Browsing by Subject "Peces de agua dulce"

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    Caracterización del papel de los receptores de TNF en inflamación usando el pez cebra como modelo= Modelling the impact of TNF receptors in inflammation using the zebrafish.
    (2013-10-08) Candel Camacho, Sergio; Meseguer Peñalver, José; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Sepulcre Cortés, María Pilar; Facultad de Biología
    INTRODUCTION: La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel que afecta a millones de personas. Aunque en ratón no existen modelos de psoriasis, la facilidad para obtener muestras de piel de pacientes ha facilitado el estudio de las vías de señalización implicadas en la enfermedad, mostrando la importancia del sistema inmune en su desarrollo. Algunas terapias que utilizan anticuerpos específicos contra varias citoquinas, incluyendo TNFα, IL-23 y IL-17, son prometedoras, pero son caras y presentan efectos secundarios. Numerosos estudios han mostrado la aparición de nuevos casos de psoriasis después del tratamiento con antagonistas del TNFα en pacientes con Inflammatory Bowel Disease. Aunque esos datos indican un papel ambiguo del TNFα en psoriasis, su papel, y especialmente la contribución de sus receptores, en la regulación de la inflamación en piel han sido escasamente estudiados. OBJECTIVES: (1) Caracterización del papel de Tnfa y sus receptores (Tnfr1 y Tnfr2) en la función y distribución de los neutrófilos en larvas de pez cebra; (2) Caracterización de las vías de señalización de Tnfr1 y Tnfr2 involucradas en la homeostasis de la piel en larvas de pez cebra; (3) Caracterización del papel de Tnfa y sus receptores en inflamación crónica en piel en larvas de pez cebra; (4) Evaluación de las larvas de pez cebra como posible modelo para estudiar enfermedades inflamatorias crónicas humanas. METHODOLOGY: Líneas transgénicas de pez cebra y las ventajas de trabajar con sus embriones en in vivo imaging y cell tracking han sido utilizadas para estudiar los patrones de distribución de los neutrófilos. Además, la inflamación en la piel causada por la depleción de Tnfa o Tnfr2, pero no Tnfr1, ha sido estudiada mediante la inhibición genética (morpholinos y formas dominantes negativas) y farmacológica (DPI) de Duox1. La expresión de moléculas pro-inflamatorias ha sido medida mediante RT-qPCR, Neutrófilos y queratinocitos han sido aislados de larvas control y deficientes en Tnfr2 usando FACS-sorting. Sondas específicas para H2O2 han sido usadas para detectar su producción. RESULTS AND CONCLUSIONS: La depleción de Tnfa o Tnfr2, pero no de Tnfr1, causa inflamación en la piel a través de la activación de un bucle inflamatorio de retroalimentación positiva que implica a H2O2/NF-κB/Duox1. Tanto la inhibición genética como farmacológica de Duox1 revierten completamente la inflamación en piel, situando al H2O2 derivado de Duox1 aguas arriba de la activación de NF-κB. Extraemos las siguientes conclusiones: (1) La inhibición genética de Tnfa o Tnfr2, pero no de Tnfr1, resulta en la movilización de los neutrófilos desde la CHT hasta la piel; (2) El silenciamiento de Tnfa o Tnfr2 provoca la inducción en la piel de la expresión de genes que codifican para moléculas pro-inflamatorias; (3) La ausencia de señalización de Tnfa a través del receptor Tnfr2 desencadena la producción local de H2O2 por la enzima Duox1 en la piel; (4) La inhibición genética de Tnfa o Tnfr2 resultada en la activación del regulador maestro de la inflamación NF-кB en la piel, aguas abajo de la producción de H2O2; (5) La señalización de Tnfa a través del receptor Tnfr2 es indispensable para el mantenimiento de la homeostasis de la piel; (6) La inducción de DUOX1 y/o la consiguiente producción de H2O2 en la piel de pacientes con psoriasis, podrían ser nuevas dianas para terapias farmacológicas y genéticas para el tratamiento de la psoriasis. Estas nuevas estrategias podrían ser también aplicables para otras enfermedades inflamatorias crónicas; (7) El pez cebra puede utilizarse como organismo modelo para estudiar la psoriasis y otras enfermedades inflamatorias crónicas. INTRODUCTION: Psoriasis is a chronic, debilitating skin disease that affects millions of people worldwide. Although there is no mouse model that accurately reproduces all facets of the psoriasis, the accessibility of skin tissue from patients has facilitated the elucidation of some pathways involved in the pathogenesis of psoriasis and highlighted the importance of the immune system in the disease. Recently developed antibodies that selectively target several cytokines, including TNFα, IL-23 and IL-17, have shown promising results in early-phase clinical trials. However, these treatments are extremely expensive and show important side effects. Importantly, numerous studies have reported new-onset psoriasis following TNFα antagonist therapy in adult inflammatory bowel disease patients. Despite these clinical data pointing to an ambiguous function of TNFα in psoriasis, the role of TNFα, and in particular the contribution of each TNFR, in the regulation of skin inflammation has scarcely been studied. OBJECTIVES: Taking that into consideration, the objectives of the present work are: (1) Characterization of the role played by Tnfa and its receptors (Tnfr1 and Tnfr2) in the neutrophil function and distribution patterns in zebrafish larvae; (2) Characterization of the Tnfr1 and Tnfr2 signaling pathways involved in skin homeostasis in zebrafish larvae; (3) Characterization of the role played by Tnfa and its receptors in chronic inflammation in the skin in zebrafish larvae; (4) Evaluation of the zebrafish larvae as a potential model for the study of human chronic inflammatory diseases. METHODOLOGY: Some zebrafish transgenic lines and the unique advantage of the zebrafish embryo for in vivo imaging and cell tracking have been used for the study of the neutrophil distribution patterns. Furthermore, the skin inflammation caused by the depletion of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1, has been studied using both genetic (morpholinos and dominant negative forms) and pharmacological (DPI) inhibition of Duox1. The expression of pro-inflammatory molecules has been measured by RT-qPCR, while neutrophils and keratinocytes have been FACS-sorted from controls and Tnfr2-deficient larvae. H2O2-specific probes have been used in order to detect the production of that compound. RESULTS AND CONCLUSIONS: We found that depletion of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1, caused skin inflammation through the activation of an H2O2/NF-κB/Duox1 positive feedback inflammatory loop. Moreover, both genetic and pharmacological inhibition of Duox1 completely abrogated skin inflammation, placing Duox1-derived H2O2 upstream of the positive feedback inflammatory loop. Thus, these results lead us to the next conclusions: (1) Genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1, results in neutrophil mobilization from the CHT to the skin, where they get infiltrated; (2) Target gene silencing of Tnfa or Tnfr2 results in the induction of the expression of genes encoding pro-inflammatory mediators in the skin; (3) The absence of Tnfa signaling through Tnfr2 triggers the local production of H2O2 by Duox1; (4) Genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2 results in the activation of the master regulator of inflammation NF-кB in the skin, downstream the production of H2O2; (5) Tnfa signaling through Tnfr2 is critically required for skin homeostasis; (6) DUOX1 induction and/or the subsequent production of H2O2 in the skin of psoriasis patients, may be new targets for pharmacologic and genetic therapies for the treatment of psoriasis. These new strategies could be applicable to other chronic inflammatory diseases as well; (7) Zebrafish can be used as a model organism for the study of psoriasis and other inflammatory chronic diseases.
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    Caracterización funcional de los receptores de TNF de pez cebra : Functional characterization of TNF receptors in cebrafish.
    (2013-11-22) Espín Palazón, Raquel; Meseguer Peñalver, José; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Facultad de Biología
    OBJETIVOS 1. Caracterización de los receptores de Tnf (Tnfr1 y Tnfr2) en la homeostasis vascular durante el desarrollo en pez cebra. 2. Caracterización de las rutas de señalización de Tnfr1 y Tnfr2 involucradas en el desarrollo de las células endoteliales y su homeostasis. 3. Caracterización del papel que juegan Tnfrs y sus ligandos (Tnfa y Lta) en la ola primitiva de hematopoyesis en el pez cebra. 4. Caracterización de los Tnfrs y sus ligandos (Tnfa y Lta) en la especificación y mantenimiento de las HSCs en el embrión de pez cebra. METODOLOGÍA Para la presente tesis doctoral, se ha utilizado el pez cebra (Danio rerio) como modelo de experimentación animal. Además, para la experimentación in vitro se han usado varias líneas celulares y técnicas de cultivo celulares. En cuanto a las técnicas de biología molecular, podemos destacar la microinyección en estadio de huevo de RNAm, morfolinos y DNA; RT-qPCR e hibridación in situ. También se han usado técnicas de microscopía tales como la microscopía confocal y de fluorescencia; técnicas inmunohistoquímicas y TUNEL para la detección de apoptosis; y técnicas de citometría y aislamiento físico de células mediante fluorescencia (FACS). RESULTADOS Durante la presente tesis doctoral, hemos caracterizado el papel que desempeñan el factor de necrosis tumoral (Tnfa) y sus receptores (receptores del factor de necrosis tumoral, Tnfrs) en el desarrollo de las células endoteliales y del sistema hematopoyético. Para ello hemos usado el pez cebra (Danio rerio), como modelo animal de vertebrados. Por un lado, nuestros resultados nos han llevado a concluir que la deficiencia en el gen de tnfr2 en embriones de pez cebra conlleva la inducción en células endoteliales de un programa apoptótico que depende de caspasa-8, caspasa-2 y P53, pero no caspasa-3. Además, la deficiencia simultánea de Tnfr1 o la activación de NF-ĸB, rescata la apoptosis de las células endoteliales, lo que indica que debe haber un equilibrio entre los dos receptores de Tnf para la correcta homeostasis vascular de este tipo celular. De forma similar, el Tnfa promueve la apoptosis de las células endoteliales humanas a través de Tnfr1, desencadenando la activación de caspasa-2 y P53. Por otro lado, en este trabajo demostramos que la señalización de Tnfa a través de Tnfr2 se necesita de forma intrínseca por las células madre hematopoyéticas (HSCs) para su mantenimiento y expansión. La deficiencia genética de Tnfa o Tnfr2, pero no de linfotoxina (Lta) o Tnfr1, conlleva la apoptosis de las HSCs cuando se especifican en el embrión. CONCLUSIONES 1. El silenciamiento génico dirigido contra Tnfr2 resulta en la inducción de un programa apoptótico dependiente de caspasa-8 en células endoteliales. Esta apoptosis se rescata mediante la eliminación de Tnfr1, lo que indica que se requiere un balance adecuado entre los Tnfrs para la integridad de las células endoteliales y la homeostasis vascular. 2. En las células endoteliales, el Tnfr1 señaliza apoptosis a través de la formación del complejo II y la consecuente activación de caspasa-8 y caspasa-2, mientras que Tnfr2 señaliza supervivencia mediante el comple I y la activación de NF-ĸB. 3. El programa apoptótico inducido por Tnfr1, en el cual participa caspasa-8, caspasa-2 y P53, se encuentra conservado evolutivamente en células endoteliales humanas. 4. La señalización de Tnfrs es dispensable para la hematopoyesis primitiva en el embrión de pez cebra. 5. La inhibición génica de Tnfa o Tnfr2, pero no Tnfr1 o Lta, resulta en la apoptosis de las HSCs cuando éstas emergen de la aorta dorsal. 6. La señalización Tnfa/Tnfr2 se requiere de forma intrínseca para la supervivencia de las HSCs a partir del endotelio hemogénico. OBJECTIVES 1. Characterization of Tnfa receptors (Tnfr1 and Tnfr2) in vascular homeostasis during the zebrafish embryo development. 2. Characterization of the Tnfr1 and Tnfr2 signaling pathways involved in endothelial cell development and homeostasis. 3. Characterization of the role played by Tnfrs and their ligands (Tnfa and Lta) in the primitive wave of hematopoiesis in the zebrafish embryo. 4. Characterization of Tnfrs and their ligands (Tnfa and Lta) in HSCs specification and maintenance in the zebrafish embryo. METHODOLOGY In this Doctoral Thesis, zebrafish (Danio rerio) has been utilized as research animal model. In addition, several cell lines and tissue culture techniques have been used for the in vitro experimentation. Related to the molecular biology techniques utilized, the injection at one-cell stage with mRNA, morpholinos and DNA; RT-qPCR and in situ hybridization can be emphasized. Moreover, other techniques used have been used such as confocal microscopy and fluorescence microscopy; immunohystochemistry techniques and TUNEL for apoptosis detection; as well as cytometry-related assays as fluorescence activated cell sorting (FACS). RESULTS During this Doctoral Thesis, we have characterized the role of Tnfa and Tnf receptors (Tnfrs) during endothelial and hematopoiesis development in the embryo using zebrafish (Danio rerio) as a vertebrate model. Targeted gene knockdown of Tnfr2 in zebrafish embryos results in the induction of a caspase-8, caspase-2 and P53-dependent apoptotic program in endothelial cells that bypasses caspase-3. Furthermore, the simultaneous depletion of Tnfr1 or the activation of NF-ĸB rescue endothelial cell apoptosis, indicating that a signaling balance between both TNFRs is required for endothelial cell integrity. Similarly, Tnfa promotes the apoptosis of human endothelial cells through Tnfr1 and triggers caspase-2 and P53 activation. On the other hand, we show that Tnfa signaling through Tnfr2 is intrinsically required for hematopoietic stem cells (HSCs) maintenance and expansion. The genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2, but not of lymphotoxin α (Lta) or Tnfr1, results in the apoptosis of HSCs soon after their emergence. CONCLUSIONS 1. Target gene silencing of Tnfr2 results in the induction of a caspase-8-dependent apoptotic program in endothelial cells. This apoptosis can be rescued by depletion of Tnfr1, indicating that an appropriate signaling balance between both Tnfrs is required for endothelial cell integrity and vascular homeostasis. 2. In endothelial cells, Tnfr1 signals apoptosis through complex II formation and caspase-8 and caspase-2 activation, while Tnfr2 signals survival via complex I and NF-ĸB activation. 3. The apoptotic program induced by Tnfr1, which involves caspase-8, caspase-2 and P53, is evolutionary conserved in human endothelial cells. 4. Tnfrs signaling is dispensable for primitive hematopoiesis in the zebrafish embryo. 5. Genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1 or Lta, results in HSC apoptosis soon after their emergence from the floor of the dorsal aorta. 6. Tnfa/Tnfr2 signaling is intrinsically required for HSC survival after their emergence from the hemogenic endothelium.