Browsing by Subject "Reproducción en animales"

Now showing 1 - 8 of 8
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Advances in in vitro and in vivo porcine embryo production
    (Universidad de Murcia, 2018-06-28) Nohalez Ruiz, Alicia; Martínez García, Emilio Arsenio; Cuello Medina, Cristina; Gil Corbalán, María Antonia; Escuela Internacional de Doctorado
    Los objetivos generales de la presente tesis doctoral fueron incrementar la eficiencia de los sistemas actuales de PIV de embriones y la mejora de las técnicas de transferencia de embriones, y estos se concretaron en los siguientes objetivos específicos: (1) analizar la eficacia de dos combinaciones de CPAs: EG+DMSO y EG+PG para la vitrificación de ovocitos sobre los parámetros de viabilidad, fecundación y desarrollo embrionario, (2) evaluar el efecto de tres IRMs: dbcAMP, cicloheximida y cilostamida y sus interacciones con las gonadotropinas sobre la maduración meiótica y el desarrollo embrionario de ovocitos porcinos, (3) determinar los efectos de la adición de AsA, en los medios de maduración, fecundación y cultivo embrionario sobre los parámetros de maduración, fecundación y desarrollo embrionario, así como el efecto de la adición de AsA en los medios de vitrificación sobre la viabilidad después del calentamiento, (4) investigar los efectos del número de partos, la estación del año y el intervalo destete-celo sobre los parámetros embrionarios en día 6 después de la inseminación de donantes superovuladas en el celo post-destete, (5) explorar la posibilidad de re-vitrificar embriones porcinos obtenidos in vivo (6) evaluar la eficacia de los tanques de nitrógeno seco para mantener la viabilidad y la calidad de embriones porcinos obtenidos in vivo y vitrificados durante un periodo de 3 días y (7) investigar en cerdas receptoras como influye el número de partos en su capacidad reproductiva después de la NsDU-ET. Metodología: Para las técnicas in vitro, se utilizó un sistema de producción in vitro de embriones dónde los ovocitos fueron obtenidos de cerdas prepúberes procedentes de matadero. Durante el proceso, los parámetros de fecundación y desarrollo embrionario fueron evaluados. Para la vitrificación y calentamiento de embriones u ovocitos se utilizó el sistema SOPS. En las técnicas in vivo, después de la detección del estro y la inseminación artificial, los embriones fueron recolectados y evaluados. Las transferencias de embriones se realizaron de una manera no quirúrgica. Las conclusiones de la presente tesis doctoral fueron. 1. En ausencia de vitrificación, los efectos tóxicos de los medios de vitrificación sobre ovocitos en estadio de VG fueron mínimos y similares para ambas combinaciones de CPA. 2. Se pueden obtener blastocistos de alta calidad mediante la vitrificación de ovocitos inmaduros. Sin embargo, la tasa de blastocistos fue muy baja y el desarrollo embrionario de los ovocitos vitrificados fue menor comparado con el de los controles. 3. La interacción de las Gns con los tres inhibidores reversibles de la meiosis (dbcAMP, cicloheximida y cilostamida) aceleraron la progresión meiótica hasta el estadio de MII. La presencia de dbcAMP durante la primera fase de la maduración pudo incrementar, incluso duplicar la capacidad de los ovocitos para alcanzar el estadio de blastocisto. 4. La suplementación de medio de IVM/IVF/IVC con AsA (50 µg/mL) no mejoró los resultados de la PIV de embriones. Por el contrario, la adición de AsA a los medios de vitrificación y calentamiento aumentó la supervivencia después de la vitrificación. 5. El número de partos de la donante no afectó las tasas de gestación y de fecundación así como el número y calidad de los embriones de día 6, independientemente de la estación del año (desde otoño a primavera) o del IDC (3 o 4 días). 6. Los blastocistos porcinos derivados de embriones vitrificados y calentados podrían re-vitrificarse con buenas tasas de supervivencia. 7. El DS es un eficiente sistema para almacenar embriones vitrificados durante un periodo de tres días, sin afectar la viabilidad después del calentamiento. 8. Las tasas de gestación y fecundación así como el tamaño de camada no se vieron afectadas por el número de partos de las receptoras después de la transferencia no quirúrgica de embriones. The general objectives of this work were to enhance the efficiency of the IVP of porcine embryos and to improve the porcine ET technology. With this propose, the specific objectives contained in this thesis were: (1) To study the effectiveness of two combinations of CPAs, EG+DMSO or EG+PG, for the vitrification of GV stage porcine oocytes and their effects on the oocyte viability, fertilization ability, and the subsequent developmental competence (2) To evaluate the effect of three MINs (dbcAMP, cycloheximide and cilostamide) and their interactions with Gns on the meiotic maturation and developmental competence of porcine oocytes (3) To determine the effects of AsA supplementation to the IVM, IVF and IVC media, on the maturation, fertilization and embryonic developmental parameters, and to assess the effects of adding AsA to vitrification and warming defined media on the vitrification survival of IVP-porcine blastocysts (4) To investigate the effects of parity, season and WEI on the reproductive and embryonic parameters at day 6 after insemination of donor sows superovulated at postweaning estrus (5) To explore the possibility of re-vitrify in vivo-derived porcine embryos (6) To assess if the DSs is adequate for maintaining the viability and quality of vitrified in vivo-derived porcine embryos for a 3-day storage period (7) To investigate the effects of the recipients’ parity on their reproductive performance after NsDU-ET. Methodology: For the in vitro system, production of porcine embryos was performed using ovaries from prepubertal gilts at a local slaughterhouse. Fertilization and embryo development parameters were assessment. Vitrification and warming of oocytes and embryos was performed by SOPS system. For in vivo techniques, after estrus detection and artificial insemination, embryos were recovered and evaluated. Embryos were transferred by non-surgical deep uterine embryo transfer. The conclusions of this thesis were: 1. In the absence of vitrification, the toxic effects of the vitrification media on the GV oocytes were minimal and similar for both CPA combinations. 2. High-quality blastocysts can be produced from SOPS vitrified immature oocytes. However, the blastocyst rate remained very low, and the developmental competence of the vitrified oocytes was reduced compared with the non-vitrified controls. 3. The interaction of Gns with the three MINs tested (dbcAMP, cycloheximide and cilostamide) accelerated meiotic progression to the MII stage. The presence of dbcAMP during the first period maturation increased or even doubled the capacity for oocyte development to the blastocyst stage. 4. Under our experimental conditions, the supplementation of IVM/IVF/IVC media with AsA (50 μg/mL) failed to improve the IVP-outcomes. In contrast, the addition of AsA to chemically defined vitrification and warming media enhanced the blastocysts survival. 5. The parity of donor multiparous sows did not affect the pregnancy and fertilization rates and the number and quality of 6-day-old embryos, regardless of the time of the year (from fall to spring) or the WEI (3 or 4 days). 6. 6. Porcine blastocysts derived from vitrified and warmed embryos could be re-vitrified with quite good survival rates. 7. The DS is an efficient system for the storage of vitrified embryos for a storage period of three days, without affecting their viability after warming. 8. The pregnancy and farrowing rates and litter sizes were not affected by the recipients’ parity after NsDU-ET.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Alteraciones histológicas debidas al envejecimiento en el túbulo seminífero del hámster sirio (mesocricetus auratus)
    (2016-03-02) Horn Ureña, Ramón; Beltrán Frutos, Ester; Pastor García, Luis Miguel; Departamento de Biología Celular e Histología
    Un área muy actual de investigación es el estudio de las causas del envejecimiento. En el ámbito de la biología reproductiva también lo está siendo por sus implicaciones tanto en la medicina como en la veterinaria. Si durante muchos años los estudios se han centrado en la mujer o en las hembras para explicar el descenso reproductivo con la edad actualmente se está prestando más atención al factor masculino. Estos estudios abordan varios aspectos: cambios endocrinos, alteraciones de los espermatozoides, trasmisión de enfermedades hereditarias, o la necesidad de terapias sustitutivas de testosterona en la vejez. Respecto a los cambios histológicos del testículo envejecido, se han realizado diversos estudios desde hace décadas, pero han dejado ciertas cuestiones sin aclarar y se han centrado en el hombre y en la rata. Junto a esto, durante los últimos años, diversos autores han propuesto que el mecanismo tisular implicado en la progresiva disminución de la espermatogénesis con la edad, está relacionado con cambios en el equilibrio entre la proliferación/apoptosis en el epitelio seminífero. En la presente tesis doctoral nos hemos propuesto por un lado, realizar un completo análisis histológico tanto cualitativo como cuantitativo de los cambios que acontecen con la edad en el epitelio seminífero y pared tubular del hámster sirio. Por otro, hemos investigado también si la proliferación está o no alterada en este epitelio relacionándola con las alteraciones histológicas observadas en el mismo. Para ello, utilizamos hámsteres machos de 6, 12 y 24 meses de edad. Los testículos fueron fijados y procesados para microscopia de luz convencional e inmunohistoquimica y, electrónica de transmisión. Se realizó un estudio semicuantitativo del tipo histológico de degeneración de las secciones de los túbulos seminíferos determinando el grado de progresiva alteración de su epitelio con la edad. Inmunohistoquímicamente se identificó la inmunoreactividad a laminina y fibronectina en la pared tubular y las células en proliferación. Morfométricamente se calculó una serie de parámetros testiculares y el volumen total de inmunoreactividad a fibronectina y laminina. Respecto a la proliferación se calculó el índice total de proliferación como el número de células proliferando por tipo histológico de sección tubular. Por último, con las secciones ultrafinas se realizó una descripción ultrarestructural del epitelio seminífero y se calculó el grosor de la pared tubular. En los animales envejecidos se observó un incremento significativo de las secciones tubulares con diversas alteraciones del epitelio seminífero especialmente hipoespermatogénesis y detención de la espermatogénesis. El volumen del testículo, el diámetro y volumen del túbulo como el volumen de epitelio del túbulo seminífero sufrieron un descenso significativo con la edad, por el contario la longitud del túbulo se incrementó. El volumen de fibronectina y laminina aumento en los animales viejos siendo el índice de proliferación menor en estos animales. El número de células en proliferación por tipo histológico de sección de túbulo seminífero fue progresivamente y significativamente menor en las secciones alteradas respecto a las secciones normales. No se observó diferencias significativas respecto a la edad entre tipos histológicos de sección de túbulo seminífero. Ultraestructuralmente se observó alteraciones citológicas importantes en la célula de Sertoli así como en el proceso de espermiogénesis. La pared presentó un engrosamiento significativo tanto en los túbulos normales como en los hipoespermatogénicos o en detención de la espermatogénesis. En conclusión, el envejecimiento del túbulo seminífero del hámster supone una pérdida progresiva de la actividad espermatogénica que está relacionada con cambios del túbulo y de su pared. Estos cambios no se producen de forma uniforme en todo él y se asocian a una disminución de la proliferación celular en sus zonas alteradas histológicamente. Éstas presentan además células de Sertoli modificadas ultraestructuralmente. A very current area of research is the study of the causes of aging. In the field of reproductive biology the aging is important by their implications both in medicine and veterinary. If for many years the studies have focused on women or females to explain the reproductive decline with age it is now being paid more attention to male factor. These studies address several aspects: endocrine changes, abnormal sperm, transmission of hereditary diseases, or the need for testosterone replacement therapy in older age. Regarding the histological changes of aging testes, they have conducted several studies for decades, but have left some issues unclear and have focused on humans and rats. Alongside this, in recent years, several authors have proposed that the mechanism involved in decrease of spermatogenesis with age, is related to changes in the balance between proliferation / apoptosis in the seminiferous epithelium. In this thesis we have proposed on the one hand, a complete histological analysis of qualitative and quantitative changes that occur with age in the seminiferous epithelium and tubular wall of the Syrian hamster. Furthermore, we have also investigated whether this proliferation in the epithelium altered is linked with the histological changes observed in it. To do this, we use male hamsters 6, 12 and 24 months old. The testes were fixed and processed for conventional light microscopy, immunohistochemistry and transmission electron microscopy. A semiquantitative histological study of sections of seminiferous tubules for determining the degree of gradual deterioration with age, in its epithelium was performed with age. Immunoreactivity to laminin and fibronectin in the tubular wall and proliferating cells was identified. Morphometrically a series of testicular parameters and the total volume of fibronectin and laminin immunoreactivity was calculated. The total proliferation index as the number of proliferating cells by histologic type of tubular section was calculated. Finally, with ultrathin sections, an ultrarestructural description of seminiferous epithelium, and thickness determination of tubular wall was performed. In aged animals a significant increase in the tubular sections with various disorders especially hypospermatogenesis of seminiferous epithelium and arrest of spermatogenesis was observed. The testicular volume, diameter and volume as epithelial volume of seminiferous tubule suffered a significant decrease with age, on the contrary an increased tubule length was observed. An increase in fibronectin and laminin volume in old animals and less proliferation rate in these animals was determined. The number of proliferating cells per histologic section of seminiferous type tubule, progressively and significantly decrease in altered sections respect to normal sections. No significant differences respect to age between histological types sections of seminiferous tubule was observed. Ultrastructurally important cytological changes were observed in the Sertoli cell and the process of spermiogenesis. The wall thickening showed an increase significant in normal, hipospermatogenic and spermatogenesis arrest tubules. The number of proliferating cells per histologic section of seminiferous type tubule, progressively and significantly decrease in altered sections respect to normal sections. In conclusion, the aging of the seminiferous tubule hamster suppose a loss of spermatogenic activity which is related to changes in the tubule and its wall. These changes do not occur uniformly throughout the tubule and they associated with a decrease in cell proliferation in altered tubular areas. These areas also have Sertoli cells with a modified ultrastructure.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Aproximación fisiológica para la optimización del sistema de producción de embriones in vitro en la especie porcina
    (Universidad de Murcia, 2019-09-19) García Martínez, Soledad; Coy Fuster, Pilar; Romar Andrés, Raquel; Bernabò, Nicola; Escuela Internacional de Doctorado
    El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es la aproximación de las condiciones de IVF y EC a las registradas en el tracto reproductor de la cerda para la mejora de la producción in vitro de embriones en la especie porcina. Con este fin, se realizaron cuatro experimentos. Los dos primeros consistieron en la modificación de los medios de cultivo utilizados durante la IVF y el EC mediante la adición de proteínas específicas o fluidos naturales presentes en el oviducto y el útero de la cerda. Los dos últimos experimentos consistieron en obtener in vivo los valores de referencia para parámetros físico-químicos como el oxígeno y temperatura del interior de los órganos reproductores de la cerda, y transferirlos a las condiciones in vitro. En el primer experimento, ovocitos porcinos madurados in vitro fueron incubados en un medio con heparina, ezrin, HSP-70-1A o HSP-90α a excepción del grupo control. Estos mismos grupos fueron utilizados durante la IVF. Los resultados mostraron que heparina y cada una de las proteínas por sí mismas eran capaces de endurecer la zona pelúcida de los ovocitos porcinos, es decir, aumentar los tiempos de digestión para la zona pelúcida. La combinación de heparina con cada una de las proteínas aumentó esos tiempos, excepto para HSP-90α donde disminuyó. Aunque prometedores, ya que el efecto de heparina y cada una de las proteínas añadidas al medio de IVF redujeron las tasas de polispermia, los resultados también mostraron bajas tasas de penetración cuando estas moléculas fueron añadidas a los medios, de manera que no se consiguió la mejora de la técnica de IVF con este enfoque. En el segundo experimento se compararon dos métodos de selección espermática. Uno de los métodos más utilizados para la especie porcina, centrifugación a través de un gradiente de densidad, se comparó con un nuevo procedimiento que hizo que los espermatozoides nadaran en un tubo que contenía un medio de cultivo con o sin fluido oviductal porcino (POF) con la intención de imitar los cambios sufridos por los espermatozoides en su ascenso por el tracto reproductor femenino. Por otro lado, se compararon dos sistemas de producción de embriones. Un nuevo sistema de cultivo, donde se añadió de forma secuencial POF al medio de IVF, y POF y fluido uterino porcino (PUF) a los medios de EC, frente a un sistema de producción de embriones donde no se añadió estos fluidos a los medios. Los resultados indicaron que la utilización de swim-up como método de selección espermática para la producción de embriones porcinos alcanzó el 40 % de rendimiento, indicando una mejora con respecto a los mejores resultados previos registrados en cerdos (30 -35 %). Además, ese valor incrementó un 5 % cuando los fluidos reproductivos fueron añadidos a los distintos medios de cultivo, superando incluso el valor de rendimiento dado para la especie bovina. Igualmente, la adición de los fluidos a los medios mejoró la calidad de los embriones obtenidos, alcanzando un número medio de células similar al de embriones obtenidos in vivo. En el tercer y cuarto experimento se realizaron una serie de mediciones de oxígeno y temperatura en el tracto reproductivo de cerdas adultas y cerdas pre-púberes, en distintas fases del ciclo estral, usando técnicas de cirugía y sondas mínimamente invasivas. A continuación, los valores obtenidos se transfirieron a las técnicas de IVF y EC, con el propósito de mejorar la producción de embriones porcinos in vitro. El tercer experimento reveló por primera vez la cantidad de oxígeno dentro de los órganos reproductivos de la cerda adulta (7 %), siendo este valor mayor (10 %) para cerdas pre-púberes tratadas con hormonas. Se observaron dos perfiles para las medidas de oxígeno: perfil plano, donde la variación de oxígeno fue mínima respecto al promedio, y un perfil ondulado que presentó pequeñas variaciones (±2) respecto al promedio. El perfil ondulado fue asociado al útero. El uso de condiciones de hipoxia (7 % oxígeno) durante la IVF seguido del EC mejoró la producción de embriones porcinos y la calidad de los blastocistos obtenidos. En el cuarto experimento se demostró la existencia de un gradiente de temperatura entre oviducto (37.0 ºC) y útero (38.7 ºC) por primera vez. La transferencia de ese gradiente durante las técnicas de IVF y EC mejoró la producción de embriones in vitro en la especie porcina a través de la reducción de los ratios de polispermia. El uso de una temperatura elevada (39.5 ºC) durante la IVF ejerció el efecto contrario al uso de una temperatura baja (37.0 ºC), ya que aumentó los ratios de polispermia y se pudo intuir una mayor fragmentación de los embriones producidos a esa temperatura. La obtención de la temperatura de transición para espermatozoides capacitados de verraco (37.0 ºC), así como la incubación de esos espermatozoides a distintas temperaturas (37.0 ºC, 38.5 ºC y 39.5 ºC) determinó un papel relevante de ésta en la remodelación de los lípidos de la membrana plasmática del espermatozoide y su implicación en la IVF. The objectives of this PhD Thesis are approaching the IVF and CE conditions to those recorded in the sow's reproductive tract for the improvement of the in vitro production of porcine embryos. To this end, four experiments have been carried out. The first two consisted of the modifications in the culture media used during IVF and CE by adding either specific proteins or natural fluids present in the oviduct and uterus of sows. The last two experiments consisted of obtaining in vivo, inside the reproductive organs of the female pig, the reference values for physical-chemical parameters such as oxygen and temperature, and transfer them to in vitro conditions. In the first experiment, porcine oocytes matured in vitro were incubated in a medium with heparin, ezrin, HSP-70-1A or HSP-90α. These same groups were used during IVF since heparin or proteins were added to the IVF medium with the oocytes and spermatozoa. In the control groups, gametes were incubated in a medium without heparin nor proteins. The results showed that heparin and each of the tested proteins hardened the ZP of the porcine oocytes, by increasing its resistance to enzymatic digestion. The combination of heparin with each of the proteins increased such hardening effect, except for HSP-90α, where the the ZP´s resistance was reduced. While promising, since the effect of heparin and each of the proteins added into the IVF medium drafted the polyspermy rates, IVF outcome was not improved because of the reduction in the penetration rates. In the second experiment, two sperm selection methods were compared. One of the widely used procedures in swine, the density gradient centrifugation, was compared with a new procedure, which made the sperm swam up in a tube containing culture media with or without porcine oviductal fluid (POF). On the other hand, two IVEP systems were compared. A new system containing POF and porcine uterine fluid (PUF) within the culture media during IVF and EC was compared with a system where those biofluids were not added to the culture media. The results indicated that the use of swim-up as sperm selection procedure for the production of porcine embryos reached a 40% yield, indicating an improvement with regard to the best results obtained in pigs up to date (30-35%). Furthermore, that value increased in a 5% when the reproductive fluids were added to the different culture media, even surpassing the value of the yield given for the bovine species. Likewise, the addition of the fluids to the media improved the quality of the porcine in vitro embryos produced, which achieved a mean number of cells similar to porcine embryos collected in vivo. In the third and fourth experiments, a series of measurements of oxygen and temperature were made in the reproductive tract of sows and gilts at different phases of the estrous cycle, using minimally invasive surgery techniques and new probes. The values obtained were then transferred to IVF and CE procedures, with the purpose of improving the production of porcine embryos in vitro. The third experiment revealed the amount of oxygen within the reproductive organs of sow (7%), being higher in gilts treated with hormones (10%). Two profiles for oxygen measurements were observed: a flat profile, where the oxygen variations were minimal with respect to the average, and a wavy profile, which showed small variations (± 2) with respect to the average. The wavy profile was associated with the uterus. The use of hypoxia conditions (7% oxygen) during IVF followed by EC improved porcine IVEP outcome and the quality of the porcine blastocysts obtained. In the fourth experiment was demonstrated the existence of a temperature gradient between the oviduct (37.0 ºC) and uterus (38.7 ºC) for the first time. Transferring this gradient during IVF and CE improved the production of in vitro embryos in the porcine species through the reduction of the polyspermy rates. In addition, the use of a high temperature (39.5 ºC) during IVF exerted the opposite effect to the use of a low temperature (37.0 ºC), since its use increased the polyspermy rates, and a greater fragmentation of the embryos obtained at high temperature was observed. On the other hand, obtaining the transition temperature for capacitated boar sperm (37.0 ºC), as well as the incubation of these spermatozoa at different temperatures (37.0 ºC, 38.5 ºC and 39.5 ºC), indicated an important role of temperature in the remodelling of the lipids contained in the sperm membrane and its implication in IVF.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Efecto antioxidante del glutatión aplicado en el medio de descongelación seminal de tres especies de interés pecuario
    (2016-01-25) Gumbao Baño, David; Gadea Mateos, Joaquín; Departamento de Fisiología
    El uso de muestras seminales criopreservadas es muy habitual en la reproducción asistida humana y de animales con interés en ganadería, así como en la conservación de razas y especies en peligro de extinción. Sin embargo, la congelación y descongelación de muestras seminales implica alteraciones en la membrana y en el ADN del espermatozoide, procesos de apoptosis y modificaciones asociadas al estrés oxidativo (Polge y Jakobsen, 1959; Pursel y Johnson, 1975; Holt, 2000; Thomson et al. 2009). Los espermatozoides y las células del sistema reproductor masculino presentan sistemas de defensa frente a los radicales libres (Sies, 1993). En este contexto, el glutatión es uno de los antioxidantes más ubicuos e importantes en los sistemas biológicos (Gadea et al., 2005). Sin embargo, en ocasiones tiene lugar una producción excesiva de radicales libres, un detrimento en la capacidad total antioxidante o ambas situaciones a la vez. Esta circunstancia implica un desbalance denominado “estrés oxidativo” (Sies y Cadenas, 1985). La adición de antioxidantes a los medios de congelación y descongelación seminal es una alternativa frente al estrés oxidativo (Agarwal et al, 2013). El objetivo principal de esta Tesis fue evaluar el efecto antioxidante del GSH aplicado al medio de descongelación, sobre muestras seminales procedentes de tres especies de mamíferos con importancia en ganadería (porcina, bovina y caprina). En el primer trabajo (Experiencia 1) se evaluó el efecto de la adición de diferentes concentraciones de GSH (1 mM y 5 mM) al medio de descongelación de semen porcino. Las técnicas aplicadas incluyeron el análisis computarizado de imagen (CASA), citometría de flujo y ensayos de fecundación in vitro. En los resultados se observó una reducción en el número de espermatozoides viables capacitados, el número de espermatozoides con cambios en los grupos sulfhidrilo de sus proteínas de membrana, la producción de ERO y la condensación de la cromatina. Se obtuvo un incremento en el número de ovocitos penetrados y en la proporción de cabezas espermáticas descondensadas. Sin embargo, no se evidenció cambio alguno en los parámetros de movilidad evaluados con CASA. En el segundo trabajo (Experiencia 2), desarrollado en bovino, se realizaron ensayos similares a los de la experiencia 1 y se incluyeron nuevos análisis centrados en el estudio del ADN espermático, mediante las técnicas de TUNEL y SCSA. Además, se evaluaron los resultados de las técnicas de fecundación in vitro y desarrollo embrionario.. La adición de GSH supuso un incremento en el número de espermatozoides viables no capacitados, en el porcentaje de penetración y desarrollo embrionario in vitro. Se obtuvo un descenso en la producción de ERO y la fragmentación del ADN. No se observó mejoría en los parámetros de movilidad (CASA) y de reacción acrosómica. El último trabajo (Experiencia 3) tuvo lugar en caprino y fue diseñado con el objetivo de saber si la presencia de la forma reducida (GSH) y/o oxidadada del glutatión (GSSG) en el medio de descongelación tenía algún efecto sobre la funcionalidad espermática. Los ensayos incluyeron la valoración por CASA y citometría de flujo. La adición de GSH supuso un incremento en la movilidad y viabilidad espermática, el número de espermatozoides viables no capacitados y con membrana acrosomal intacta. Se observó una reducción en la producción de ERO y la condensación de la cromatina. A diferencia de lo ocurrido con GSH, la adición de GSSG no reveló efecto alguno sobre los parámetros seminales evaluados Estos trabajos demuestran que la adición de GSH al medio de descongelación seminal mejora los parámetros seminales y la fertilidad de las muestras. SUMMARY Sperm cryopreservation is widely used in assisted reproduction procedures in humans and in animals, such us domestic livestock and endangered species. Although being the most effective method for the maintenance of seminal samples on a long term, cryopreservation has negative effect on semen quality and fertility (Aitken et al., 2004), because of the temperature drops and osmotic changes (Polge & Jakobsen, 1959). In addition to changes in the plasma membrane and in DNA of spermatozoa. (Pursel & Johnson, 1975; Holt, 2000). The spermatozoa and other masculine reproductive cells have different defense systems against free radicals, including antioxidant enzymatic and non-enzymatic defenses (Sies, 1993). In some conditions, an excess on the production of free radicals, a diminished antioxidant capacity or both situations can lead to an imbalanced condition called “oxidative stress” (Sies & Cadenas, 1985). Supplementation of antioxidants in the freezing and thawing media is an alternative against oxidative stress (Agarwal et al, 2013) In this sense, glutathione is one of the most ubiquitous and important antioxidants in the biological systems. (Gadea et al., 2005). The main aid of this thesis was to evaluate the antioxidant effect of GSH when added to the thawing solution in seminal samples from three species with importance in livestock. In the first study (Experiment 1) it was evaluated the addition of 3 different concentrations of GSH (1 mM and 5 mM) to the thawing solution of board semen, with an incubation time of 0 and 30 minutes. The techniques used were computer assisted sperm analysis CASA, flow cytometry and in vitro assays. The results obtained support the hypothesis, the presence of GSH had a protective effect in some of the seminal parameters studied. It was observed a reduction in the number of capacitated viable spermatozoa, in the number of sperm with changes in sulfhydryl group content in membrane proteins, in the ERO production as well as the chromatin condensation. An increase on the number of penetrated oocytes and decondensed sperm heads was also noted. Nevertheless, there was no evidence of any change in the motility scores recorded by CASA. The second study (Experiment 2), conducted on bovine, incudes apart from the studies developed on experiment 1 new analysis on sperm DNA, by TUNEL and SCSA techniques. Furthermore, it was evaluated the results of the in vitro techniques and the embryo development in presence of GSH in the thawing solution. The collected data from Experiment 2 showed concordance with the results from Experiment 1. With the addition GSH in the thawing solution, it was observed an increase in non-capacitated viable spermatozoa, in the percentage of penetration and in vitro development. ERO production and DNA fragmentation values were reduced. No changes were observed on sperm motility (CASA) o presence of spontaneous acrosome reaction. The third study (Experiment 3) on caprine, was designed with the propose of knowing if the presence of GSH 1 mM and 5 mM or GSSG 2.5 mM in the thawing media has any effect on sperm motility and sperm functionality. This assay included CASA evaluation and flow cytometry. In this case, the samples were incubated 30 and 60 minutes. The collected results demonstrated and increase on motility and sperm viability, in the number of non- capacitated viable spermatozoa and spermatozoa with acrosome membrane untouched. A reduction on the ERO production and on the condensation of chromatin was also observed. Opposite to GSH, the addition of GSSG did not show any effect on the evaluated seminal parameters independent to the exposure time. These studies demonstrate that the addition of GSH to the thawing media improves seminal parameters and fertility on the samples studied.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Estudio de las proteínas haptoblobina y lactadherina en el oviducto porcino y su participación en los eventos reproductivos
    (Universidad de Murcia, 2018-07-27) Guillén Martínez, Ascensión; Avilés Sánchez, Manuel; Izquierdo Rico, María José; Moros Nicolás, Carla; Escuela Internacional de Doctorado
    Diversas investigaciones han documentado la importancia de las secreciones del oviducto para el desarrollo óptimo del complejo proceso de la fecundación, el cual tiene lugar en esta región del aparato reproductor. En el fluido oviductal se han descrito diferentes proteínas y moléculas que participan en procesos esenciales relacionados con la correcta fisiología de gametos y embriones. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar la presencia en el oviducto porcino de dos proteínas concretas y su participación en diferentes eventos reproductivos. Una es la proteína Haptoglobina (Hp), la cual se expresa en diferentes tejidos con diversas funciones, algunas relacionadas con la fecundación de mamíferos. La otra proteína es lactadherina y entre sus distintas localizaciones y funciones está su secreción epididimal y su participación en la unión óvulo/espermatozoide. Respecto a la proteína Hp, el análisis de su expresión en diferentes fases del ciclo estral a través de la Reacción en Cadena de la Polimerasa mediante Transcripción Reversa (RT-PCR) en tiempo real, mostró una expresión continua durante el ciclo, con un aumento en la fase luteal tardía respecto a la fase folicular tardía. Esto sugiere una transcripción de Hp dependiente de progesterona. Mediante un análisis proteómico detectamos 17 péptidos diferentes en el fluido oviductal porcino (FOP) en estas dos fases y el Western-blot mostró un peso molecular de la proteína de 45kDa aproximadamente. Los ensayos inmunohistoquímicos para la detección de Hp mostraron una tinción intensa en la región apical de las células del epitelio oviductal, sugiriendo su secreción a este nivel. En los análisis mediante fecundación in vitro (FIV) con esta proteína se observó una disminución significativa en el porcentaje de penetración, el número de espermatozoides unidos a la zona pelúcida (ZP) y el número de pronúcleos, sugiriendo una posible interacción con los gametos. Respecto a la proteína lactadherina, está descrita su secreción en diversos tejidos mediante exosomas, incluido el epidídimo porcino, donde la proteína se adhiere al espermatozoide y participa en la unión a la ZP del óvulo. Se conocía su expresión en el útero, aunque no en el oviducto porcino. En este estudio detectamos el ARNm para la proteína lactadherina en dos regiones del oviducto (ampolla e istmo). Se realizó un análisis comparativo mediante RT-PCR en tiempo real de los niveles de expresión de lactadherina en estas dos regiones y en diferentes fases del ciclo (folicular temprana, folicular tardía, luteal temprana y luteal tardía). Se confirmó la expresión en ambas regiones oviductales y a lo largo del ciclo, aunque no hubo diferencias entre ellas. El estudio proteómico del FOP en estas fases detectó un péptido solo en fase folicular temprana, aunque el Western-blot mostró una doble banda de 40 y 47 kDa en todas las fases. Al recortar y analizar estas dos bandas en un gel con FOP en fase folicular temprana, el análisis proteómico detectó un segundo péptido en la banda de 47 kDa. Este hecho parece indicar una presencia minoritaria de la proteína en el oviducto. Para conocer el efecto de la proteína lactadherina en el sistema de FIV porcino, se incubaron por separado ovocitos y espermatozoides con la proteína de forma previa a la FIV. Se observó una disminución significativa en el porcentaje de penetración, en el número medio de espermatozoides por ovocito, en la unión de espermatozoides a la ZP y el correspondiente aumento de la monospermia. Nuestro estudio confirma la presencia de las proteínas Hp y lactadherina en el FOP, pero es necesario seguir investigando para determinar la viabilidad de usarlas en el medio de FIV como mejora del rendimiento del sistema porcino.Several investigations have documented the importance of oviduct secretions for the optimal development of the complex process of fertilization, which takes place in this region of the reproductive system. In the oviductal fluid, several proteins and molecules have been described as participants in the essential processes related to the correct physiological development of gametes and embryos. The aim of this doctoral thesis is to study the presence of two specific proteins in the porcine oviduct and their participation in different reproductive events. One is the protein Haptoglobin (Hp), which has different functions depending on the tissue in which it is expressed, some related to the fertilization of mammals. The other protein is lactadherin, among whose different locations and functions are epididymal secretion and participation in the ovule/sperm union. As regards Haptoglobin, analysis of its expression in different phases of the oestrous cycle by real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) appointed to its continuous expression during the cycle, with an increase in the late luteal phase with respect to levels in the late follicular phase. This suggests a transcription of progesterone-dependent Hp. Through proteomic analysis 17 different peptides were detected in the porcine oviductal fluid (POF) in these two phases and Western-blot showed the molecular weight of the protein to be approximately 45 kDa. Immunohistochemical assays for the detection of Hp showed an intense staining in the apical region of oviductal epithelial cells, ehich suggests that it is secreted at this level. Analysis of this protein by means of in vitro fertilization (IVF) assays showed a significant decrease in the percentage of penetration, the number of sperm attached to the zona pellucida (ZP) and the number of pronuclei, suggesting interaction with the gametes. As regards lactadherin, its secretion by exosomes has been observed in various tissues, including the porcine epididymis, where the protein adheres to the sperm and participates in the binding to the egg ZP. Its expression in the uterus was known, but not in the porcine oviduct. In this study the mRNA for the lactadherin protein was detected in two regions of the oviduct (ampulla and isthmus). A comparative analysis by RT-PCR of the levels of lactadherin expression in these two regions and in different phases of the cycle (early and late follicular, early and late luteal) confirmed its expression in both oviductal regions and throughout the cycle, with no differences between regions and phases. Proteomic analysis of the POF detected one peptide only in the early follicular phase, although the Western-blot showed a double band of 40 and 47 kDa in all phases. By trimming and analyzing these two bands in a gel in the early follicular phase of POF, the proteomic analysis detected a second peptide in the 47 kDa band, which suggests a minor presence of the protein in the oviduct. To know the effect of the lactadherin protein in the porcine IVF system, oocytes and sperm were separately incubated with the protein prior to IVF. There was a significant decrease in the percentage of penetration, in the average number of spermatozoa per oocyte, in the union of spermatozoa to the ZP and the corresponding increase in monospermy. Our study confirms the presence of Hp and lactadherin proteins in FOP, but further research is necessary to determine the feasibility of using them in the IVF environment to improve the performance of the porcine system.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Histología, acitivad proliferativa y apoptótica durante la regresión testicular producida por fotoperiodo corto en el epitelio seminífero del hámster sirio (mesocricetus auratus)
    (2015-10-05) Seco Rovira, Vicente; Ferrer Cazorla, Concepción; Pastor García, Luis Miguel; Facultad de Medicina
    El hámster sirio (Mesocricetus auratus) es un roedor de reproducción estacional en días largos que sufre una fuerte atrofia testicular cuando es sometido a un fotoperiodo corto. La presente tesis doctoral tiene como objetivos, en primer lugar, estudiar las variaciones histomorfométricas que tienen lugar en el testículo durante la regresión testicular debida a fotoperiodo corto así como determinar la importancia que tienen los fenómenos de proliferación y apoptosis en el proceso de atrofia del epitelio seminífero durante este periodo; en segundo lugar, dilucidar si la histoquímica de lectinas “in situ” permite identificar células germinales y/o somáticas en apoptosis durante esta regresión; finalmente, determinar si existe muerte celular de células de Sertoli durante esta regresión y si se produce por apoptosis. Para ello, se utilizaron 50 hámsteres sirios macho jóvenes sometidos a un fotoperiodo de 14:10h luz-oscuridad. Cinco machos se utilizaron como grupo de control mantenidos con el fotoperiodo de 14:10 h de luz-oscuridad. Los otros animales fueron sometidos a un fotoperiodo corto de 8:16h de luz-oscuridad. A las 4, 6, 8, 10 y 12 semanas se sacrificaron nueve animales tratados más un control, se extrajeron sus testículos y se procesaron para su estudio tanto con microscopía de luz (H&E, histoquímica de lectinas y TUNEL e inmunohistoquímica de PCNA y vimentina) como con microscopía electrónica de transmisión (MET). Mediante microscopía de luz se realizaron diversos estudios semicuantitativos. Con ellos y los del tiempo de sacrificio se establecieron tres grupos de regresión: regresión media (MR), regresión fuerte (SR) y regresión total (TR). Se calcularon también los índices de proliferación y apoptosis de las diferentes células germinales y somáticas del epitelio seminífero. Además, se realizaron estudios cuantitativos utilizando un software de análisis de imagen. Mediante la MET se estudiaron los cambios en las células germinales y de Sertoli durante la apoptosis. Durante la regresión testicular debida a fotoperiodo corto se produjo, a nivel celular en el epitelio seminífero, un descenso inicial de la proliferación en espermatogonias y un aumento de la apoptosis de células germinales. Al final de la regresión, se recuperó la actividad proliferativa de espermatogonias aunque la actividad apoptótica continuó afectando principalmente a los espermatocitos. Histomorfométricamente se produjo tanto un descenso del diámetro y volumen tubular como, un acortamiento del túbulo seminífero con un descenso del volumen intersticial. Varias lectinas mostraron afinidad por residuos de glucoconjugados de células germinales en apoptosis: Gal β1,3-GalNAcα1, α-D-manosa, N-acetilgalactosamina y L-fucosa. Además, la lectina PNA mostró afinidad por células de Sertoli que se encontraban en apoptosis. La H&E y las secciones semifinas identificaron células de Sertoli con una morfología alterada siendo algunas TUNEL+ en los grupos MR y SR. Mediante MET se identificaron cambios característicos de la apoptosis en estas células. Por otra parte, durante la regresión testicular, se observaron, con microscopía de luz, espermátidas elongadas fagocitadas por células de Sertoli mayoritariamente en los grupos MR y SR. En conclusión: a) la regresión testicular en el hámster sirio conlleva, tanto un descenso del diámetro y volumen del túbulo seminífero como el acortamiento del túbulo seminífero y un descenso del volumen intersticial. Además, hay un descenso inicial en la proliferación y un incremento en la apoptosis de las células germinales. Al final de la regresión, las actividades proliferativa y apoptótica de las espermatogónias recuperan los valores anteriores a la regresión; b) el uso de la histoquímica de lectinas podría ser una herramienta muy útil para estudiar la apoptosis en el epitelio seminífero debido a la especificidad mostrada; c) hay evidencias morfológicas de la pérdida de células de Sertoli por apoptosis. También algunas espermátidas elongadas son fagocitadas y eliminadas por estas células de Sertoli. Abstract The Syrian hamster (Mesocricetus auratus) is a long-day seasonal breeding rodent which suffers strong testicular atrophy when subjected to a short photoperiod. The present thesis has as objectives: (i) to study the histomorphometrical changes that take place in the Syrian hamster testes during testicular regression due to a short photoperiod and to determine the importance of the phenomena of proliferation and apoptosis in the process of seminiferous epithelium atrophy during this period; (ii) to determine whether “in situ" lectin histochemistry allows the identification of germ and/or somatic cells in apoptosis during this regression; and iii) to determine whether Sertoli cell death occurs during regression and whether it is produced by apoptosis. For this purpose, 50 young Syrian hamsters subjected to a 14:10 h L:D photoperiod were used. Five males were maintained with this 14:10 h L:D photoperiod and used as Control. The other forty five animals were subjected to a short photoperiod of 8:16 h L:D. At 4, 6, 8, 10 and 12 week, nine treated animals plus one control were sacrificed, and their testes were extracted and processed for study both by light microscopy (H&E, lectin and TUNEL histochemistry techniques and PCNA and vimentin immunohistochemistry) and transmission electron microscopy (TEM). Using light microscopy, several semiquantitative studies were carried out. Based on these data and the week when the animals were sacrificed, three regression groups were established: mild regression (MR), strong regression (SR) and total regression (TR). The proliferation and apoptosis indexes of the different germinal and somatic cells of the seminiferous epithelium were calculated. Furthermore, quantitative studies were made using image analysis software. Using TEM the changes suffered by the different germ and Sertoli cells during apoptosis were studied. During testicular regression due to short photoperiod, an initial decrease in spermatogonia proliferation and an increase in germ cell apoptosis were observed at cellular level in the seminiferous epithelium. At the end of regression, the spermatogonial proliferative activity was recovered although the apoptotic activity continued, mainly affecting spermatocytes. Histomorphometrically, a decrease in tubular diameter and volume, shortening of the seminiferous tubules and a decrease in the interstitial volume were observed. Several lectins showed affinity for glycoconjugate residues (Gal β1,3-GalNAcα1, α-D-mannose, N-acetylgalactosamine and L-fucose) of germ cells in apoptosis. Furthermore, the PNA lectin showed affinity for Sertoli cells undergoing apoptosis. H&E and semi-thin sections identified Sertoli cells with a degenerated morphology that were TUNEL+ in the MR and SR groups. Apoptotic changes in the nucleus and cytoplasm of these cells were identified by TEM. Moreover, during testicular regression and using light microscopy, some elongated spermatids were seen to have been phagocytosed by Sertoli cells, mainly in the MR and SR groups. In conclusion: a) testicular regression in Syrian hamster involves both a decrease in seminiferous tubular diameter and volume, and shortening of the seminiferous tubule accompanied by a decrease in interstitial volume. Furthermore, there is an initial decrease in proliferation and an increase in apoptosis involving all germ cells. At the end of regression, the proliferative and apoptotic activities of the spermatogonia recover the values observed prior to regression; b) lectin histochemistry can be considered a very useful tool for studying apoptosis in the seminiferous epithelium because of the specificity it shows; c) there is morphological evidence that some Sertoli cells are lost through apoptosis. Also, some elongated spermatids are phagocytized and eliminated by Sertoli cells.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Proteómica del plasma seminal y de los espermatozoides de porcino
    (Universidad de Murcia, 2018-11-02) Pérez Patiño, Cristina; Roca Aleu, Jorge; Parrilla Riera, Inmaculada; Escuela Internacional de Doctorado
    Conscientes de la importancia de las proteínas para la funcionalidad espermática, el objetivo de la Tesis Doctoral fue identificar proteínas espermáticas y del plasma seminal (PS) de porcino asociadas con la funcionalidad espermática, específicamente con la fertilidad y la congelabilidad, todo ello a partir de una detallada descripción y actualización de los proteomas del plasma seminal (PS) y de los espermatozoides de porcino. Se desarrollaron 5 experimentos, 3 basados en el proteoma del PS (estudios 1, 2 y 3) y otros 2 en el proteoma de los espermatozoides (estudios 4 y 5). Para dichos experimentos, se utilizaron muestras de PS y/o espermatozoides de 313 eyaculados, recogidos de manera fraccionada (10 primeros mL de la fracción rica [FR], resto de la FR y la fracción post-FR) o como eyaculado completo, procedentes de 89 verracos utilizados en programas de inseminación artificial. También se utilizaron muestras de espermatozoides procedentes de la cola del epidídimo (estudio 4) y de espermatozoides criopreservados mediante un procedimiento estándar para pajuelas de 0,5 mL (estudio 5). Para el análisis proteómico, las proteínas de PS y de los espermatozoides fueron digeridas con tripsina y los péptidos resultantes fueron sometidos a diferentes sistemas de fraccionamiento antes de ser analizados mediante espectrometría de masas (MS). El proteoma se analizó por cromatografía líquida acoplada a MS en tándem y las proteínas resultantes fueron cuantificadas mediante SWATH (Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra; estudios 1, 2, 3 y 5) o iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation; estudio 4). La fertilidad de los verracos (estudio 3), se valoró, tras inseminar 25.069 cerdas, en términos de tasa de parto (porcentaje de cerdas que paren con respecto al número de cerdas inseminadas) y tamaño de la camada (número de lechones nacidos por parto). La calidad y funcionalidad espermática (estudio 5) se evaluó como motilidad objetiva (total y progresiva), viabilidad, fragmentación del ADN nuclear, peroxidación lipídica y apoptosis celular temprana. Se identificaron un total de 872 y 1.723 proteínas en el PS (estudios 1 y 2) y en los espermatozoides (estudio 4), respectivamente, siendo 679 y 1.602 de ellas cuantificadas. Se identificaron, tanto en el proteoma del PS (estudio 1) como en el de los espermatozoides (estudio 4), proteínas que estaban cuantitativamente diferentemente expresadas entre las fracciones del eyaculado, siendo muchas de ellas relevantes para la funcionalidad espermática. Algunas de las proteínas diferencialmente expresadas eran comunes para el PS y los espermatozoides, evidenciando que el proteoma de los espermatozoides de porcino se remodela durante la eyaculación debido a su interacción con el PS. En el estudio 3, se identificaron un total de 11 y 4 proteínas del PS diferencialmente expresadas entre verracos con diferencias en tasa de parto y tamaño de camada, respectivamente, proteínas con potencial para ser utilizadas como biomarcadores de fertilidad. Finalmente, en el estudio 5, se identificaron 26 proteínas en el proteoma de los espermatozoides criopreservados que diferían cuantitativamente entre muestras espermáticas con claras diferencias en la congelabilidad. En conclusión, la presente Tesis Doctoral aporta la descripción más extensa y actualizada de los proteomas del PS y de los espermatozoides de porcino, demostrando que el proteoma de los espermatozoides se remodela durante la eyaculación e identificando proteínas en el proteoma de los espermatozoides y del PS que estarían directamente implicadas en la congelabilidad espermática y en la fertilidad, respectivamente.Proteins are essential for sperm function, including their fertilizing capacity. Consequently, the aim of the PhD Thesis was to describe and update the proteomes of porcine seminal plasma (SP) and spermatozoa, respectively; identifying proteins related to sperm freezability and fertility after artificial insemination (AI). Five experimental studies were performed, three focused on the SP proteome (studies 1, 2 and 3) and the other two on the sperm proteome (studies 4 and 5). Sperm and SP samples were derived from 313 ejaculates (89 boars), collected either in fractions (the 10 first mL of the sperm rich fraction [SRF], the remainder of the SRF and the post-SRF) or as an entire ejaculate. In addition, epididymal (study 4) and cryopreserved spermatozoa (study 5) were also used. For proteomic analysis, the SP and sperm proteins were digested by trypsin, the resulting peptide mixtures subjected to different fractionation approaches before mass spectrometry (MS) analysis. Liquid chromatography-tandem MS was used for proteome analysis. Quantitative differences in protein composition were analyzed either by SWATH (Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra; studies 1, 2, 3 and 5) or by iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation, study 4). The fertility of the boars (study 3), as farrowing rates (FR, number of farrowing sows respect to the number of inseminated sows) and litter size (LS, total number of piglets born per litter) was recorded from 25,069 sows after AI. Sperm function (study 5) was assessed in terms of total and progressive motility, viability, nuclear DNA fragmentation, membrane lipid peroxidation and early signs of apoptosis. A total of 872 proteins in SP (studies 1 and 2) and of 1,723 in spermatozoa (study 4) were identified; of which 679 respectively 1,602 were quantified. Several proteins, many of them relevant for sperm function, were identified as quantitatively differently expressed among ejaculate fractions in both SP (study 1) and sperm (study 4) proteomes. Some of these were common for SP and spermatozoa, revealing that the proteome of pig spermatozoa is remodeled during ejaculation through interaction with the surrounding SP. In study 3, a total of 11 and 4 differentially expressed proteins were identified in SP from boars with differences in farrowing rate and litter size, respectively. These proteins are revealed as potential fertility biomarkers of boar used in AI programs. Finally, study 5 identified 26 sperm proteins differentially expressed between samples showing differences in freezability. This PhD Thesis provides the most extensive and updated description of SP and pig sperm proteomes. It also evidences that the pig sperm proteome is remodeled during ejaculation and identifies proteins directly involved in sperm freezability and boar fertility in the proteome of spermatozoa and SP, respectively.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Role of the nitric oxide system in different reproductive processes
    (Universidad de Murcia, 2019-10-09) Staicu, Florentin-Daniel; Matas Parra, Carmen; Martínez Soto, Juan Carlos; Chavarro, Jorge; Escuela Internacional de Doctorado
    El óxido nítrico (NO) regula los procesos fisiológicos y patológicos en diferentes sistemas orgánicos, incluido el sistema vascular, nervioso y reproductor. Su síntesis tiene lugar a partir del precursor L-Arginina, gracias a la familia de enzimas Óxido Nítrico Sintasa (NOS). Esta familia se encuentra formada por dos enzimas constitutivas, la NOS endotelial y la neuronal (eNOS, nNOS), y una inducible (iNOS). Los principales objetivos de esta tesis fueron estudiar el efecto del NO sobre la capacitación espermática en dos especies diferentes y determinar si los niveles de NO en el líquido folicular (FF) pueden predecir los resultados clínicos de las Técnicas de Reproducción Asistida. Para ello, en primer lugar, se analizó cómo la adición de NO o la inhibición de su síntesis afectaba a la capacitación espermática y a la fecundación in vitro (FIV) en la especie porcina (Capítulo 1). Posteriormente, se estudió cómo la fosforilación de las proteínas es modulada por el NO, L-Arginina y el FF durante la capacitación en espermatozoides humanos (Capítulo 2). Finalmente, se determinaron los niveles de NO en el FF y su relacion con la calidad de los ovocitos en mujeres (Capítulo 3). En el primer capítulo se describió la localización de las tres isoformas de la NOS en espermatozoides mediante inmunocitoquimica. Tanto la eNOS como la nNOS se ubicaron en la región de la cabeza espermática, con una señal débil en la pieza principal y final de la cola. Sin embargo, la iNOS mostró una distribución más general. En relación a: motilidad, sustratos de fosfo-PKA, fosforilación en tirosina, reacción acrosomal, translocación de fosfatidilserina y concentración del calcio intracelular, se observó que eran modificados por la presencia o ausencia de NO. Para estos análisis se utilizó el donante de NO, S-Nitrosoglutatión (GSNO), y dos inhibidores de las NOS, NG-Nitro-L-Arginina Metil Éster (L-NAME) y Aminoguanidina (AG). A tiempo 0 la motilidad no se vio afectada por los tratamientos utilizados. Sin embargo, a los 30 minutos se observó que la velocidad rectilínea (VSL) y la velocidad media (VAP) disminuyen en presencia de AG. La inhibición de NOS disminuyó el grado de fosforilación de tres sustratos de la PKA (~ 75, ~ 55 y ~ 50 kDa) aunque fosforilación de tirosina no difirió entre los tratamientos. El inhibidor L-NAME hizo disminuir el porcentaje de espermatozoides reaccionados y la exteriorización de la fosfatidilserina. L-NAME y AG indujeron una disminución en la concentración intracelular de calcio. En segundo lugar, se evaluó el papel del NO sobre la interacción de gametos en presencia o ausencia de células del cumulus. Se observó que tanto la adición del L-NAME como del AG durante la FIV, producía un descenso en el porcentaje de ovocitos penetrados cuando éstos se encontraban rodeados por las células del cumulus. No obstante, al eliminar éstas células la penetración disminuyó aún más, llegando a ser nula en presencia del inhibidor L-NAME. En el Capítulo 2, se analizó el papel de la L-Arginina y del FF sobre la fosforilación en serina, treonina y tirosina en espermatozoides de hombres y si su efecto se veía modificado por la presencia de donante de NO o por los inhibidores de síntesis de NO. Se observó que cuatro bandas de proteínas de ~ 110, ~ 87, ~ 75 y ~ 62 kDa disminuían la intensidad de fosforilación en presencia de inhibidores de las NOS, tanto en presencia como en ausencia de L-Arginina o FF. Posteriormente se identificaron que proteínas eran las afectadas y se observó que 29 de ellas estaban relacionadas con diferentes procesos reproductivos: espermatogénesis, unión a la zona pelúcida, metabolismo energético, respuesta al estrés, la motilidad y estructura, y señalización y recambio de proteínas. En el estudio final (Capítulo 3), se determinó la relación entre el nivel de nitrito (NO2) y nitrato (NO3) en el FF de mujeres que participaron en un programa de donación de gametos y la calidad de sus ovocitos. Se observó que ni el número total de ovocitos recogidos ni el de ovocitos MII se asociaron con los niveles de NO2 y NO3 en el FF. Sin embargo, la proporción de ovocitos MII sí que se relacionó directamente con los niveles de NO2 e inversamente con los niveles de NO3. Los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral muestran la importancia del NO sobre los gametos y su interacción. En relación al espermatozoide porcino, se observó que la localización de las isoformas de la NOS es diferente y que la inhibición de la síntesis de NO disminuye los parámetros que participan en el proceso de capacitación y la penetración de ovocitos. En relación a los espermatozoides del hombre, se determinó que al inhibir la producción de NO se produce una disminución de la fosforilación de proteínas relacionadas con la función reproductiva y este efecto no se revierte por la presencia de L-Arginina o FF. Además, la síntesis de NO en el FF de mujeres donantes de ovocitos sometidas a tratamiento de superovulación, se relaciona con el porcentaje de ovocitos maduros, pero no con la cantidad total de ovocitos recuperados tras el tratamiento. Nitric oxide (NO) regulates both physiological and pathological processes in different organic systems, including the vascular, nervous, and reproductive system. Its synthesis takes place from a precursor, namely L-Arginine, thanks to the Nitric Oxide Synthase (NOS) family of enzymes. The latter includes two constitutive enzymes, the endothelial and the neuronal NOS (eNOS, nNOS), and one inducible isoform (iNOS). The main objectives of this thesis were to study the effect of NO on sperm capacitation in two different species and to determine whether or not the NO levels in the follicular fluid (FF) can predict the clinical outcomes from Assisted Reproduction Techniques. To do this, the first step was to analyze how the addition of NO or the inhibition of its synthesis affected sperm capacitation and in vitro fertilization (IVF) in the porcine species (Chapter 1). Subsequently, the modulation of protein phosphorylation by NO, L-Arginine and FF was investigated during human sperm capacitation (Chapter 2). Finally, the levels of NO in the FF were determined and their correlation with the quality of the oocytes in women was studied (Chapter 3). In the first chapter, the localization of the three NOS isoforms was described in spermatozoa by immunocytochemistry. Both eNOS and nNOS were located in the sperm head region, with a faint signal in the principal and end piece of the tail. On the other hand, iNOS showed a more general distribution. The following parameters: motility, phospho-PKA substrates, tyrosine phosphorylation, acrosome reaction, phosphatidylserine translocation and intracellular calcium concentration, were affected depending on the presence or absence of NO. For these assays, a NO donor, S-Nitrosoglutathione (GSNO), and two NOS inhibitors, NG-Nitro-L-Arginine Methyl Ester Hydrochloride (L-NAME) and Aminoguanidine Hemisulfate salt (AG), were used. At time 0, the used treatments did not affect motility patterns, however, after 30 minutes of incubation the straight-line (VSL) and average path velocity (VAP) decreased in the presence of AG. The inhibition of NOS lowered the phosphorylation degree of three PKA substrates (~ 75, ~ 55 and ~ 50 kDa), but tyrosine phosphorylation levels did not differ between the treatments. The inhibitor L-NAME decreased the percentage of acrosome-reacted sperm and phosphatidylserine translocation, whereas both L-NAME and AG reduced the sperm intracellular calcium concentration. Secondly, the role of NO on the interaction of gametes was evaluated in the presence or absence of cumulus cells. The addition of both L-NAME and AG during IVF induced a decrease in the percentage of penetrated oocytes, when the latter were surrounded by the cumulus cells. Nonetheless, when the cumulus cells were removed, the percentage of penetration was further diminished, becoming null in presence of the inhibitor L-NAME. In Chapter 2, the role of L-Arginine and FF was analyzed on the phosphorylation of serine, threonine and tyrosine residues in human spermatozoa and whether their effect was modified by the presence of a donor or inhibitors of NO synthesis. Four protein bands of ~ 110, ~ 87, ~ 75 and ~ 62 kDa showed a decrease in their phosphorylation degree when using NOS inhibitors, both in the presence or absence of L-Arginine and FF. Later, the affected proteins were identified, and it was observed that 29 of them were related to different reproductive processes: spermatogenesis, binding to the zona pellucida, energy and metabolism, stress response, motility and structural organization, signaling and protein turnover. In the final study (Chapter 3), the relationship between the FF levels of nitrite (NO2) and nitrate (NO3) in women participating in a gamete donation program and the quality of their oocytes was determined. Neither total nor MII oocyte yields were associated with the FF concentrations of NO2 and NO3. However, the proportion of MII oocytes was directly related to NO2 levels and inversely to NO3 levels. The results obtained in this doctoral thesis show the importance of NO on gametes and their interaction. In relation to porcine spermatozoa, it was observed that the localization of the NOS isoforms is different and that the inhibition of NO synthesis decreases the parameters involved in the capacitation process and the penetration of oocytes. As far as the human spermatozoa are concerned, the inhibition of NO synthesis leads to a decrease in the phosphorylation of proteins related to reproductive functions and, this effect is not reverted by the presence of L-Arginine or FF. In addition, the synthesis of NO in the FF of oocyte donors undergoing superovulation treatment is associated to the proportion of mature oocytes, but not to the total number of oocytes recovered after the treatment