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    Alteraciones morfológicas asociadas a macroparásitos digestivos en los pingüinos pigoscelides
    (2015-09-16) Martín Linares, María Ángeles; Ortiz Sánchez, Juana; Barbosa Alcón, Andrés; Seva Alcaraz, Juan; Facultad de Veterinaria
    El conocimiento sobre la presencia de parásitos y enfermedades en la fauna silvestre es crucial para entender cómo la Antártida está funcionando en términos de la salud del ecosistema y, por lo tanto, para ayudar en el proceso de toma de decisiones para la gestión de su conservación. Con esta tesis se pretende contribuir al conocimiento de la patogenia y/o lesiones asociadas a la presencia de los helmintos presentes en el tracto digestivo de las tres especies de pingüinos de la península Antártica pertenecientes al género Pygoscelis: P. antarctica, P. papua y P. adeliae. Los trabajos acerca de la descripción del tracto gastrointestinal de los pingüinos son escasos. Para poder interpretar con precisión las alteraciones que los parásitos digestivos producen en sus hospedadores es necesario conocer en profundidad la morfología del mismo, en su estado normal. Para ello realizamos la descripción morfológica del sistema digestivo del pingüino barbijo. La descripción macroscópica de los diferentes segmentos, se realizó basándonos en las observaciones de las necropsias realizadas bien de animales enteros o bien de los paquetes intestinales previamente descongelados. Con el fin de evitar los cambios en los tejidos a causa de la congelación-descongelación, para el estudio histológico del tracto digestivo del pingüino barbijo, la necropsia de un ejemplar adulto clínicamente sano se realizó in situ en la base antártica, en la campaña de 2012-2013. Para los análisis microscópicos histológicos se tomaron muestras del esófago, proventrículo, ventrículo e intestino. La mayoría de los estudios realizados concernientes al parasitismo gastrointestinal causado por diferentes especies de helmintos presentes en el tracto digestivo de pingüinos antárticos sólo abordan aspectos taxonómicos. Como objetivo general de este trabajo de investigación nos propusimos contribuir al conocimiento de las posibles alteraciones morfológicas y el modo de acción de las distintas especies de parásitos hallados. Se recolectaron un total de 80 individuos encontrados muertos de forma natural en diferentes islas del archipiélago Shetland del Sur e islas situadas más al sur, adyacentes a la península Antártica y se les realizaron las necropsias. A todos los individuos se les practicó un examen parasitológico y se realizó un examen microscópico histológico a las lesiones asociadas a la presencia de parásitos visibles, o a pequeñas nodulaciones o zonas endurecidas que evidenciamos al tacto de la superficie intestinal, aunque no se observara presencia aparente de parásitos. Se realizaron también cortes histológicos o se procesaron para su observación al microscopio electrónico de barrido (MEB) algunos ejemplares de Corynosoma sp. y de Parorchites zederi para el estudio morfológico de algunas de sus estructuras. La anatomía del sistema gastrointestinal en el pingüino barbijo coincide a grandes rasgos con lo descrito para la anatomía aviar en general y específicamente con las referencias al pingüino de Adelia (Pygoscelis adeliae) y su morfología se ajusta a las características propias de un ave carnívora. De los distintas especies de helmintos que parasitan a los pigoscélidos, el cestodo de la familia Dilepididae Parorchites zederi es el que demuestra tener una mayor capacidad de generar lesiones macro y microscópicas siendo el parásito más patógeno para las tres especies de pingüinos pigoscélidos, encontrándose las mayores alteraciones en el pingüino papúa. Le sigue en orden de importancia respecto a las lesiones que ocasiona su presencia, el acantocéfalo Corynosoma sp. aunque la baja intensidad media observada junto a la escasa penetración en los tejidos intestinales y la ausencia de lesiones severas asociadas, nos lleva a afirmar que los efectos, aunque patentes en dos de las tres especies de pingüinos pigoscélidos, no son muy perjudiciales. Nuestros resultados nos conducen a catalogar al cestodo Tetrabothrius pauliani y al nematodo Stegophorus macronectes, con respecto a las lesiones evidentes que ocasiona su presencia en el tracto digestivo de los individuos analizados como agentes prácticamente apatógenos. SUMMARY In order to take the appropriate decisions to conserve the Antarctica we need first to investigate the different diseases and parasites present in the wild, crucial factors to understand the Antarctica ecosystem health. This thesis aims to contribute to the knowledge of the pathogenesis associated with helminths within the digestive tract of three species of penguins: chinstrap penguin (Pygoscelis antarctica), gentoo penguin (Pygoscelis papua) and Adélie penguin (Pygoscelis adeliae) collected in locations throughout the Antarctic Peninsula. In order to accurately interpret the changes produced by digestive parasites on their hosts it is necessary to have detail knowledge of this organ in its normal state. However, the gastrointestinal tract in penguins has been poorly investigated. We therefore carried out a detail morphological description of the digestive system of the chinstrap penguins. The macroscopic description of the different segments was realized based on the observations of the necropsies performed either on the entire animal, or on intestinal parts previously thawed. To prevent tissue changes due to freeze-thaw process, the necropsy of a clinically healthy adult specimen was performed in situ in the Antarctic base, during the campaign 2012-2013. Small tissue samples from each part of the digestive system were selected for histopathological study. Most of the studies conducted on worms gastrointestinal parasitism of Antarctic penguins only address taxonomy. As a general objective of this research we aimed to contribute to the knowledge of the morphological alterations produced by the different species of parasites and its mechanism of action. Gastrointestinal tracts from a total of 80 individuals recently death, were collected in different locations along the Antarctic Peninsula. All individuals were subjected to a parasitological study and lesions containing parasites, nodules or scares were taken for histology. Samples were prepared for analysis under the light microscopy. Some parasites of Corynosoma sp. and Parorchites zederi were removed for examination by Scanning Electron Microscope (SEM). The anatomy of the gastrointestinal system in chinstrap penguin coincides with that described for avian anatomy in general and specifically with reference to Adelie penguin (Pygoscelis adeliae), sharing the characteristics of carnivorous birds. Among the different species of helminth that infect Pygoscelid, the cestode Parorchites zederi is proving to have a greater capacity to generate gross and microscopic lesions. We found that the gentoo penguins were the most sensitive to these parasites showing the most serious lesions. Corynosoma sp. follows in term of lesions severity although the low intensity, the poor penetration, and the lack of severe lesions indicate that the effects are not very harmful. The results of our investigation lead us to catalog the cestode Tetrabothrius pauliani and the nematode Stegophorus macronectes as practically non-pathogenic agents.
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    Evaluación toxicológica in vitro de los efectos producidos por cadmio, plomo, cromo y selenio en células renales y hepáticas a concentraciones encontradas en tres especies de pingüino de la Península Antártica e islas asociadas
    (2016-12-05) Meseguer Frutos, Ana; Motas Guzmán, Miguel; Barbosa Alcón, Andrés; Escuela Internacional de Doctorado
    La contaminación a escala global y local podría estar afectando a una de las hasta ahora consideradas últimas regiones prístinas en el mundo, la Antártida. En estudios previos realizados por nuestro grupo de investigación fueron detectadas diferentes concentraciones de metales en diferentes tejidos de tres especies de pingüinos de la Península Antártica e Islas asociadas (Pygoscelis antarctica, Pygoscelis papua y Pygoscelis adeliae), considerados especies clave para la monitorización de dichos contaminantes. En la presente tesis se ha llevado a cabo la evaluación in vitro de los efectos producidos por dichas concentraciones de cadmio, plomo, cromo y selenio en dos líneas celulares: VERO, de origen renal y AML12, de origen hepático. Para ello se ha evaluado la citotoxicidad basal y las respuestas celulares asociadas a dicha exposición mediante el estudio de su efecto sobre la viabilidad celular, cambios estructurales y ultraestructurales, modificaciones sobre las distintas fases del ciclo celular, el tipo de muerte celular predominante, el estrés celular y la expresión de diferentes genes relacionados con la protección celular contra la toxicidad de metales (metalotioneína), el estrés celular (Heat-Shock protein-70), el estrés oxidativo (catalasa) y apoptosis (bax). Para evaluar la viabilidad celular se empleó la técnica colorimétrica del MTT, mediante espectrofotometría; para evaluar el efecto sobre el ciclo celular y el tipo de muerte celular se utilizaron los reactivos IP e IP/anexina respectivamente, mediante citometría de flujo; los cambios estructurales y ultraestructurales fueron observados mediante microscopía óptica y electrónica de transmisión; el estrés celular fue estudiado mediante la sonda DCFHA-DA por citometría de flujo y finalmente, el estudio de expresión génica se llevó a cabo mediante qPCR. El ensayo de viabilidad celular mediante MTT muestra que la concentración media de individuos adultos para el cadmio impide la viabilidad celular en la línea celular VERO y sólo permite el 2% en AML12; en el caso del plomo ninguna concentración estudiada afecta de forma acusada sobre la viabilidad celular; el cromo afecta a la viabilidad celular con un porcentaje superior al 70% y dicha viabilidad, disminuye de forma destacada debido a la concentración media hallada en individuos juveniles en VERO y con el selenio la viabilidad celular resulta drásticamente afectada, siendo el porcentaje de células vivas no superior al 4% en ninguno de los casos. Los datos obtenidos sobre los efectos causados en las distintas fases del ciclo celular, muestran que el cadmio en líneas generales provoca en VERO la disminución de la fase G0/G1 y el aumento de la fase S, al igual que en las concentraciones más elevadas en AML12, la CE50 en plomo, el cromo en todos los casos y para las concentraciones más elevadas de selenio (concentración media hallada en individuos adultos, juveniles y pollos). Mientras que concentraciones menos elevadas de cadmio en AML12 (CE50, concentración media hallada en juveniles y pollos) producen el aumento de la fase G0/G1 y concentraciones menores de plomo el aumento de la fase G2/M. Las concentración media hallada en adultos y juveniles de cadmio en VERO y concentración media de adultos en AML12, CE50 del plomo en AML12, concentración media de pollos para el cromo en AML12 y selenio para concentraciones medias de adultos, juveniles y pollos provocan que más del 50% de las células se encuentren en estado de apoptosis o necrosis. En líneas generales, la muerte celular por apoptosis predomina sobre la necrosis. El estudio morfológico muestra que los rasgos más característicos en ambas líneas celulares son la formación de cuerpos de inclusión (plomo y cromo), fuerte vacuolización, condensación mitocondrial (para todos los elementos) y células con un alto grado de degeneración o necrosadas cuando son tratadas con cadmio o selenio. Todas las concentraciones empleadas salvo para el cromo en AML12 (no se observan diferencias significativas) y la concentración media de adultos para el cadmio (se produce un aumento significativo) producen la disminución de las unidades de fluorescencia (DCFH-DA) debido a la destrucción del material genético y la incapacidad de la célula para producir ROS, por lo que en este ensayo, los valores obtenidos sugieren un papel de ROS como indicador de mortalidad más que de toxicidad. Determinadas concentraciones de cadmio y selenio encontradas en hígado y riñón de las tres especies de pingüino, producen la sobreexpresión de genes relacionados con la protección y el estrés celular. Los resultados obtenidos evidencian el posible riesgo toxicológico que la contaminación en la Antártida puede provocar a nivel celular sobre las poblaciones de Pygoscelis antarctica, Pygoscelis papua y Pygoscelis adeliae en hígado y riñón. Summary Global and local contamination may be affecting one of the last pristine regions in the world, the Antarctica. Previous studies realized by our research group detected different concentrations of metals in different tissues of three species of penguin located in Antarctic Peninsula and associated islands (Pygoscelis antarctica, Pygoscelis papua and Pygoscelis adeliae), considered as key species in monitor such contaminants. In this Thesis we carried out the in vitro evaluation of the effects caused by such concentrations of cadmium, lead, chromium and selenium in two different cell lines: VERO, kidney cells and AML12, hepatic cells. Basal cytotoxicity and the responses associated to that exposition through the study of its effect on cellular viability, structural and ultrastructural changes, modifications on the cell cycle, type of predominant cell death and the cellular stress through the gene expression of genes related with metals toxicity (methallotioneins), cell stress (Heat-Shock proteins), oxidative stress (catalase) and apoptosis (bax) was studied. In order to evaluate the cell viability, a colorimetric technique was used, MTT through spectrophotometry. We evaluated the effect in cell cycle and the type of cell death using the reactive IP and IP/annexin respectively through Flow Cytometry. Structural and microstructural changes were observed by optic and electronic microscopy and cell stress was evaluated by the probe DCFHA-DA also by Flow Cytometry. Finally, gene expression study was carried out by qPCR. Cell viability assay using MTT shows that the mean concentration found in adult animals for cadmium is not compatible with cell viability in VERO cell line and we had only 2% of viability on AML12. None concentration studied of lead affected strongly to the cell viability; chromium affected with a percentage higher than 70%, this viability decreases in a remarkable way at the mean concentration found in juveniles animals in VERO cells. Selenium affected cell viability dramatically, with a percentage of living cells never higher than 4%. Data obtained about the effects caused on the different parts of the cell cycle show that cadmium causes a descent in G0/G1 and an increase in S phase for VERO cells, in the same way as higher concentrations studied in AML12, CE50 for lead, higher concentrations of selenium and every concentration of chromium. Meanwhile, lower concentrations of cadmium in AML12 (Ce50, juvenile and chicks) produced an increase of phase G0/G1 and lower concentrations of lead an increase of G2/M. More than 50% of cells were in apoptosis or necrosis for VERO cells treated at juvenile and adults concentrations for cadmium. Same result was found for AML12 cells treated with mean concentration found adults for cadmium, CE50 of lead, mean concentration found in chicks for chromium and mean concentration of adult, juvenile and chick of selenium. Morphological study showed that the most characteristic aspects observed in both cell lines are the inclusion bodies (lead and chromium), strong vacuolization and mithocondral condensation (every element studied) and a high degree of cell degeneration after treatment with cadmium and selenium. Every concentration used, except for the chromium in AML12 cells (no significant differences were observed) and mean adult concentration of cadmium (a significant increase was determined), cause a descent in fluorescence units (DCFH-DA) as a consequence of the destruction of genetic material and the inability of the cell for producing ROS, so in this assay obtained values suggest a role of ROS as indicators of mortality more than toxicity. Certain concentrations of cadmium and selenium found in liver and kidney of the three species of penguins, produced an overexpression of genes related with cell protection and stress. Results obtained in this Thesis, show the possible toxicological risk that the Antarctic contamination may cause at a cellular level in liver and kidney on population of Pygoscelis antarctica, Pygoscelis papua and Pygoscelis adeliae.
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    Parasitofauna de pingüinos pigoscélidos : morfología, infección, caracterización molecular y aplicaciones
    (2015-01-08) Vidal Burgos, Virginia; Barbosa Alcón, Andrés; Ortiz Sánchez, Juana; Facultad de Veterinaria
    A pesar de su aislamiento geográfico, el ecosistema antártico no está libre de la presencia de agentes infecciosos. Con esta tesis se pretende contribuir al conocimiento de los macroparásitos gastrointestinales de tres especies de pingüinos antárticos (Pygoscelis papua, Pygoscelis adeliae y Pygoscelis antarctica). Para ello se realizaron necropsias de individuos encontrados muertos de forma natural. Se recolectaron un total de 79 individuos en diferentes islas del archipiélago Shetland del Sur e islas situadas más al sur, adyacentes a la península Antártica. La gran mayoría de los pingüinos analizados estuvieron parasitados, mostrando una prevalencia global del 89 %. Sin embargo, el número de especies que se hallaron fue muy escaso, tan solo seis (Tetrabothrius pauliani, Parorchites zederi, Stegophorus macronectes, Pseudoterranova sp, Corynosoma sp.1 y Corynosoma sp.2). De ellos, solo los tres primeros, pueden ser considerados parásitos genuinos de las especies de pingüinos pigoscélidos, mientras que los restantes deberían ser tratados como parásitos accidentales. Esta escasa variedad específica puede explicarse por la alta especialización trófica (estenofagia) de los pingüinos que se alimentan principalmente de krill. La dificultad para la identificación de parásitos adultos fraccionados, en mal estado o de otros estadios de desarrollo de los helmintos como huevos o larvas, nos induce a considerar el empleo de técnicas alternativas para su diagnóstico e identificación como son los métodos moleculares. En este caso, la información molecular referente a las especies de parásitos aquí tratadas, así como de géneros y familias cercanas, es muy escasa, por lo que se procedió a realizar la caracterización molecular de las dos especies parásitas más prevalentes, Stegophorus macronectes y Parorchites zederi, obteniendo la secuencia del ADNr (18S, ITS1, 5.8S, ITS2 y 28S) de S. macronectes y la secuencia del ADNr 18S de P. zederi. Ambas secuencias fueron depositadas en la base de datos GenBank. Considerando que la información disponible de las relaciones filogenéticas de estas especies era nula, a partir de los datos moleculares obtenidos, concretamente con el ADNr 18S de S. macronectes y P. zederi, se realizaron estudios filogenéticos del orden al que pertenece cada especie (Spirurida y Cyclophyllidea, respectivamente) con el objetivo de clasificar molecularmente a estas especies dentro de su grupo. Por último, para obtener nuevos métodos diagnósticos, se desarrollaron sondas moleculares del parásito más prevalente, S. macronectes, a partir de las regiones ITS, y se probaron sobre individuos de la misma especie, especies cercanas, huevos y heces. SUMMARY In spite of its geographic isolation, the Antarctic ecosystem is not free from the presence of infectious agents. This thesis aims to contribute to the knowledge of gastrointestinal parasites from three species of antarctic penguins (Pygoscelis papua, Pygoscelis adeliae and Pygoscelis antarctica). To do so, necropsies were carried out on individuals who had died due to natural causes. An amount of 79 individuals were collected from different islands of the South Shetland Archipelago and from islands located in a southward direction, adjacent to the Antarctic Peninsula. The vast majority of penguins analyzed were parasitized, showing an overall prevalence of 89%. However, the number of parasites species found was very low, only six (Tetrabothrius pauliani, Parorchites zederi, Stegophorus macronectes, Pseudoterranova sp., Corynosoma sp.1 and Corynosoma sp.2). Only T. pauliani, P. zederi and S. macronectes could be considered genuine parasites from pygoscelid penguins, the remaining should be considered accidental parasites. This small variety in parasite species may be due to the high trophic specialization (stenophagia) of penguins, as they mainly feed on krill. The challenge to identify fractionated adult parasites, in bad condition or in other developmental stages such as eggs or larvae, leads us to carry out alternative techniques for diagnosis and indentification such as molecular methods. In these cases, the molecular information regarding the parasite species analyzed here, as genera and inmediate families is very scarce, so we proceeded to perform the molecular characterization of the two most prevalent parasite species: Stegophorus macronectes and Parorchites zederi, obtaining the sequence of rDNA (18S, ITS1, 5.8S, ITS2 and 28S) from S. macronectes and the 18S rDNA sequence from P. zederi. Both sequences have been deposited in the GenBank database. Due to null molecular phylogenetic information of these species, new studies were performed. Hence, 18S rDNA of Stegophorus mecronectes and Parorchites zederi were used in order to classify them molecularly within their orders. Finally, for obtaining new diagnostic methods, molecular probes of the most prevalent parasite, S. macronectes, were developed from the ITS regions and tested on individuals of the same species, closely-related species, eggs and feces.
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    Los pingüinos : bioindicadores de la contaminación ambiental en la península Antártica e islas asociadas
    (2012-11-06) Jerez Rodríguez, Silvia; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Ciencias Sociosanitarias
    La contaminación a escala global y local podría afectar a la región antártica. Los pingüinos presentan características útiles para la monitorización de contaminantes, por ser especies de vida larga situados en la cima de las cadenas tróficas. Se determinaron las concentraciones de Al, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, As, Se, Cd, Hg y Pb, así como de PCBS, PFCs, ftalatos y BPA mediante ICP-MS, GC-ECD y HPLC-EI-MS en tejidos y contenido estomacal de pingüinos papúa, barbijo y de Adélia (33 cadáveres y 207 muestras de plumas) recolectados en la zona de la Península Antártica (2006-2010). Los resultados muestran que la presión antropogénica puede estar aumentando los niveles de elementos traza en algunas zonas. La mayoría de los compuestos orgánicos fueron detectados en los tejidos de pingüino, excepto DEHP y BPA. Fueron identificados procesos de bioacumulación y biomagnificación de contaminantes. Cd y Se alcanzaron niveles potencialmente tóxicos para los pingüinos. Antarctic ecosystems could be affected by global and local pollution. Antarctic penguins present several characteristics of useful sentinels of pollution in Antarctica such as they are long-lived species situated at the top of food web. The concentrations of Al, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, As, Se, Cd, Hg and Pb and organic pollutants (PCBs, PFCs, phthalates and BPA) were assessed by ICP-MS, GC-ECD and HPLC-EI-MS in samples of soft tissues, feathers and stomach contents of gentoo, chinstrap and Adélie penguins (33 carcasses and 207 feather samples of living organisms) collected in the Antarctic Peninsula area (2006-2010). The obtained results showed that human pressure is increasing the presence of trace elements in some sampling sites. All of the analyzed organic compounds were also found in penguin tissues except for DEHP and BPA. Bioaccumulation and biomagnification phenomena were found for several pollutants. Cd and Se even reached levels potentially toxic.