Browsing by Subject "Reproducción animal"

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    Control asistido por magnetismo de ovocitos y embriones a través de nanopartículas unidas a la zona pelúcida
    (Universidad de Murcia, 2024-11-08) Garrappa, Gabriela; García Vázquez, Francisco A.; Jíménez Movilla, María; Escuela Internacional de Doctorado
    El uso de nanopartículas (NP) para aplicaciones biomédicas ha crecido enormemente en las últimas décadas. Entre estos, los desarrollos nanotecnológicos destinados a su aplicación en tecnologías de reproducción asistidas (TRA) se destacaron. A pesar de los importantes avances en este campo, aún no ha sido superada una de las mayores limitaciones de estas tecnologías: la necesidad de manipular los ovocitos y embriones de manera extremadamente delicada y precisa. El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue el desarrollo de un novedoso sistema para la manipulación de ovocitos y embriones mediante el uso de NP con capacidad de ser atraídas magnéticamente, utilizando como enlace con la zona pelúcida (ZP) a la proteína oviductina (OVGP1) y el análisis de la seguridad de su aplicación en TRA. En primer lugar, se evaluó la unión de NP superparamagnéticas con la OVGP1 (NPOv) y se analizó la estabilidad de esta unión. La exitosa conjugación fue confirmada, así como su estabilidad por hasta 31 días después de la conjugación. A continuación, se confirmó la capacidad del complejo NPOv de adherirse específicamente a la parte externa de la ZP de ovocitos madurados in vitro y a embriones producidos in vitro en diversos estadios de desarrollo (4 células, mórulas y blastocistos). En un siguiente estudio se evaluó la viabilidad de gametos y embriones en presencia de NPOv. Para ello, se trabajó primero con el biomodelo porcino en condiciones in vitro donde tras la exposición de gametos a NPOv evaluamos su actividad metabólica mediante un analizador de flujo extracelular, los efectos sobre espermatozoides mediante análisis de parámetros de calidad espermática, los efectos sobre la ZP de mediante el estudio del tiempo de digestión por proteasas, los efectos sobre la capacidad fecundante y sobre el desarrollo embrionario mediante un protocolo de Fecundación in vitro (FIV) y Cultivo embrionario in vitro (CE). Los resultados demostraron la ausencia de efectos de las NPOv sobre vialidad de gametos y desarrollo embrionario. Demostrada la ausencia de efectos sobre gametos y embriones porcinos in vitro, continuamos con el análisis de seguridad biológica sobre el biomodelo conejo. Se analizó el efecto de las NPOv unidas a embriones sobre el desarrollo embrionario in vitro, se estudió el efecto de la presencia de embriones con NPOv in vivo en oviducto y útero de coneja tras su transferencia. Adicionalmente se analizó la respuesta del tejido oviductal y uterino a la presencia de embriones con NPOv. Los resultados demostraron que no hubo efectos de la presencia de embriones con NPOv en el desarrollo embrionario tanto in vitro como in vivo, ni sobre la tasa de implantación y la tasa de nacidos vivos, ni su peso al nacimiento. Además, no se observaron efectos de la presencia de embriones con NPOv sobre el tejido oviductal ni uterino. Confirmada la inocuidad de las NPOv, se continuó con la validación de su aplicación para la manipulación de ovocitos y embriones. Primero, evaluamos la capacidad de ovocitos y embriones con NPOv de ser atraídos por un campo magnético. Los resultados demostraron que una tanto ovocitos como embriones fueron atraídos en un porcentaje cercano al 90%. Además, se observó que esta tecnología produce la atracción diferencial de ovocitos maduros por sobre los inmaduros. Seguidamente, analizamos el efecto del campo magnético sobre la viabilidad de ovocitos con NPOv tras someterlos a un protocolo de FIV y CE. Se analizó la viabilidad de embriones obtenidos mediante la secuenciación de su ARN. Adicionalmente, el estado oxidativo fue evaluado en ovocitos- NPOv atraídos y en embriones a mediante el estudio de genes relacionados con estrés oxidativo. Los resultados demostraron que no hubo efectos de las NPOv ni del campo magnético sobre los paramaros analizados (tasa de desarrollo embrionario, transcriptoma de los embriones obtenidos, genes relacionados a estrés oxidativo y la intensidad de ROS en ovocitos). En resumen, esta tesis doctoral ha desarrollado y validado una herramienta robusta e inocua, basada en la funcionalización de NP magnéticas con una proteína recombinante que actúa de nexo especifico con la ZP de ovocitos y embriones. Este trabajo ha demostrado que el sistema puede ser utilizado de manera segura para la manipulación ovocitos y embriones mediante campos magnéticos, permitiendo su direccionamiento y/o posicionamiento. Esta novedosa herramienta tiene un gran potencial en las TRA, para su aplicación en diferentes especies
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    Interaction of the ejaculate and extracellular vesicles of the porcine female reproductive tract: biotechnological implications on fertility, embryo development, and offspring
    (Universidad de Murcia, 2026-01-30) Toledo Guardiola, Santa María; Matas Parra, Carmen; Soriano Úbeda, Cristina de las Mercedes; Sin departamento asociado; Escuela Internacional de Doctorado
    Esta tesis doctoral se presenta como un compendio de cinco publicaciones científicas que contribuyen a una línea de investigación centrada en el análisis del impacto de las vesículas extracelulares (EVs) derivadas de los fluidos reproductivos en los gametos, la fecundación, la formación del embrión y la generación de una descendencia viable. El objetivo de esta tesis fue el de, través de un enfoque multidimensional, analizar este impacto evaluando el efecto paterno en parámetros hematológicos de la descendencia, la angiogénesis uterina, la caracterización de las EVs en los fluidos oviductal y uterino y la regulación de éstas en la funcionalidad espermática, la fecundación in vitro y el consiguiente desarrollo embrionario. El Capítulo 1 estableció una base de estudio a través de una revisión bibliográfica que remarcó y justificó los experimentos llevados a cabo durante esta tesis doctoral. El resto de los capítulos se llevaron a cabo siguiendo tres diseños experimentales diferentes: En primer lugar, se inseminaron cerdas con dosis homospérmicas de verracos fértiles y se analizaron parámetros hematológicos de la descendencia. Por otro lado, se realizó inseminación artificial (AI) con distintas fracciones del eyaculado de verraco en cerdas prolíficas, se recolectaron los tractos genitales de éstas y se analizaron cuerpos lúteos, embriones y tejido uterino a los seis días post-inseminación. Además, se examinó el contenido proteico de las EVs del fluido oviductal (oEVs) y uterino (uEVs) obtenidos en estos tractos genitales y se aisló y analizó por proteómica su contenido. Por último, se aislaron y caracterizaron oEVs porcinas (poEVs) de cerdas de matadero en diferentes fases del ciclo estral y se evaluó su efecto sobre el espermatozoide mediante ensayos de motilidad, viabilidad, estado acrosómico, fosforilación proteica y fecundación in vitro. El Capítulo 2 identificó una correlación estadística entre las características específicas del semen de los verracos, particularmente aquellas asociadas con el daño al ADN espermático y los parámetros de salud en lechones. También se observó que aquellos verracos que mostraban mejor calidad seminal generaron camadas con mayor resistencia a la hipoglucemia y mejor crecimiento postnatal. En conclusión, la calidad espermática del verraco tiene un impacto profundo tanto en la fertilidad, como en la salud y viabilidad de la descendencia. El Capítulo 3 determinó que la inseminación con diferentes fracciones del eyaculado afectó significativamente al desarrollo embrionario, con un mayor porcentaje de mórulas en el grupo inseminado con la fracción rica en espermatozoides (SRF). Concluyendo que, las fracciones del eyaculado modulan la respuesta uterina y el desarrollo embrionario. El Capítulo 4 encontró que el contenido proteico de las uEVs y oEVs dependía de la fracción del eyaculado utilizada y se identificaron proteínas clave relacionadas con la fertilidad como EZR, HSPAA901 y PDS. En resumen, se observó que las EVs secretadas por el tracto reproductor femenino tenían un rol activo en la modulación del proteoma uterino y la funcionalidad espermática. Finalmente, el Capítulo 5 notificó que las poEVs de la fase folicular tardía mostraron una mayor afinidad por los espermatozoides, afectando a su motilidad, capacitación y a la tasa de penetración espermática, disminuyendo la polispermia en cerdo. Esto, nos llevó a la conclusión de que las poEVs secretadas durante las distintas fases del ciclo estral interactúan con los espermatozoides, alterando su comportamiento y su capacidad fecundante. Estos hallazgos ahondan en el conocimiento de los mecanismos de comunicación intercelular que se dan durante el proceso reproductivo, tanto en las etapas de pre- como post- fecundación. Además, este conocimiento podría servir de base para el desarrollo de la producción animal, como el perfeccionamiento de la selección de reproductores y de estrategias de AI, así como para el avance de sectores como la industria biomédica
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    Molecular determinants involved in conceptus elongation in ungulates
    (Universidad de Murcia, 2024-11-08) Pérez Gómez, Alba; Bermejo Álvarez, Pablo; Ramos Ibeas, Priscila; Jíménez Movilla, María; Escuela Internacional de Doctorado
    El desarrollo embrionario de los ungulados –grupo que incluye a las principales especies de mamíferos de interés ganadero– se caracteriza por un periodo preimplantacional largo que puede dividirse en dos fases. La primera abarca desde la fecundación hasta la eclosión del blastocisto y es común a todos mamíferos, siendo la única fase presente en ratones y humanos, en los que el embrión implanta justo después de la eclosión. En contraste, el desarrollo preimplantacional de los ungulados se extiende en una segunda fase denominada elongación del concepto. La elongación del concepto se caracteriza por la proliferación masiva de las membranas extraembrionarias y por la formación de un disco embrionario plano en el que tiene lugar la gastrulación antes de la implantación. La elongación del concepto es el periodo más susceptible a pérdidas embrionarias y, por ello, el estudio de los procesos que tienen lugar durante esta fase es crucial para reducir las pérdidas embrionarias en animales de granja y aporta información relevante para entender el desarrollo embrionario humano. Esta tesis, dividida en cinco capítulos, analiza diferentes aspectos moleculares del desarrollo preimplantacional bovino, centrándose en la fase de la elongación del concepto. El Capítulo 1, describe importantes diferencias en el desarrollo embrionario preimplantacional entre diferentes especies de mamíferos, detallando distintos marcadores específicos de linaje que pueden utilizarse para evaluar la calidad embrionaria en ungulados. En el resto de los capítulos se emplea la tecnología de edición génica CRISPR/Cas9 para realizar estudios de pérdida de función que sirven para conocer la función de genes específicos durante el desarrollo preimplantacional. Los experimentos emplean aproximaciones in vitro –incluyendo un novedoso sistema de desarrollo post- eclosión– e in vivo para determinar la capacidad de desarrollo de los embriones knock- out (KO). Los capítulos 2 y 3 analizan la capacidad de desarrollo de embriones bovinos dobles portadores de haplotipos deletéreos, que son alelos que causan mortalidad embrionaria o fetal en homocigosis. El capítulo 2 estudia la capacidad de desarrollo de embriones dobles portadores del Haplotipo Holstein 3 (HH3), que consiste en una sustitución T/C que impide la formación de la proteína SMC2 funcional. SMC2 es un componente esencial de complejos proteicos que median el ensamblaje y segregación de los cromosomas durante la mitosis y meiosis. En un primer estudio se vio que los embriones dobles portadores del haplotipo no eran capaces de desarrollarse hasta día embrionario (E) 14. Para precisar cuándo se producía el arresto en el desarrollo, se generaron embriones KO para SMC2 (funcionalmente equivalentes a los dobles portadores HH3) mediante la tecnología CRISPR. Los embriones KO para SMC2 fueron capaces de alcanzar el estadio de blastocisto, pero mostraron una clara disminución de la proliferación celular y no consiguieron sobrevivir hasta Día (D) 12 in vitro, no siendo capaces de inducir el reconocimiento materno de la gestación. El Capitulo 3 evalúa la capacidad de desarrollo de embriones dobles portadores del Haplotipo Holstein 5 (HH5), que carecen de la proteína TFB1M, implicada en la traducción mitocondrial. Inicialmente, se observó que los embriones dobles portadores mostraban un defecto severo en la proliferación de las membranas extraembrionarias a E14. Para estudiar su capacidad de desarrollo en estadios previos, se generaron embriones KO para TFB1M, funcionalmente equivalentes a los dobles portadores HH5. Los embriones KO para TFB1M no mostraron ningún defecto en el desarrollo hasta D12 in vitro, indicando que el desarrollo de los embriones dobles portadores de HH5 se detiene en la transición entre concepto esférico y tubular, antes del reconocimiento de la gestación. El Capítulo 4 analiza la función durante el desarrollo embrionario del receptor de señalización lipídica PPARG. Para ello, se analizó el desarrollo de embriones bovinos KO para PPARG en D8 y D12 in vitro y se realizaron transferencias embrionarias heterólogas para evaluar su capacidad de desarrollo in vivo durante las primeras etapas de la elongación. Los embriones sin PPARG fueron capaces de desarrollarse normalmente hasta estadios elongados equivalentes a E14, mostrando que la señalización mediada por PPARG en el embrión no es necesaria para la elongación temprana del concepto bovino. Finalmente, el capítulo 5 explora un dogma de la biología del desarrollo establecido en base al modelo de ratón: el papel esencial del factor de transcripción TEAD4 en la diferenciación del trofoectodermo y la formación del blastocisto. Siguiendo un diseño experimental similar al del capítulo 4, se observó que los embriones bovinos KO para TEAD4 se desarrollaron de forma normal hasta el estadio de blastocisto in vitro y fueron capaces de alcanzar estadios tardíos de desarrollo (concepto tubular de E14) in vivo sin mostrar defectos evidentes en la proliferación del trofoectodermo. También se observó que TEAD4 tampoco era necesario para la diferenciación del trofoectodermo y formación del blastocisto en conejos, una especie que comparte el mismo clado (Glires) que los roedores. Estos resultados prueban que el papel crucial de TEAD4 en la diferenciación del trofoectodermo es exclusivo de roedores.
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    Optimization of post-cervical insemination in gilts and development of a new method of deep intra-cervical insemination based on the study of the reproductive system
    (Universidad de Murcia, 2020-12-14) Llamas López, Pedro José; García Vázquez, Francisco Alberto; Escuela Internacional de Doctorado
    La inseminación artificial (IA) ha evolucionado en las últimas décadas desde una IA cervical (CAI) hacia una inseminación más profunda, denominada IA post-cervical (PCAI). Con esta nueva técnica se ha conseguido reducir la concentración espermática en las dosis seminales, obteniendo los mismos resultados productivos que con CAI, lo que conlleva importantes ventajas económicas. Sin embargo, hasta la fecha, PCAI solo se utiliza en cerdas de más de un parto (primíparas y multíparas), pero no es así en cerdas sin ningún parto (cerdas nulíparas). Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue evaluar la validez actual del método PCAI en hembras nulíparas y posibles variantes que mejoren su eficiencia, así como el estudio de otras alternativas basadas en las características anatómicas del cuello uterino de este tipo de cerdas. En el artículo 1, se observó que la eficiencia de los dispositivos actuales de PCAI aplicados en cerdas nulíparas era muy reducida (23.1%) respecto al 95% alcanzado en cerdas multíparas. Las cerdas que no pudieron ser inseminadas en un primer intento fueron sometidas a diferentes tratamientos previos al siguiente intento de aplicación PCAI (Hidrocloruro de Vetrabutina-VC; diluyente atemperado-WE a 44.9 ± 2.1 ºC) con el fin de obtener una relajación de la musculatura presente en el cérvix y facilitar el paso del dispositivo de PCAI. Los resultados mostraron una tasa de éxito para el grupo VC del 34.2% frente al 23.8% del grupo WE. En el siguiente ensayo, se diseñaron dos nuevos dispositivos de PCAI con dimensiones más reducidas adaptadas a las cerdas nulíparas. Un primer dispositivo (GpC1) formado por un catéter multianillas de menor diámetro (16 mm) que el usado en cerdas multíparas, pero con la misma cánula interna. El segundo diseño de dispositivo (GpC2) consistió en el mismo catéter multianillas del grupo GpC1, pero con una cánula interna de menor diámetro (2.5 mm). Los resultados obtenidos mostraron un mayor éxito de aplicación para el grupo GpC2 que para el GpC1 (60.3% vs. 37.0%, p <0.05), pero en ambos casos se mejoró la técnica con respecto al dispositivo PCAI de multíparas. En el artículo 2 se estudiaron las diferencias anatómicas e histológicas entre el aparato reproductor de una cerda multípara y nulípara. Se observó que la longitud del cérvix y la sección transversal del cérvix (parte craneal del útero) en cerdas multíparas era superior que en cerdas nulíparas. En cuanto al análisis histológico del cérvix, se observó un mayor contenido de tejido conectivo y menor cantidad de fibras musculares en cerdas multíparas que en cerdas nulíparas. Además, en el estudio morfológico interno del canal cervical, que se realizó mediante inyección ex vivo de silicona en el cérvix, se observaron diferencias significativas entre cerdas nulíparas y multíparas. En el artículo 3, y en base a los datos obtenidos en los experimentos anteriores, se diseñó un nuevo dispositivo para inseminación en cerdas nulíparas, denominado Inseminación Artificial Profunda-Cervical (Dp-CAI), formado por un catéter cervical multianillas con un diámetro de 17 mm y una cánula interna de 65 cm de longitud y 3 mm de diámetro. Se observó un porcentaje de éxito del 88.9% con el nuevo dispositivo Dp-CAI. En cuanto a los resultados reproductivos, no se observaron diferencias significativas entre las dos metodologías de inseminación (CAI vs. Dp-CAI), aun utilizando dosis seminales reducidas en Dp-CAI. En conclusión, se ha mostrado que existen diferencias anatómicas e histológicas entre cerdas nulíparas y multíparas, lo que dificulta la aplicación de PCAI, por lo que el diseño de nuevos dispositivos de IA cervical profunda adaptados a las cerdas nulíparas reduce la concentración espermática y el volumen de las dosis seminales sin menoscabar en los rendimientos productivos.