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    Analysis of mycelial growth and development of the desert truffle "Terfezia claveryi" Chatin and microorganisms associated to desert truffle mycorrhizal plants
    (Universidad de Murcia, 2021-12-21) Arenas Jiménez, Francisco; Navarro Ródenas, Alfonso; Morte Gómez, María Asunción; Escuela Internacional de Doctorado
    Terfezia claveryi Chatin es un hongo hipogeo comestible perteneciente al grupo conocido como “trufas del desierto”, localizado principalmente en ecosistemas áridos y semiáridos de la cuenca del Mediterráneo. En su hábitat natural, T. claveryi establece simbiosis ectendomicorrícica con numerosas especies del género Helianthemum y su fructificación es en primavera. Fue la primera especie dentro de las trufas del desierto en ser cultivada, y desde entonces se ha convertido en un cultivo agrícola alternativo en zonas semiáridas de la Península Ibérica, que ha ido incrementándose durante los últimos años. Esta tesis tiene como objetivo principal el estudio del comportamiento miceliar de la trufa del desierto T. claveryi, tanto en laboratorio como en campo, así como los microorganismos asociados a la rizosfera de plantas hospedantes del género Helianthemum con el fin de conocer más su biología y mejorar su cultivo. Para ello, se planteó el desarrollo de cinco objetivos parciales que dieron lugar a los siguientes resultados y conclusiones. Inicialmente, se evaluó el crecimiento miceliar de T. claveryi en condiciones in vitro, probando en el medio de cultivo MMN (sólido y líquido) distintas concentraciones de macronutrientes, micronutrientes y vitaminas, diferentes condiciones de pH, tamaño de inóculo inicial y relación C/N. Los resultados permitieron diseñar un medio de cultivo MMN optimizado que mejoraba la biomasa miceliar producida. Además, el micelio producido en cultivo líquido en biorreactor permitió la producción de planta micorrizada. En segundo lugar, se estudió la dinámica miceliar de T. claveryi s.l. en suelo durante 4 años en distintas zonas naturales y en plantaciones de la Región de Murcia. Para ello, se diseñaron cebadores específicos para la cuantificación de ADN en suelo con la técnica de PCR cuantitativa a tiempo real, en cada una de las estaciones. Finalmente, se desarrolló un protocolo con la pareja de primers Tc452F/TerclaR, que detecta los productos de PCR. La distribución del micelio fue independiente de las características geográficas de las áreas estudiadas. El año fue la única variable que separó significativamente los datos de micelio en dos grupos (años 1-4 y 2-3), existiendo diferencias significativas sólo para las estaciones de invierno y primavera. Además, el micelio de invierno se correlacionó fuertemente con las variables agroclimáticas del otoño previo, siendo positivas para la precipitación, el índice de aridez y la humedad relativa y negativas para la temperatura máxima, el déficit de presión de vapor y la evapotranspiración. En tercer lugar, se aislaron las bacterias de la rizosfera de T. claveryi x H. almeriense a lo largo de las estaciones. Se realizó una caracterizaron fenotípica, bioquímica, molecular y de las actividades PGPR de las colonias bacterianas (solubilización del fósforo, liberación de auxinas, producción de sideróforos y actividad ACC-deaminasa). Los análisis estadísticos revelaron un enriquecimiento significativo en bacterias solubilizadoras de fósforo (liberadoras de ácidos orgánicos) y con actividad ACC-deaminasa durante la época de fructificación del hongo. Además, se confirmó que un cambio del estado fenológico de la planta determinaba un cambio en la comunidad bacteriana vinculado a sus rasgos PGPR. Por último, para conocer la comunidad de hongos asociados a plantas productoras de ascocarpos frente a las plantas no productoras se utilizaron herramientas de secuenciación masiva de ADN, tanto en suelo como en raíz. Se encontraron distintos patrones en la composición de especies de hongos en función de la productividad. Además, algunos modos tróficos fúngicos fueron identificados como relevantes por tener un efecto positivo o negativo sobre la producción de ascocarpos. Finalmente, se encontraron un grupo de OTUs significativos asociados a zonas productivas, que podrían usarse como marcadores para la localización de trufas del desierto.
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    Cultivo de la trufa del desierto : nuevas perspectivas sobre la simbiosis micorrícica, estrategias de adaptación al estrés hídrico y manejo de plantaciones
    (Universidad de Murcia, 2020-01-16) Marqués Gálvez, José Eduardo; Morte Gómez, María Asunción; Pérez Gilabert, Manuela; Escuela Internacional de Doctorado
    Las trufas del desierto son hongos micorrícicos que desarrollan cuerpos fructíferos hipogeos y cuyo hábitat se limita a zonas áridas y semiáridas, principalmente de la cuenca del Mediterráneo y de Oriente Medio. De entre las trufas del desierto destacan los géneros Terfezia y Tirmania, cuyas especies forman ectendomicorrizas con plantas del género Helianthemum. La especie Terfezia claveryi Chatin fue la primera trufa del desierto en ser cultivada junto con la planta hospedante Helianthemum almeriense Pau. La presente tesis tiene el objetivo de aumentar nuestro conocimiento acerca de las trufas del desierto. Para cumplir este objetivo se propusieron cinco objetivos parciales cuyo desarrollo ha dado lugar a diversos resultados y conclusiones. Para evaluar el papel de catalasas fúngicas en la simbiosis T. claveryi y H. almeriense, se purificó una catalasa TcCAT-1 de ascocarpo de T. claveryi que fue caracterizada mediante técnicas bioquímicas, cromatográficas y bioinformáticas. Además, se midieron los niveles de transcripción del gen TcCAT-1 mediante PCR cuantitativa. Los resultados sugieren que TcCAT-1 puede jugar un papel importante durante la micorrización; además, este estudio ha puesto de manifiesto los beneficios de esta micorrización en la respuesta al estrés hídrico. Por otra parte, se secuenciaron los genomas de T. claveryi y Tirmania nivea y el transcriptoma de T. claveryi en micelio libre, micorriza bien regada y micorriza sometida a estrés hídrico; posteriormente se llevó a cabo el análisis bioinformático de todos esos datos. Se han descrito por primera vez los genes MAT de estas especies. También se estudió el patrón de expresión de las enzimas que actúan sobre la pared celular vegetal; este estudio ha revelado una regulación a la baja de estos genes durante la sequía, al mismo tiempo que se producía un cambio de tipo de micorrización, pasando de intercelular a intracelular. En general, las características descritas en este apartado están asociadas al tipo de micorriza formada por estas especies y a su adaptación a los hábitats secos. También se realizó un estudio de los datos que se han ido recogiendo durante 15 años de una plantación experimental de T. claveryi x H. almeriense con el objetivo de determinar los parámetros que más influyen en las fructificaciones de trufas del desierto y en qué momentos del año tienen una importancia mayor. Tras el análisis estadístico de los datos se puso de manifiesto que el índice de aridez en otoño y el potencial hídrico del suelo desde otoño a primavera, parecen ser los parámetros claves. Estos resultados nos han permitido proponer distintos modelos de manejo de plantaciones. En otro de los capítulos de esta tesis se caracterizaron las respuestas morfo-fisio-moleculares de la planta micorrizada H. almeriense durante primavera. Medidas de intercambio gaseoso y de cuantificación de la expresión de determinados genes de acuaporinas, pusieron de manifiesto un cambio brusco en la fenología de la planta que parece estar determinado, mayoritariamente, por el déficit de presión de vapor (DPV). Gracias a este resultado se ha determinado un valor umbral de DPV que está relacionado con la producción de trufas del desierto, y podemos concluir que, en líneas generales, cuanto más tarde se alcance este umbral en la primavera, mayores serán las producciones. Finalmente, con el fin de estudiar la viabilidad de este cultivo si se produjese un aumento en concentración de CO2 atmosférico, se realizó un ensayo en el que sometió a un grupo de H. almeriense micorrizadas con T. claveryi a una elevada concentración de CO2 combinado con un progresivo aumento de la sequía. Los resultados de este ensayo revelan que los efectos de una concentración elevada de CO2 pueden paliar, en parte, los efectos negativos del aumento de la sequía. Summary Desert truffles are mycorrhizal fungi that develop hypogeus fruiting bodies and inhabit arid and semiarid areas, such as the Mediterranean basin or the Middle East. Among desert truffles genera, Terfezia and Tirmania are of special importance. The species that belong to these genera mostly establish ectendomycorrhizal symbiosis with plants of Helianthemum genus. Terfezia claveryi Chatin was the first desert truffle cultivated, using Helianthemum almeriense Pau as its host. This thesis has the objective of deepen the knowledge of desert truffles and their cultivation. To achieve this goal, five specific objectives were proposed that have resulted in several results and conclusions. In order to evaluate the role of fungal catalases in T. claveryi x H. almeriense symbiosis, a catalase, TcCAT-1, from T. claveryi ascocarps was purified to homogeneity and characterized using biochemical, chromatographic and bioinformatic techniques. In addition, transcription levels of the gene TcCAT-1 were measured by quantitative PCR. The results obtained suggest an important role of TcCAT-1 in the mycorrhization; in addition, this study has revealed the benefits of this mycorrhization in the response to water-stress. The genomes of T. claveryi and Tirmania nivea and the T. claveryi transcriptome from free living mycelium, well-watered mycorrhiza and drought-stressed mycorrhiza were sequenced and analyzed with bioinformatics tools. MAT genes have been described in these species for the first time. Furthermore, the expression pattern of plant cell wall degrading enzymes revealed a generalized downregulation of these genes under water-stress conditions. This event occurs in parallel with the type of mycorrhiza that is formed, which changes from intercellular to intracellular. In summary, the genomic and transcriptomic features described in this thesis are associated with the type of mycorrhiza and the dry environments inhabited by these species. During this thesis, data collected during 15 years of an experimental orchard of T. claveryi x H. almeriense were analyzed in order to know what environmental parameters and at what times of the year determine the production of desert truffle the most. After the statistical analysis of the data, we found that autumn first, and spring, secondly, are the key moments that determine T. claveryi yield. Specifically, the aridity index in autumn and the soil water potential from autumn to spring are the most important parameters. With this in mind, several management models are proposed. The morpho-physio-molecular responses of the H. almeriense mycorrhizal plant were characterized during spring. Using gas-exchange and molecular techniques, an abrupt phenology switch was revealed. This switch seems to be determined primarily by the vapor pressure deficit (VPD). Thanks to this, a threshold value of VPD has been established that is related to the desert truffle fructifications: in general terms, the later this threshold is reached, the higher the desert truffle yield. In order to evaluate the viability of this crop under the foreseeable increase in atmospheric CO2 concentrations in the following years, an assay was carried out. This assay consisted of growing a group of T. claveryi mycorrhizal H. almeriense plants under high concentrations of atmospheric CO2, combined with a progressive increase in water-stress conditions. The results of this assay reveal that the effects of a high atmospheric concentration of CO2 partially counteract the negative effects derived from water-stress.
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    Efecto de isavuconazol en los niveles plasmáticos de tacrolimus y ciclosporina A en pacientes receptores de trasplante de progenitores hematopoyéticos: análisis en vida real: ajuste de dosis, interacciones farmacológicas y efectividad clínica
    (Universidad de Murcia, 2025-07-21) Fructuoso González, Lydia; Nájera Pérez, María Dolores; Manresa Ramón, Noemi; Escuela Internacional de Doctorado; Escuela Internacional de Doctorado
    CONTEXTO: Las infecciones fúngicas invasivas (IFI) son una causa importante de morbilidad y mortalidad en pacientes inmunocomprometidos, como los receptores de trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH) y de órgano sólido. Los antifúngicos utilizados en la prevención y tratamiento de las IFI han demostrado ser eficaces, pero su uso puede verse limitado por efectos adversos e interacciones farmacológicas. Isavuconazol (ISA), un antifúngico con un mejor perfil de seguridad y menos interacciones que otros antifungicos, se ha incorporado recientemente en receptores de TPH. Sin embargo, su efectividad en este contexto sigue siendo un área de estudio activa. Además, ISA es un inhibidor moderado de la isoforma 3A4 el citocromo P450 (CYP3A4), lo que puede aumentar las concentraciones séricas de los inhibidores de la calcineurina (CNI), con el consiguiente riesgo de toxicidad cuando se administran concomitantemente. Actualmente, no existe un consenso en la práctica clínica sobre el ajuste de dosis de los CNI al iniciar ISA. OBJETIVO: Evaluar el impacto de la introducción de ISA en los niveles plasmáticos de los CNI y calcular la reducción de dosis necesaria al incorporar este antifúngico en receptores de TPH. Además, analizar la relevancia clínica y el manejo de las interacciones farmacológicas de ISA, un inhibidor moderado de CYP3A4, así como evaluar su indicación, efectividad y duración en la profilaxis y tratamiento de IFI en estos pacientes. METODOS: Estudio retrospectivo de los pacientes receptores de TPH que emplean ISA como tratamiento o profilaxis primaria o secundaria durante >7 días, desde septiembre de 2020 hasta septiembre 2024. Las IFIs se clasifican como posibles, probables o probadas, y se calcula la ratio de IFI de brecha (IFIb), la incidencia acumulada de IFI y la supervivencia global. Para el análisis de las interacciones, se registra la actividad diaria del Servicio de Farmacia (SFH) del Hospital Universitario Morales Meseguer, clasificando las interacciones y reflejando la recomendación farmacéutica correspondiente. En el caso de los CNI, se calcula la relación concentración/dosis (C/D) de cada paciente antes de la administración de ISA y a las 48 horas para determinar la reducción de dosis necesaria. RESULTADOS: Tras 48 horas de coadministración, la relación C/D de tacrolimus aumentó 1,49 veces (p=0,0001), recomendándose una reducción del 33% en la dosis al iniciar ISA, siempre que los niveles se mantengan dentro del rango terapéutico. Con ciclosporina A (CsA), la relación C/D aumentó 1,34 veces (p=0,0020), sugiriéndose una reducción del 25% al iniciar ISA. Se identificaron 151 interacciones farmacológicas potenciales en el 98% de los pacientes, siendo predominantemente moderadas (categoría C: 86%; D: 13%; X: 0,7%), con tacrolimus como la más frecuente (22%). De los 56 receptores de TPH incluidos, se administraron 71 cursos de ISA, de los cuales el 80,3% correspondieron a profilaxis y el 19,7% a tratamiento de IFI (7 casos de IFI posible, 2 casos de IFI probable y 5 casos de IFI probada). La incidencia de IFIb fue del 6,1%, con un caso de Candida glabrata, uno de Mucorales y otro sin identificación definitiva. La incidencia acumulada de IFI (probadas/probables) durante los 4 años de seguimiento fue del 7,1%. La profilaxis con ISA tuvo una mediana de duración de 114 días (rango: 14-1080 días), mientras que, como tratamiento, la mediana fue igualmente de 114 días (rango: 8-1230 días). Ningún paciente falleció dentro de los 42 días posteriores al diagnóstico de la IFI, y la mortalidad global a +365 días post-trasplante fue del 23%. CONCLUSIONES: La coadministración de ISA en receptores de TPH altera significativamente la relación C/D de tacrolimus y ciclosporina A, exigiendo ajustes de dosis y una monitorización continua para optimizar la eficacia y seguridad del tratamiento inmunosupresor.
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    Microbial biodiversity assessment of artificial microhabitats : examples from Egyptian archaeological sites
    (Universidad de Murcia, 2021-04-19) Mohamed Rizk, Samah; Urzì, Clara; Ros Espín, Rosa María; Werner, Olaf; Escuela Internacional de Doctorado
    El objetivo general de esta tesis doctoral fue conocer la diversidad microbiana presente en microhábitats de yacimientos arqueológicos de elevado valor cultural, expuestos constantemente a condiciones ambientales duras y áridas. Se eligieron las pirámides de Djoser y Lahun para llevarlo a cabo, dos de las más antiguas y grandes de la necrópolis de Memphis del antiguo Egipto. El estudio se centró en las bacterias y hongos que habitan las piedras y rocas de estos yacimientos arqueológicos, denominados por sus siglas en inglés, SIB (stone-inhabiting bacteria) y RIF (rock-inhabiting fungi). Se realizaron estudios comparativos microbianos mediante análisis de metabarcoding basado en amplicones, métodos de aislamiento tradicionales de cultivo in vitro y técnicas de microscopía de epifluorescencia. El análisis de metagenómica de ambas pirámides permitió identificar 644 especies de bacterias y 204 de hongos. En los ensayos de aislamiento se identificaron 28 especies bacterianas y 34 de hongos. Un total de 19 especies de bacterias y 16 de hongos dependían exclusivamente del cultivo, mientras que 92 especies de bacterias y 122 de hongos eran independientes del cultivo. Las bacterias más abundantes fueron de los géneros Bacillus, Blastococcus y Planococcus. Los hongos más abundantes fueron Knufia karalitana y Pseudotaeniolina globosa. Se realizó la caracterización morfológica, fisiológica y molecular de la cepa del hongo meristemático negro P. globosa, aislada en la pirámide de Djoser y se comparó con una cepa italiana. Todos los datos confirmaron la coespecificidad de las dos cepas. Sin embargo, la egipcia fue capaz de crecer en rangos más amplios de temperatura y pH que la italiana, así como a niveles extremos de salinidad y mostró mucha más tolerancia al calor y a las radiaciones UV. Sobre la base de los resultados filogenéticos usando cinco marcadores (ITS, nrSSU/18S, nrLSU/28S, BT2 y RPB2), P. globosa se atribuyó a la familia Teratosphaeriaceae (Capnodiales). La cepa egipcia se puede considerar una biovariante bien adaptada a entornos extremos y duros. Asimismo, se diseñaron dos marcadores moleculares específicos para detectar rápidamente y a bajo coste la presencia de Actinobacteria que viven sobre piedras (SIAb) antes de realizar análisis adicionales. La búsqueda de marcadores se centró en la vía de la síntesis de aminoácidos similares a las micosporinas (MAAs). Mediante “minería genómica” se obtuvieron dos genes candidatos: un homólogo de un gen clave en los MAAs y las vías del siquimato conocido como DAHP II (aroF) y otro homólogo del gen Corismato mutasa (cm2). Ambos se encontraron principalmente en Actinobacteria. Después de la calibración los cebadores de nuevo diseño se aplicaron con éxito al ADN ambiental extraído de las pirámides de Djoser y Lahun utilizando PCR cuantitativa. Se concluyó que la diversidad microbiana en ambas pirámides fue mayor de lo esperado, considerando las duras condiciones de los sitios de muestreo. Se confirmó que el mejor enfoque metodológico para estudiar una comunidad microbiana compleja es a través de la combinación de microscopía e identificación molecular para microbios dependientes del cultivo y de métodos de metagenómica para aquellos independientes del cultivo. El potencial efecto biodeteriorante de algunos de los SIB y RIF hallados sobre tan importante patrimonio cultural requiere atención para diseñar planes y buscar soluciones de conservación para limitar su presencia. El desarrollo de nuevos métodos de identificación de SIAb permite un mayor conocimiento de la diversidad de organismos presentes en los monumentos al aire libre ya que puede llevar al descubrimiento de nuevas especies o biovariantes. El conocimiento de los mecanismos precisos de los microorganismos para habitar los monumentos y su papel en el biodeterioro está poco estudiado, lo que exige más investigación en el futuro, tanto a nivel genómico, como transcriptómico y metabólico utilizando enfoques basados en secuenciación de nueva generación y bioinformática.
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    Physiological and molecular mechanisms of the plant-microbe interactions in the mycorrhizal symbiosis of Terfezia claveryi Chatin
    (Universidad de Murcia, 2023-07-06) Guarnizo Serrudo, Ángel Luigi; Navarro Ródenas, Alfonso; Morte Gómez, María Asunción; Escuela Internacional de Doctorado
    La trufa del desierto Terfezia claveryi es un hongo ectendomicorrícico hipogeo comestible con alto valor culinario y propiedades beneficiosas para la salud. Aunque su cultivo ha avanzado, la producción sigue siendo variable y errática, y es necesario estudiar los parámetros en la interacción hongo-bacteria-planta para lograr una producción estable y hacer frente a estreses ambientales, como el estrés hídrico, y al cambio climático. Esta Tesis Doctoral tiene como objetivo principal profundizar en el conocimiento del cultivo de la trufa del desierto usando como sistema modelo la simbiosis entre Helianthemum spp. y T. claveryi estudiándola desde un punto de vista fisiológico y molecular, teniendo en cuenta como los factores ambientales pueden afectar ambos procesos. En primer lugar, se propuso estudiar el impacto del CO2 atmosférico en la simbiosis micorrícica con un hospedante anual como Helianthemum salicifolium. Las plantas de H. salicifolium se cultivaron en cámaras de cultivo con CO2 a doble concentración y se midieron diferentes variables fisiológicas y morfométricas, relaciones hídricas y micorrización. Los resultados mostraron que la fotosíntesis, biomasa y micorrización aumentaron sin alterar el equilibrio nutricional de la planta. Por lo tanto, se sugiere el uso de plantas anuales como alternativa a las perennes para el cultivo de trufas del desierto en un escenario de cambio climático. En segundo lugar, se realizó un estudio para determinar si la micorrización entre Helianthemum almeriense y T. claveryi podría ser incrementada mediante la aplicación de la “mycorrhizal helper bacteria” MHB Pseudomonas mandelii #29 bajo estrés hídrico y si esto podría mejorar las relaciones hídricas de la planta. Se evaluó el efecto de la combinación de la inoculación con la MHB bajo dos regímenes de agua diferentes (riego adecuado y condiciones de sequía) sobre el desarrollo micorrícico, las propiedades hidráulicas de las raíces, la expresión génica de acuaporinas y las hormonas vegetales. Los resultados mostraron que la presencia de P. mandelii #29 en condiciones de sequía produjo en un efecto sinérgico, ya que potenció la colonización fúngica. Además, hubo una mejor regulación de las relaciones hídricas ya que las acuaporinas estuvieron mejor reguladas. El estudio alenta a comprender las complejas interacciones entre las bacterias MHB y los hongos micorrícicos en el contexto de la sequía para mejorar el manejo de las plantaciones. En tercer lugar, se estudió la expresión génica en las raíces de las plantas de H. almeriense micorrizadas con T. claveryi durante el desarrollo micorrícico. Se usó PCR en tiempo real para analizar genes de la planta y del hongo y se encontró que las alteraciones en la morfología y la intensidad micorrícica se asociaron con cambios en la expresión génica. La asociación entre H. almeriense y T. claveryi se dividió en tres etapas: la etapa presimbiótica, la etapa de simbiosis temprana y la etapa de simbiosis tardía. Se identificaron ciertos genes que desempeñan un papel clave en la entrada del hongo en la raíz y el establecimiento de la simbiosis. La TcAQP1 de T. claveryi parece jugar un papel importante en el establecimiento de la simbiosis. Por último, se analizó la dinámica estacional de la comunidad microbiana asociada a una plantación productora de trufas del desierto, empleando secuenciación de nueva generación (metagenómica). Los resultados indican que tanto la comunidad bacteriana como la fúngica están influenciadas por las estaciones del año, aunque el efecto fue mayor sobre la comunidad bacteriana. Además, los parámetros fisicoquímicos del suelo también afectaron a la comunidad microbiana. La abundancia de T. claveryi en el suelo estuvo muy marcada por la estacionalidad, ya que aumentó significativamente en invierno y luego disminuyo en primavera, pudiendo este micelio extraradical destinarse a la producción de la trufa.
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    Regulación de la expresión de genes endógenos por la maquinaria de silenciamiento génico mediado por RNA en Mucor circinelloides
    (2014-07-16) Vila Martínez, Ana; Ruiz Vázquez, Rosa Mª; Nicolás Molina, Francisco Esteban; Facultad de Biología
    Mucor circinelloides es un hongo filamentoso utilizado como modelo para el estudio del mecanismo de silenciamiento génico mediado por RNA. Una vez caracterizado dicho mecanismo y los principales genes implicados, se pretende determinar el papel de la ruta de silenciamiento en la regulación de genes endógenos, así como identificar otros posibles elementos genéticos que participen en dicha ruta. Para ello, se plantean los siguientes objetivos concretos: 1. Identificación del gen implicado en la eliminación de la cadena pasajera de los siRNAs y estudio de la existencia de interacciones entre las proteínas de la maquinaria de silenciamiento. 2. Estudio de la participación de Ago-1 en la biogénesis de los distintos tipos de ex-siRNAs de M. circinelloides. 3. Identificación de los genes regulados por el mecanismo de silenciamiento mediante el análisis de los perfiles transcriptómicos de la estirpe silvestre y de mutantes en genes de silenciamiento. 4. Caracterización fenotípica detallada de los mutantes afectados en la ruta de silenciamiento, para identificar los procesos celulares regulados mediante dicho mecanismo. Para desarrollar estos objetivos se ha utilizado la siguiente metodología: 1. La identificación de otros genes implicados en el mecanismo de silenciamiento se llevó a cabo mediante la disrupción de los genes candidatos por recombinación homóloga y su posterior análisis fenotípico. Para ello, se utilizaron técnicas de amplificación de DNA mediante PCR, clonación, transformación de protoplastos e hibridaciones tipo Southern y Northern. Las interacciones entre proteínas de la maquinaria de silenciamiento se analizaron mediante el sistema de doble híbrido de levaduras. 2. La participación de Ago-1 en la biogénesis de los ex-siRNAs se analizó mediante la secuenciación de librerías de sRNAs. Ago-1 fue purificada mediante FLPC para el aislamiento y secuenciación de los sRNAs unidos a ella. Los datos obtenidos fueron validados experimentalmente mediante hibridaciones tipo Northern. 3. El análisis transcriptómico de las distintas estirpes se realizó mediante hibridaciones con micromatrices y secuenciación de RNA (RNA-seq). 4. El análisis fenotípico de los mutantes en genes de silenciamiento incluyó la cuantificación de la producción de esporas vegetativas y zigosporas, el estudio de la respuesta frente a diferentes situaciones de estrés, la cuantificación del proceso de autolisis y el análisis de la virulencia en Galleria mellonella. Los resultados obtenidos permitieron alcanzar las siguientes conclusiones: 1. El gen qip es esencial para el eficaz funcionamiento del mecanismo de silenciamiento génico inducido por transgenes, sugiriendo un papel en la activación del complejo RISC. No se detectaron interacciones entre proteínas de la maquinaria de silenciamiento de M. circinelloides, lo que podría deberse a la necesidad de modificaciones post-traduccionales específicas de las proteínas de silenciamiento o a la formación de complejos multiproteicos. 2. El gen ago-1 está implicado en el mecanismo de silenciamiento endógeno de M. circinelloides, siendo necesario para la biogénesis y/o estabilidad de las cuatro clases de ex-siRNAs. Las clases I y II de ex-siRNAs se unen específicamente a Ago-1 para llevar a cabo la identificación y degradación de sus mensajeros diana. Las clases III y IV son generadas por una ruta de silenciamiento no canónica, en la que se requiere la participación de Ago-1, pero no la unión específica de estos ex-siRNAs a dicha proteína. 3. Los análisis transcriptómicos ponen de manifiesto que el mecanismo de silenciamiento posee un papel modulador de la expresión de un gran número de genes endógenos a lo largo del crecimiento vegetativo. Las funciones de las proteínas cifradas por estos genes están relacionadas con la biogénesis y modificación de la pared celular, el control de la división celular y el crecimiento, metabolismo de carbohidratos, envejecimiento celular o respuesta a estrés. 4. La ruta canónica de silenciamiento está implicada en la regulación del proceso de esporulación vegetativa y en la activación del programa de autolisis inducido por estrés nutricional. La regulación del desarrollo sexual debe ser llevada a cabo por una ruta no canónica independiente de Dicer. Los experimentos de patogénesis no revelan una clara participación del mecanismo de silenciamiento en el proceso de virulencia, aunque no se descarta una respuesta diferencial en otros organismos modelo, como el ratón. Regulation of endogenous gene expression by the RNA silencing mechanism in Mucor circinelloides. Mucor circinelloides is a filamentous fungus used as a model for studying the RNA silencing mechanism. Once the mechanism and main genes involved were characterized, the next goal is to determine the role of the RNA silencing pathway in the regulation of endogenous genes, and to identify other possible genetic elements that participate in the pathway. To do this, the following specific objectives were proposed: 1. Identification of the gene involved in the removal of the passenger strand of siRNAs duplex, and analysis of the interactions between silencing proteins. 2. Study of the participation of Ago-1 in the biogenesis of different classes of ex-siRNAs in M. circinelloides. 3. Identification the genes regulated by the RNA silencing mechanism by analyzing the transcriptome of the wild type and silencing mutants. 4. Phenotypic characterization of mutants affected in the silencing pathway to identify the cellular processes regulated by this mechanism. To develop these objectives the following methodology has been used: 1. Identification of other genes involved in the silencing pathway was addressed by disrupting candidate genes by homologous recombination and subsequent phenotypic analysis. To this end, PCR amplification of DNA fragments, cloning, transformation of protoplasts and Southern and Northern blot hybridizations were carry out. The study of interaction between RNA silencing proteins was performed using the yeast two-hybrid system. 2. cDNA libraries of sRNAs were generated and sequenced to analyze the participation of Ago-1 in the biogenesis of ex-siRNAs. Ago-1 was purified by FPLC for the isolation and sequencing of Ago-1 bound sRNAs. The sequencing data were validated by Northern-blot experiments. 3. Transcriptomic analysis of the different strains was carried out by hybridization methods using microarrays and RNA sequencing (RNA-seq). 4. Phenotypic analysis of silencing mutants included quantification of vegetative spore and zygospores, study of the response to different stresses, quantification of the autolysis process and virulence analysis of the different silencing mutants in Galleria mellonella. The results allowed reaching the following conclusions: 1. The qip gene is essential for transgene-induced gene silencing, suggesting a role in the activation of the RISC complex. No interactions were detected between proteins involved in the RNA silencing pathway of M. circinelloides. This could be due to the need for specific post-translational modifications of silencing proteins or the formation of multiprotein complexes. 2. Ago-1 is involved in endogenous RNA silencing in M. circinelloides, and it is necessary for the biogenesis and / or stability of all ex–siRNAs classes. Classes I and II of ex-siRNAs specifically bind to Ago-1 for the identification and degradation of their mRNA targets. Classes III and IV are generated by a non-canonical silencing mechanism that requires the participation of Ago-1, but there is not specific binding of these ex-siRNAs to Ago-1 protein. 3. Transcriptomic analysis showed that the silencing mechanism has a modulatory role in the expression of a large number of endogenous genes during vegetative growth. The functions of the proteins coded by these genes are linked to the biogenesis and modification of the cell wall, the control of cell division and growth, carbohydrate metabolism, cell aging or stress response. 4. The canonical RNA silencing pathway is involved in regulation of vegetative sporulation and autolysis induced by nutritional stress. Sexual development should be regulated by a non-canonical Dicer-independent RNA pathway. Pathogenesis experiments did not reveal a role of RNA silencing in the virulence process, but a differential response can’t be ruled out when using other model organisms, such as mouse.
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