled consultations in primary care (p = 0.019) and the average number cycles of oral corticosteroids during the study (p = 0.024). There were no significant differences in final dose of inhaled corticosteroids (p = 0.392), nor in the number of queries in the ER (p=0,139) or hospitalizations for asthma (p = 1.00). No serious adverse reactions were observed during the study in connection with vitamin D supplementation. Conclusions: Vitamin D supplementation in asthmatic patients with serum 25(OH)D3 levels below 30 ng/ml improved asthma control as measured using the ACT questionnaire, improved quality of life as determined by the Mini-AQLQ, reduced the number of asthma exacerbations and the number of courses of oral corticosteroids. There were no differences with respect to dose of inhaled corticosteroids and hospitalizations for asthma.
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    Estudio oscilopolarográflco de Vitaminas.
    (Murcia : Universidad, Servicio de Publicaciones, 1954) Salmerón Salmerón, Pascual; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Química Orgánica
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    Hifenaciones instrumentales entre la cromatografía líquida, diferentes sistemas detectores y nuevos métodos de pretratamiento de muestra para la determinación de vitaminas en alimentos
    (2013-12-18) Bravo Bravo, María de los Ángeles; Viñas López-Pelegrín, Pilar; López García, Ignacio Francisco; Facultad de Química
    El Objetivo Principal de esta Tesis Doctoral es desarrollar nuevos métodos analíticos para la determinación de vitaminas, constituyentes esenciales en la dieta humana. La Cromatografía Líquida (LC) combinada en línea con Espectrometría de Masas (MS) es una de las metodologías analíticas más sensibles y selectivas, y la aplicación de esta técnica está creciendo rápidamente en análisis de alimentos. Dependiendo de las estructuras químicas y características analíticas de los grupos de vitaminas analizados, los métodos analíticos utilizados son hifenaciones de LC con detector de diodos (LC–DAD), fluorescencia (LC–Fl) y LC–MS. La Metodología utilizada se basa en la aplicación de nuevos métodos de preparación de la muestra. Los métodos clásicos presentan inconvenientes, tales como ser tediosos y largos, y requerir volúmenes grandes de muestra y disolventes tóxicos. Teniendo como objetivo la química verde, surgen las técnicas modernas de preparación de muestra, que ofrecen la posibilidad de automatización, son limpias y selectivas, tienen mayor rapidez y eficacia, son baratas, sencillas y sin disolventes tóxicos. Así, se ha empleado la Extracción Líquida Presurizada (PLE), que es una tecnología verde emergente. Implica la extracción usando disolventes líquidos a temperatura y presión elevadas, que aumentan la solubilidad y las propiedades de transferencia de masa. También se ha utilizado la Microextracción en Fase Líquida (LPME), basada en la extracción de los analitos en una fase líquida usando cantidades muy pequeñas de disolventes orgánicos. La Microextracción Dispersiva Líquido–Líquido (DLLME) utiliza un sistema de disolventes ternario. El bajo consumo de tiempo y disolventes orgánicos son dos de las mayores ventajas de esta técnica. Finalmente, se ha empleado la Extracción en Fase Sólida (SPE), que implica una partición líquido–sólido, donde la fase extractante es un adsorbente sólido, como los nanotubos de carbono. Así pues, los Objetivos de esta Tesis Doctoral han sido estudiar los acoplamientos instrumentales de LC con detectores DAD, Fl y MS y procedimientos verdes de tratamiento de la muestra para la determinación de diferentes vitaminas hidrosolubles y liposolubles en diversos tipos de alimentos. El trabajo se ha dividido en dos partes, en función del grupo de vitaminas analizado y el tipo de detector empleado. Las conclusiones obtenidas son las siguientes: 1. Se han desarrollado métodos analíticos para la determinación de vitaminas hidrosolubles en alimentos de diferentes tipos, nutracéuticos e infantiles. Las vitaminas son cobalaminas, tiamina y sus ésteres y benfotiamina. Son compuestos polares y se analizan por LC en fase reversa con fase estacionaria RP–Amida C16 y un encapsulante de trimetilsililo. Las fases móviles son mezclas de acetonitrilo y fosfato diácido de potasio. Se utiliza DAD para cobalaminas o detección fluorescente para tiamina y sus ésteres y benfotiamina utilizando derivatización por oxidación a tiocromo. 2. Se utilizaron dos procedimientos miniaturizados para el tratamiento de la muestra. Para las cobalaminas se utiliza SPE con nanotubos de carbono multipared y un sistema de flujo para la adsorción de los analitos y su elución con dimetilsulfóxido. En el caso de la tiamina y benfotiamina se utiliza DLLME. 3. La extracción de las vitaminas se lleva a cabo mediante ultrasonidos para cobalaminas o digestión ácida y extracción enzimática para destruir las formas fosforiladas de las vitaminas B. 4. En la segunda parte de la Tesis, se desarrollan métodos para determinación de las cuatro vitaminas liposolubles (A, D, E y K) en alimentos funcionales como zumos de frutas, alimentos vegetales y lácteos, y alimentos infantiles. Se analizan por LC en fase reversa o fase normal y diferentes acoplamientos de LC con DAD o fluorescencia y MS con interfases ESI y APCI acoplados a DLLME. La extracción se realiza utilizando disolventes orgánicos, mediante PLE o saponificación alcalina. Palabras clave Cromatografía líquida Espectrometría de masas Detección por diodos Detección fluorescente Pretratamiento de la muestra Microextracción dispersiva líquido-líquido Vitaminas Alimentos The main objective of this Thesis, is the development of new analytical methods for the determination of vitamins, essential constituents in the human diet. Liquid chromatography (LC) combined on-line with mass spectrometry (MS) is one of the more sensitive and selective analytical methodologies, and this technique is widely applied in food analysis. Depending on the chemical structures and analytical characteristics of the groups of vitamins analyzed, the analytical methods used are hyphenations of LC with diode array detector (LC–DAD), fluorescence (LC–Fl) and LC–MS. The methodology applied is based on the application of new methods for sample preparation. Classical methods have inconveniences, as being tedious and large, requiring great volumes of sample and toxic organic solvents. With the objective of green chemistry, modern sample preparation techniques appeared, which offer the possibility of automatization, are clean and selective, have higher speed and efficiency, are cheap, simple and without toxic solvents. Thus, Pressurized liquid extraction (PLE) has been used, being an emergent green technology, based on the extraction using liquid solvents at high temperature and pressure, which increase the solubility and the properties of mass transfer. Liquid-phase microextraction (LPME) was also used and is based on the extraction of the analytes in a liquid phase using very small amounts of organic solvents. Dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) uses a ternary solvent system. The low time and organic solvents consume are the two main advantages of this technique. Finally, Solid phase extraction (SPE) implies a liquid-solid partition, where the extractant phase is a solid sorbent, as multiwalled carbon nanotubes. Thus, the objectives of this Thesis were to study the instrumental coupling of LC with DAD, Fl and MS detection and green sample treatment procedures for the determination of several hydrosoluble and liposoluble vitamins in different type of foods. The study is divided in two parts, depending on the group of vitamins analyzed and the type of detector used. The following conclusions have been obtained: 1. Analytical methods are developed for the determination of hydrosoluble vitamins in different type of foods, nutraceuticals and baby foods. The vitamins are cobalamins, thiamine and its esters and benfothiamine. They are polar compounds and are analyzed by LC in reversed phase with a stationary phase RP–Amide C16 and an endcapping of trimethylsilyl. The mobile phases are mixtures of acetonitrile and potassium phosphate (pH 7). DAD detection is used for cobalamins or fluorescence for thiamine and its esters and benfothiamine using derivatization by oxidation to thiochrome. 2. Two miniaturized procedures have been developed for the sample treatment. For cobalamins, SPE was used with multiwalled carbon nanotubes and a flow system for the adsorption of the analytes and its elution with dimethylsulphoxide. DLLME was used for thiamine and benfothiamine. 3. The extraction of the vitamins was carried out using ultrasounds for cobalamins or acid digestion and enzymatic extraction for destroying the phosphorilated forms of the vitamins B. 4. In the second part of the Thesis, new methods are developed for the determination of the four liposoluble vitamins (A, D, E and K) in functional foods as fruit juices, vegetables, milk foods and baby foods. They are analyzed by LC in reversed phase or normal phase and different couplings of LC with DAD or fluorescence and MS with interfaces of electrospray ionization (ESI) and atmospheric pressure chemical ionization (APCI) coupled to DLLME. The extraction was carried out using organic solvents, by PLE or alkaline saponification. Key words: Liquid chromatography Mass spectrometry Diode array detection Fluorescence detection Sample pretreatment Dispersive liquid-liquid microextraction Vitamins Foods
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    Suplementación con vitamina D en epilepsia: estudio en pacientes con antiepilépticos clásicos y de nueva generación
    (2016-02-22) Villegas Martínez, Irene; Martín Fernández, José Javier; Martínez García, Francisco Antonio; Departamento de Medicina Interna
    INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS: el metabolismo óseo es un sistema complejo en el que intervienen numerosos actores, como la vitamina D. Los farmacos antiepilépticos (FAEs) clásicos como la carbamacepina (CBZ), la fenitoína (PHT) o el ácido valproico (VPA), se han relacionado con la aparición de una osteoporosis prematura en los pacientes epilépticos y se recomienda la suplementación con vitamina D, pero la dosis e incluso el tipo de suplementación no está clara. También se desconoce el impacto de los nuevos FAEs en la salud ósea de los pacientes, por lo que se planteó como objetivo del estudio determinar la posible afectación del metabolismo óseo en pacientes epilépticos tratados con FAEs de nueva generación, mediante parámetros densitométricos, y bioquímicos, comparados con pacientes tratados con fármacos clásicos, y, por otro lado, determinar el efecto de la suplementación con vitamina D en estos mismos parámetros, tanto en pacientes tratados con FAEs clásicos como de nueva generación, de forma crónica. MÉTODO: se realizó un estudio observacional prospectivo en una muestra de pacientes diagnosticados de epilepsia, de la Unidad de Epilepsia del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca (Murcia), que se encontraban en monoterapia estable con un FAE clásico (CBZ, PHT or VPA) de nueva generación (levetiracetam (LEV), lacosamida (LCM) o eslicarbacepina (ESL)) y que fueran a empezar con suplementación con vitamina D y calcio, según práctica clínica habitual. Se seleccionó una muestra similar de pacientes que no tomaron suplementación, como grupo control. Se recogieron datos clínicos, nivel de ejercicio físico, fototipo cutáneo, encuesta nutricional y parámetros bioquímicos generales. Se procedió a determinar la densidad mineral ósea (DMO) en los pacientes mediante densitometría de absorción dual (DEXA) en columna lumbar y cuello femoral izquierdo, a nivel basal y tras seis meses, así como los niveles de vitamina D y los marcadores bioquímicos de remodelación ósea. Igualmente se determinaron los polimorfismos de los genes relacionados con el metabolismo óseo a nivel basal. RESULTADOS: se estudiaron 27 pacientes en suplementación con vitamina D (400 UI de colecalciferol y 1500 mg carbonato cálcico), y 37 pacientes se siguieron como controles. No hubo diferencias en las características basales entre el grupo con suplementación (grupo vitD) y el grupo control, en cuanto a los antecedentes clínicos ni los parámetros bioquímicos generales, excepto en el porcentaje de fumadores, que fue mayor en el grupo control. Se encontró que la glucemia era un factor de confusión que se controló en los análisis estadísticos posteriores. El polimorfismo del gen ESR1P-PVU se relacionó con los cambios en la z/t femoral de forma independiente (p = 0,046), así como la toma de suplementación con vitamina D (p = 0,031). Los pacientes en tratamiento con FAEs neutros (LEV o LCM) presentaron niveles de vitamina D basales similares a los encontrados en los pacientes con FAEs inductores (CBZ, PHT o ESL) o inhibidores (VPA): 20,10 ± 9,92 vs 15,65 ± 6,56 vs 21,30 ± 8,12 ng/ml, respectivamente. Los niveles de osteocalcina basal, fueron más elevados en el grupo de pacientes tratados con LEV que en los tratados con VPA (p = 0,044). La DMO lumbar de los pacientes con FAEs neutros fue significativamente superior a la de los pacientes con FAEs inductores (1,106 ± 0,15 vs 0,970 ± 0,14 g/m2, p = 0,025). En el grupo suplementado, el número de pacientes con niveles de vitamina D por encima de 30 ng/ml aumentó de 3 a 7 (del 12 al 28%), los pacientes en rango de insuficiencia del 44 al 56% y mientras los que se encontraban en rango de deficiencia disminuyeron de 11 a 4, (p = 0,019). En los que presentaban una deficiencia o insuficiencia de vitamina D basal, los parámetros de formación y resorción ósea disminuyeron, mientras que en grupo control aumentaron los determinantes de resorción de forma significativa. La DMO y z/t lumbares aumentaron significativamente en los pacientes del grupo suplementado, en comparación con el grupo control (0,027 ± 0,047 g/m2 vs -0,003 ± 0,064 g/m2, p = 0,025), y la DMO y z/t femorales aumentaron pero no alcanzaron la significación estadística. El tipo de FAE no demostró ninguna influencia sobre el cambio en los niveles de vitamina D o los parámetros densitométricos. CONCLUSIONES: LEV no produjo cambios en la DMO en nuestra muestra, pero mostró un perfil similar al de los inductores enzimáticos en cuanto a déficit de vitamina D. Además, detectamos una tendencia a la disminución de la formación ósea durante los seis meses de evolución, no dependiente de la suplementación con vitamina D y calcio. La suplementación con 400 UI de vitamina D y 1500 mg de carbonato cálcico diaria se asoció a un aumento de los parámetros densitométricos femorales y lumbares, siendo significativo para la z/t-score femoral, sin que el tipo de fármaco antiepiléptico influyera en ello. Esta suplementación no consiguió normalizar los niveles de vitamina D séricos en la mayoría de los pacientes, por lo que dosis más elevadas e individualizadas serían necesarias. Además, los pacientes que presentaban, a nivel basal, deficiencia o insuficiencia de vitamina D, se beneficiaron de forma más evidente de la suplementación. Por otro lado, la presencia del alelo “p” del polimorfismo ESR1P-PVU favoreció la mejoría del z/t-score femoral en los pacientes suplementados. VITAMIN D SUPPLEMENTATION IN EPILEPSY: STUDY IN PATIENTS ON CLASSICAL AND NEW GENERATION ANTIEPILEPTIC DRUGS. INTRODUCTION AND PURPOSE: Bone metabolism is a complex system where numerous actors are involved, including vitamin D. Classical antiepileptic drugs (AED) as carbamazepine (CBZ), phenytoin (PHT) and valproic acid (VPA) are strongly related to disturbances in bone metabolism in persons with epilepsy, and can lead to a premature osteoporosis. Vitamin D supplementation has been recommended but dosage, and even type of supplementation, are still not clear. Moreover, we don’t know if newer AEDs have an impact on bone, though, the aim of this study was to determine if newer AEDs are related to bone metabolism impairment, compared to classical AEDs, in terms of densitometric and biochemical parameters, and if vitamin D administration as performed in everyday clinical practice is related to a better outcome on densitometry or biochemical parameters in patients on chronic AEDs. METHODS: a prospective observational study was conducted on adult epileptic outpatients from the Epilepsy Unit of Arrixaca’s Hospital (Murcia), on stable monotherapy with AEDs, either classical (CBZ, PHT or VPA) or new (levetiracetam (LEV), eslicarbazepine (ESL), lacosamide (LCM)), that were going to start vitamin D supplementation. A similar sample of patients not taking vitamin D was collected as control group. Clinical data, level of exercise, skin phototype, nutritional status and general biochemical parameters were collected. Bone mineral density (BMD) at lumbar level and neck of left femur was studied by dual energy X-ray absorptiometry at the beginning of the study and after 6 months, as well as vitamin D levels and bone remodeling biomarkers. Polymorphisms of genes related to bone metabolism were determined at baseline. RESULTS: 27 patients on vitamin D supplementation (400 UI cholecalciferol and 1500 mg calcium carbonate) and 37 controls were studied. There was no difference between the two groups (vitD and control group), in terms of clinical characteristics and general biochemical parameters, excepting for smokers that were more frequent in the control group. Glycemia was found to be a confounding factor, which was controlled in statistical analysis. ESR1P-PVU polymorphism was independently related to changes in femoral z/t score (p _ 0,046) and with vitamin D supplementation (p = 0,031). Patients treated with neutral AEDs (LEV and LCM) had similar vitamin D levels as patients on enzyme-inducers (CBZ, PHT or ESL) and inhibitors (VPA): 20,10 ± 9,92 vs 15,65 ± 6,56 vs 21,30 ± 8,12 ng/ml, respectively. Baseline osteocalcin levels were higher in pacients on LEV compared to VPA (p = 0,044). Lumbar BMD was higher in patients on neutral AEDs compared to inducers (1,106 ± 0,15 vs 0,970 ± 0,14 g/m2, p = 0,025). In the supplemented group, the number of patients with vitamin D sufficiency increased from 3 to 7 (12 to 28%), insufficient patients grew from 44 to 56% and deficient patients decreased from 11 to 4, (p = 0,019). Bone remodeling biomarkers, both formation and resorption markers, decreased significantly in patients with vitamin D levels < 30 ng/ml, while resorption markers increased in patients in control group. Lumbar BMD and z/t score increased significantly in supplemented patients, compared to controls (0,027 ± 0,047 g/m2 vs -0,003 ± 0,064 g/m2, p = 0,025), and femoral BMD and z/t score also increased but did not reach statistical significance. Vitamin D levels or densitometric parameters were not influenced by AED type. CONCLUSIONS: LEV was not associated to BMD changes in this study, but it was related to low vitamin D levels, as were enzyme-inducer AEDs. Moreover, a tendency to a decrease in bone formation after six months was detected, not depending on vitamin D and calcium supplementation. Administratio of 400 IU of vitamin D and 1500 mg of calcium carbonate was associated to an increase of femoral and lumbar densitometric parameters, reaching statistical significance for femoral z/t score, and AED did not show any influence on it. Normalization of vitamin D levels was not reached with this dosage of supplementation, thus an individualized higher dose could be recommended. In addition, patients that were insufficient or deficient at baseline showed a more evident improvement in the studied patterns. Presence of “p” allele of ESR1P-PVU polymorphism was related to an improvement of femoral z/t-score in supplemented patients.