Browsing by Subject "Virología"

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    Diagnóstico de los carcinomas orofaríngeos relacionados con el virus del papiloma humano (VPH) : detección viral mediante técnicas comerciales de uso clínico y análisis de su valor pronóstico
    (Universidad de Murcia, 2019-06-21) Lozano García;, Lorena; Moreno Docón, Antonio; Torroba Carón, María Amparo; Escuela Internacional de Doctorado
    Los carcinomas de cabeza y cuello son el sexto tipo más frecuente de cáncer a nivel global. En los último años se ha puesto de manifiesto un incremento en la incidencia de los carcinomas orofaríngeos atribuída a la oncogénesis asociada al virus del papiloma humano (VPH), que muestran características clínicas, morfológicas y pronósticas diferenciales respecto a los tradicionalmente atribuídos al consumo de alcohol y tabaco. Estos carcinomas serían susceptibles de ser tratados con terapias individualizadas que supongan una mejora en la calidad de vida del paciente respecto a la alcanzada con el manejo clínico que se realiza en la actualidad. Sin embargo, el diagnóstico de estos tipos de cáncer presenta dificultades técnicas e interpretativas, y aún no se ha establecido el procedimiento más adecuado para el diagnóstico de este tipo de carcinomas. En nuestro estudio, realizamos un análisis comparativo de distintas técnicas comerciales de uso clínico en muestras de tejido embebido en parafina de carcinomas orofaríngeos diagnosticados en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca (HCUVA) (Murcia) entre 2005 y 2016, y evaluamos su valor pronóstico en la detección de carcinomas orofaríngeos relacionados con VPH. En este trabajo consideramos los distintos enfoques diagnósticos posibles, comparando los resultados obtenidos mediante cinco técnicas de detección de ADN de VPH con diferentes dianas biológicas y fundamentos moleculares [HPV Xpert® (Cepheid), Anyplex® II HPV28 Detection (Seegene), CLART® HPV4 (Genomica), INNO-LiPA® HPV Genotyping Extra II (Fujirebio), AmpFire® (Atila Biosystems)], dos técnicas de detección de ARNm viral de las proteínas E6/E7 (PreTect® HPV-Proofer (NorChip) y QuantiVirus® HPV E6/E7 RNA (DiaCarta)] y la detección de la sobreexpresión de p16 mediante tinción inmunohistoquímica. Nuestro estudio revela que las técnicas evaluadas obtienen resultados concordantes en mayor o menor grado para la detección de VPH, y que podrían ser de utilidad en el diagnóstico de carcinomas orofaríngeos relacionados con VPH. Además, se observa que las técnicas de detección de ADN viral son las que proporcionan un mayor valor pronóstico para este tipo de carcinomas y que la ausencia de sobreexpresión de la proteína p16 se asocia a la negatividad para la detección de VPH. Estos resultados sugieren que se podría realizar un adecuado diagnóstico de los carcinomas orofaríngeos relacionados con VPH mediante un algoritmo en dos pasos en el que se realice, en primer lugar, la detección de la sobreexpresión de la proteína p16, y en caso de ser esta positiva, la detección de ADN de VPH.
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    Importance of associated weeds and cropping systems in shaping the viromes of horticultural crops
    (Universidad de Murcia, 2022-10-28) Maachi, Ayoub; Aranda Regules, Miguel Ángel; Donaire Segarra, Livia; Hernando Saiz, Yolanda; Escuela Internacional de Doctorado
    La metagenómica basada en la secuenciación de alto rendimiento (HTS) ha abierto una nueva era de descubrimiento no sesgado y caracterización genómica de los virus. Al igual que en el caso de los virus de otros reinos, los estudios metagenómicos indican que la diversidad de los virus de las plantas estaba hasta hace poco muy subestimada. Como componentes potencialmente importantes de los ecosistemas silvestres o cultivados, es necesario explorar la diversidad de los virus asociados a las poblaciones de plantas y comprender los factores que determinan su diversidad en el espacio y el tiempo. Al mismo tiempo, el desarrollo de este tipo de estudios sigue enfrentándose a cuestiones metodológicas importantes, por ejemplo, en relación con la elección del procesamiento de las muestras, o con la reproducibilidad de los análisis. Los enfoques de HTS, junto con los métodos más tradicionales, pueden utilizarse para estudiar las interacciones de los virus con otros organismos hasta la escala del ecosistema. Estas herramientas permiten analizar los viromas en diferentes ecosistemas, descubriendo la diversidad de los virus de las plantas y ayudándonos a entender mejor la epidemiología, ecología y evolución de los virus de las plantas. Así pues, el objetivo general de esta tesis ha sido utilizar HTS para estudiar la importancia de las malas hierbas y los sistemas de cultivo en la conformación de los viromas de los cultivos hortícolas. En una primera fase, como se describe en el primer capítulo de esta tesis, utilizamos dos métodos de preparación del ARN y desarrollamos un procedimiento bioinformático para el análisis de los datos de HTS. A continuación, aplicamos los métodos puestos a punto para la detección de virus en una colección de muestras de tomate con síntomas similares a los causados por virus. Los resultados de la identificación de virus fueron confirmados por métodos convencionales y el procedimiento bioinformático fue la base para los estudios posteriores de esta tesis. Encontramos que la preparación de ARN bicatenario ARNbc proporcionaba una mejor cobertura en comparación con la preparación de RNA total para la mayoría de los virus. Sin embargo, el método de ARNbc generó muchos problemas durante el proceso de secuenciación, no cumpliendo a menudo los requisitos de preparación de genotecas que exigen la necesidad de un paso de preamplificación. Además, la preparación de ARNbc consumía mucho tiempo, por lo que no parece un método adecuado para manejar un gran número de muestras. Utilizando nuestro procedimiento bioinformático, hemos descrito con éxito tres virus que infectan los cultivos de tomate en España y que no habían sido descritos previamente: el virus de la descoloración del fruto del tomate, el virus de la necrosis anular de la lechuga y el virus latente del olivo. En una segunda fase, tal y como se describe en el capítulo 2 de esta tesis, analizamos y comparamos los viromas del melón y de tres malas hierbas comunes encontradas en los bordes de los cultivos. Determinamos la incidencia de los virus que infectan al melón y descubrimos el papel que estas malas hierbas pueden desempeñar en la ecología y evolución de los virus, realizando estudios de genética de poblaciones, filogenética y análisis de migración de los virus comunes al melón y las malas hierbas. Descubrimos que el virus del amarilleamiento transmitido por pulgones de las cucurbitáceas (CABYV) y el virus de Nueva Delhi del rizado de la hoja del tomate (ToLCNDV) infectaban tanto al melón como a Ecballium elaterium. La población de CABYV era diversa y estaba estructurada de acuerdo con el huésped. La población deToLCNDV era mucho menos diversa. El análisis de los flujos potenciales de migración del virus entre los dos hospedadores no mostró evidencia de migración entre los dos hospedadores. En el caso del ToLCNDV, se encontró evidencia de migración del melón a E. elaterium, pero no al revés. En una tercera fase, descrita en el capítulo 3 de esta tesis, se caracterizaron y describieron en detalle los genomas de dos nuevos virus que pueden constituir nuevas especies putativas, encontrados en las malas hierbas circundantes de los cultivos de melón. También se determinó la incidencia de estos dos virus en las malas hierbas. Por último, tal y como se describe en el capítulo 4, se estudió la influencia de dos diferentes agroecosistemas en la estructura y diversidad de los viromas, analizando las viromas de las explotaciones de lechuga realizadas bajo prácticas ecológicas o convencionales. En ambos sistemas se caracterizaron también las viromas de malas hierbas asociadas a este cultivo. Encontramos un solapamiento parcial de los viromas de la lechuga en ambos sistemas de cultivo y las malas hierbas, lo que indica la importancia del sistema de producción para determinar los virus que afectan al cultivo, y no se encontró solapamiento de virus entre la lechuga y las malas hierbas asociadas en cada sistema de cultivo específico.
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    Incidencia, características y medidas aplicadas en pacientes con gripe A (H1N1) en el contexto hospitalario durante el periodo 2016-2018
    (Universidad de Murcia. Servicio de publicaciones, 2021) Ignacio Torres, Marina; Hornero López, Ana; Jimenez Martínez, Emilio; Adamuz, Jordi
    Introducción: El virus de la gripe ocasiona anualmente epidemias estacionales con amplia extensión mundial y se estima que entre el 5 y el 20% de la población padece gripe cada año. En abril de 2009 se confirmaron los primeros casos de infección humana causados por un nuevo virus de la gripe A (H1N1). Objetivo y Método: En el período de epidemia (semana 40-20) del 2016-2018 se realizó un estudio observacional descriptivo prospectivo multicéntrico en dos hospitales públicos del área metropolitana sur de Barcelona con el objetivo de determinar la incidencia de pacientes positivos en gripe A (H1N1), así como las características demográficas y clínico-evolutivas de estos pacientes, la temporalidad en la detección del virus y medidas aplicadas por control de la infección. Resultados: Los resultados del presente trabajo indican que la incidencia acumulada de Gripe A durante el periodo de estudio fue de 233,68 casos por cada 100.000 habitantes. Casi el 90% de los pacientes padecía antecedentes patológicos siendo los más prevalentes la patología cardíaca y respiratoria. Además, el 40% de los pacientes hospitalizados presentó complicaciones, principalmente la neumonía. El tratamiento y días de aislamiento fueron según los estándares recomendados. Conclusión: Estos hallazgos muestran la elevada incidencia de gripe A, así como los beneficios de que los equipos de control de la infección realicen el seguimiento del cumplimiento del tratamiento y medidas para evitar la transmisión.
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    Mecanismos moleculares de la traducción cap-independiente de MNSV: análisis estructural y funcional de los factores virales y del huésped= Molecular mechanism of cap-independent translation of MNSV: structural and functional analysis of the viral and host factors involved
    (2016-09-02) Miras Marín, Manuel; Truniger Rietmann, Verónica; Aranda Regules, Miguel A.; Escuela Internacional de Doctorado
    La traducción cap-independiente es frecuente en ARNs virales, los cuáles carecen de estructura 5’-cap y/o cola poli(A) típicas de los ARNm eucarióticos. En su lugar, muchos virus de ARN de plantas tienen elementos de ARN en sus 3’-UTRs capaces de potenciar la traducción independiente de cap (3’-CITEs). Se ha descrito que estos 3’-CITEs se unen directamente y requieren de factores de iniciación a la traducción. (eIF) para su actividad. Hemos demostrado que la traducción cap-independiente de los ARNs del Virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) está controlada por un 3’-CITE en cis. La evidencia genética sugiere una interacción entre la subunidad eIF4E de melón y el 3’-CITE. Sin embargo, la interacción entre el 3’-CITE y eIF4E permanece sin caracterizar. El conocimiento adquirido de esta interacción podría ser usado en estrategias antivirales. De manera importante, la resistencia a MNSV se ha demostrado que está mediada por eIF4E y, recientemente, se ha identificado un nuevo aislado capaz de superar esta resistencia. Por este motivo, los objetivos de esta tesis están enfocados en esclarecer los mecanismos de traducción cap-independiente de ARNs de MNSV y la caracterización de este nuevo aislado que supera la resistencia. En el primer capítulo se ha llevado a cabo la caracterización de este nuevo aislado de MNSV capaz de superar la resistencia mediada por eIF4E. La secuencia nucleotídica del nuevo aislado, denominado MNSV-N, mostró una alta similitud con el resto de aislados de MNSV que no superan la resistencia, incluso en su 3´-UTR. Sin embargo, el inicio de su 3´-UTR contiene una inserción de 55 nucleótidos que es casi idéntica al comienzo del 3´-UTR del virus del amarilleo de las cucurbitáceas transmitido por pulgones (Cucurbit aphid-borne yellows virus) (CABYV), indicando que MNSV-N es un recombinante entre MNSV y CABYV. Mediante la construcción de virus quiméricos se localizó el determinante de virulencia de MNSV-N en su 3´-UTR. Estudios de traducción in vivo en protoplastos de melón demostraron que la inserción de 55 nt funciona como un 3’-CITE y es el responsable de la superación de la resistencia. Así mismo, se clasificó por su estructura secundaria como una nueva clase de 3’-CITE mediante la realización de Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE). En el segundo capítulo, se realizó un análisis estructural y funcional del 3’-CITE y del factor asociado a él, eIF4F, que ambos controlan la traducción de los ARNs de MNSV. Para ello, primero se delimitó a 45 nucleótidos la secuencia mímina capaz de estimular la traducción in vivo en protoplastos de melón. A continuación, estudiamos su estructura secundaria mediante SHAPE y su capacidad para unir al complejo eIF4F en ensayos de UV-Crosslinking seguido de PAGE. Los ensayos in vitro revelaron la unión a eIF4F a través de una zona desapareada del 3’-CITE. Los análisis mutacionales realizados en esa zona conllevaron con la pérdida de traducción y de unión a eIF4F. Por último, los ensayos de mutantes en eIF4E co-agroinfiltrados en trans llevados a cabo, nos sugieren que el complejo eIF4F es necesario para la traducción de estos ARNs, ya que la rotura de la interacción eIF4E:eIF4G está asociada con una pérdida de la actividad traduccional. Por último, en el tercer capítulo estudiamos el modo de interacción entre eIF4E y eIF4G ya que hemos determinado que es necesaria para la traducción de los ARNs virales de MNSV. Para ello se cristalizó la subunidad eIF4E, libre y unida a una versión truncada de eIF4G1003-1092. La difracción por rayos X de los cristales del complejo eIF4F reveló un segundo dominio de unión en eIF4G. Este segundo dominio, o dominio no-canónica, está en contacto con la superficie lateral de eIF4E, la cuál está compartida por otras proteínas que contienen también este segundo dominio de unión. Estos datos sugieren que la interacción eIF4E:eIF4G es bipartita y que hay una competición entre eIF4G y otras proteínas por estas superficies de eIF4E para regular la traducción. SUMMARY Cap-independent translation is frequent for viral RNAs, which are often devoid of 5′-cap structure or/and 3′-poly(A) tail typical of eukaryotic mRNAs. Instead, many plant RNA viruses contain in their 3´-UTRs RNA elements able to enhance their cap-independent translation (3´-CITEs). It has been reported that 3´-CITEs directly bind and require eukaryotic translation initiation factors (eIF) for their function. We have shown that cap-independent translation of Melon necrotic spot virus (MNSV, family Tombusviridae) RNAs is controlled by a 3´-CITE in cis. Genetic evidence indicates that the eIF4E subunit of melon eIF4F is necessary for cap-independent translation of avirulent MNSV RNAs. However, the interaction between 3’-CITE and eIF4E remains uncharacterized. The knowledge gained of this interaction may be used in antiviral strategies. Importantly, MNSV resistance was showed to be eIF4E-mediated and recently, a new resistance-breaking MNSV isolate was identified. Thus, the aims of this thesis is focused on elucidating the mechanisms of cap-independent translation of MNSV RNAs and characterize this new resistance- breaking isolate. In the first chapter, we characterized the newly resistance-breaking MNSV isolate, MNSV-N. It was found a 55 nucleotide insertion in its 3’-UTR which was acquired by interfamilial recombination with the 3’-UTR of an Asiatic Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV, family Luteoviridae) isolate. By constructing chimeric viruses and assaying their properties, we showed that the recombined sequence is responsible for the MNSV-N ability to break down the eIF4E-mediated resistance. Analysis of the translation effiency showed that the insertion funcstions as a 3’-CITE. The structural and functional characterization of this 3’-CITE was set up by Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) and showed that it belongs to a new structural class that we called CXTE (CABYV Xinjiang-like translation element) and functions in absence of eIF4E. In the second chapter, to understand the cap-independent translation of MNSV RNAs, we performed a structural and functional analysis of the 3’-CITE of avirulent MNSV isolates and its partner eIF4F. Thus, we defined the minimal size of the 3´-CITE in “in vivo” translation assays to a sequence of 45 nucleotides. Hereafter, we studied its secondary structure by SHAPE and its ability to bind eIF4F by UV-crosslinking and footprinting assays. In vitro binding assays revealed eIF4F-binding sites on a bulge of 3’-CITE. Mutational analyses in eIF4E revealed amino acids involved in cap-independent translation and suggested that the eIF4F complex is necessary for an efficient translation because the disruption of the complex is associated with a loss in translation activity. Finally, in the third chapter we studied the binding mode of the eIF4E:eIF4G interaction. We previously showed that this binding is required for MNSV RNAs efficiently translate. Thus, subunit eIF4E free and in complex with a truncated eIF4G1003-1092 were crystallized. X-ray data revealed a second eIF4E-binding domain in eIF4G. This second binding domain, or non-canonical binding motif, contacts with the lateral surface of eIF4E which it is shared with other eIF4E-binding proteins (4E-BPs). This data suggests a bipartite eIF4E:eIF4G binding mode that competes with 4E-BPs in translation regulation.