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Aislamiento y caracterización de células madre de membrana anmiótica murina
(2018-01-09) García Guillén, Ana Isabel; Marín Atucha, Noemí; García Bernal, David; Facultad de Medicina
RESUMEN Introducción: Las células madre derivadas de membrana amniótica humana han demostrado poseer características importantes de proliferación, diferenciación multipotencial, inmunomodulación e immunotolerancia. Estas características, unidas al hecho de tratarse de un tejido desechable tras el parto, las convierte en un objeto interesante en medicina regenerativa. Objetivos: Aislar y caracterizar las células madre de membrana amniótica murina (MAm), estudiando para ello la expresión de marcadores epiteliales y mesenquimales, de pluripotencialidad y proliferación, y sus propiedades inmunomoduladoras. Estudiar su aplicación terapéutica en un modelo murino de hemofilia A severa. Metodología: Tras el aislamiento de la MAm a partir de ratones hembras gestantes C57BL/6, se llevó a cabo el estudio histológico y expresión de diversos marcadores de células madre en el tejido aislado mediante PCR e inmunofluorescencia. Seguidamente, se obtuvieron las diferentes poblaciones celulares de la MAm para el estudio de su cultivo realizando ensayos de proliferación, clonogenicidad, el análisis del ciclo celular y estudios de capacidad multipotencial e inmunomoduladora. Además, en los cultivos, se analizó la expresión de diversos marcadores mediante PCR, citometría e inmunofluorescencia. Las células derivadas de MAm fueron empleadas como terapia celular en un modelo murino de hemofilia A severa. Para ello, se realizó el trasplante celular por vía intraportal o intraperitoneal, sacrificando los animales desde 1 semana hasta 1 año tras el trasplante. Resultados: La MAm consta de una capa de células epiteliales y una subcapa de células mesenquimales estromales, con expresión de sus marcadores específicos, marcadores de pluripotencialidad y proliferación, además de factor VIII (FVIII) y factor von Willebrand de coagulación. Tras el aislamiento de las células, se obtuvieron dos tipos celulares: un cultivo de células de tipo epitelial y un cultivo de células CD44+. Las células de tipo epitelial mostraron tendencia a la senescencia en cultivo, expresión negativa para marcadores hematopoyéticos y positiva para marcadores de células madre epiteliales y de pluripotencialidad. Estas células también mostraron una expresión positiva de marcadores de células madre mesenquimales en algunos pases del cultivo, y fueron capaces de diferenciarse a células de la capa mesodérmica. Las células CD44+ mostraron una alta capacidad de proliferación, una capacidad multipotencial que se mantuvo en cultivo, y una expresión de marcadores de pluripotencialidad, de proliferación y de células madre mesenquimales como vimentina, CD90, CD105 y CD73. Además, presentaron capacidad clonogénica e importantes propiedades inmunomoduladoras, siendo capaces de inhibir la proliferación de linfocitos T de una manera dosis dependiente. Finalmente, el trasplante alogénico de MAm en los animales con hemofilia A dio lugar a la expresión positiva para FVIII en el tejido hepático de los animales trasplantados desde 1 semana hasta 12 meses tras el trasplante. Conclusiones: La MAm está formada por células madre epiteliales y mesenquimales con capacidad multipotencial y de proliferación en cultivo. Las dos poblaciones de MAm estudiadas en cultivo, presentaron características similares a las células madre epiteliales y mesenquimales respectivamente. Las células de la MAm sintetizaron FVIII y sobrevivieron hasta 12 meses tras su trasplante alogénico en el modelo de hemofilia A severa, pudiendo ser consideradas como una herramienta terapéutica para dicha enfermedad. ABSTRACT Introduction: Human amniotic membrane has been previously described as a high throughput source for stem cells with capacity for proliferation and multipotent differentiation, reduced immunogenicity, and potent inmmunomodulatory properties. All of these characteristics make it a suitable cell source for further regenerative medicine approaches. Objectives: The main objective of this study was to isolate and characterize the murine amniotic stem cells in order to analyze their biological properties and specifically their pattern of expression of epithelial and mesenchymal markers, multipotent capacity and their inmunomodulatory properties in vitro, as well as their therapeutic efficacy in a murine model of haemophilia A. Methods: Amniotic membranes from pregnant females C57BL/6 mice (mAM) were carefully separated from the yolk sacs and collected. We carried out histological assays with whole mAMs as well as to study the expression of specific markers by PCR and inmunofluorescence. The different cell populations were isolated from the mAM and characterized by different techniques such as flow cytometry, inmunofluorescence and PCR. Furthermore, proliferation, differentiation capacity, cell cycle and clonogenic assays were performed. Moreover, the immunosuppressive capacity of the mAM cells was tested by using mixed lymphocyte cultures with allogeneic stimulator BALB/c and responder C57BL/6 splenocytes, cultured in presence of different ratios of mAM stem cells. Importantly, these cellular populations were used in a preclinical study of haemophilia A to analyze their therapeutic efficacy. In order to find out the more efficient route of administration of the cells, we performed intraportal and intraperitoneal transplants into the animals. Results: Two different types of cells were detected in freshly mAM, epithelial and mesenchymal stem cells. Both cell types expressed specific epithelial and mesenchymal markers, pluripotent and proliferation markers and also expressed the coagulation factors FVIII and von Willebrand factor. After setting up the most appropriate cell isolation protocol, we obtained two different types of cultures: one of epithelial-like cells and a CD44+ population cell culture. Epithelial-like cells showed signs of senescence at early passages in culture, negative expression for hematopoietic markers and positive for pluripotent and epithelial cell markers, although they also expressed mesenchymal markers in some culture passages. Furthermore, these cells were able to differentiate into lines of the mesoderm layer. On the other hand, CD44+ cells showed a high proliferation capacity and multipotent ability in all the studied culture passages. They expressed pluripotent, proliferative and other mesenchymal markers such as vimentine, CD90, CD105, and CD73. In addition, CD44+ cells displayed adequate clonogenic properties and induced a dose-dependent inhibition of the proliferation of activated C57BL/6 splenocytes in an allogeneic context. Finally, the mAM cell transplant into the haemophilic mice led to factor VIII expression in the hepatic tissue of the transplanted animals from 1 week up to 12 months post-transplant. Conclusions: mAM is composed by epithelial and mesenchymal stem cells that showed multipotent and proliferation properties in vitro. The population of epithelial-like cells displayed similar characteristics to epithelial stem cells, and at the same time, the population of CD44+ cells had similar characteristics to mesenchymal stem cells from other sources. Treatment with mAM stem cells in haemophilia A mice led to factor VIII gene expression, as well as to the production of the factor VIII protein in the liver of the transplanted haemophilic animals. Together, mAM may represent a rich source of pluripotent stem cells with immunomodulatory properties that could be effective for their therapeutical use in multiple murine preclinical studies in order to develop future human therapies.
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Análisis de la degeneración de los fotorreceptoes en modelos experimentales de retinosis pigmentaria, degeneración macular asociada a la edad y glaucoma =Analysis of photoreceptor degeneration in experimental models of retinitis pigmentosa, aging macular degeneration and glaucoma
(2015-07-24) Ortín Martínez, Arturo; Vidal Sanz, Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Villegas Pérez, María Paz; Facultad de Medicina
. Objetivo. Determinar el número total y la topografía de la población de conos en roedores adultos utilizando rutinas automatizadas que nos permita investigar objetivamente los efectos de diferentes modelos experimentales de patologías humanas tales como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinosis pigmentaria (RP) y la neuropatía óptica glaucomatosa (NOG) sobre la población de fotorreceptores. Material y métodos. Se han utilizado cinco cepas distinta de roedores: Sprague-Dawley (SD), Piebald Virol Glaxo (PVG) y la rata transgénica P23H-1, y ratones Swiss y C57/BL6. Todos los experimentos y procedimientos se han realizado bajo el estricto cumplimiento de las recomendaciones de la “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO)” y la “European Union guidelines for the use of animals in research”, y todos los procedimientos utilizados han sido previamente aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Murcia. Se han utilizado diferentes técnicas para el estudio histológico y morfológico y se han analizado en retinas montadas a plano y en secciones transversales; se han utilizado tecnologías de imagen avanzadas como la Spectral Domain Optical Coherence Tomography (SD-OCT)y se ha realizado análisis de proteínas mediante Western Blot. Como modelo de RP se ha utilizado la rata transgénica P23H-1, esta rata es portadora de una mutación autosómica dominante en el gen de la rodopsina que causa distrofia y muerte de los fotorreceptores. Se ha desarrollado un nuevo modelo experimental útil para la comprensión de la patología de la DMAE, la fototoxicidad localizada de los fotorreceptores tipo cono inducida por LED (FTIL). Por último se ha utilizado un modelo experimental de hipertensión ocular (HTO) inducida mediante láser que permite la evaluación de los efectos de la NOG sobre la población de fotorreceptores. Resultados. El número medio de conos que expresan la opsina-L es de 231.736 ± 14.517 en la rata SD; 239.939 ± 6.494 en la rata PVG; 117.424 ± 17.721 en el ratón Swiss y 135.155 ± 8.742 en el ratón C57/BL6. El número medio de conos que expresan la opsina-S es de 41.028 ± 5.074 en la rata SD; 27.316 ± 2.235 en la rata PVG; 146.682 ± 24.958 en ratones Swiss y 119.616 ± 8.756 en ratones C57/BL6. El porcentaje de conos duales en la rata SD es del 3,2%, del 2,9% en la PVG, de un 73% en el ratón Swiss y de un 40% en el C57/BL6. En todas las cepas de ambas especies existe un paralelismo en la distribución de las células ganglionares de retina (CGR) y los conos-L. La topografía de los conos-L en todas las cepas de rata y ratón analizadas es similar, se observan zonas de alta densidad en el eje nasotemporal superior, las densidades medias alrededor del nervio óptico y un descenso de densidad gradual desde las zonas centrales hacia las periféricas. Sin embargo, existen claras diferencias en la distribución de los conos-S entre las especies y cepas analizadas. El la rata P23H-1, la degeneración de los bastones ocurre antes que la de los conos y de forma rápida: primero con el acortamiento de los segmentos externos, a P30 existe una gran pérdida de bastones y a P180 la pérdida es prácticamente en la totalidad de la retina exceptuando la extrema periferia. La degeneración de bastones y conos está espaciotemporalmente relacionada, ocurre en forma de anillos que aparecen alrededor de P90 y se extiende por toda la retina. A P180, los anillos de degeneración son más abundantes en la retina ecuatorial y de mayor tamaño en la retina dorsal. En un nuevo modelo in vivo de fototoxicidad focal de los fotorreceptores inducido por LED, la SD-OCT muestra un daño en una región circular situado en la retina superotemporal. En esta región se observa una disminución progresiva del espesor de la retina desde 183,4 ± 5 mm (12 h) hasta 114,6 ± 6 mm (7 d). Las secciones transversales muestras una pérdida masiva de bastones y conos en la región dañada por la luz. En las retinas montadas a plano se observa una región circular con disminución del número de conos-L y conos-S. En este área circular en las retinas izquierdas y en la región correspondiente de la retina control derecha, el número total de conos-L o conos-S es de 7.118 ± 842 ó 661 ± 125 en las retinas fotoexpuestas (n=7) y de 14.040 ± 1.860 ó 2.255 ± 193 en las retinas control (n=7), respectivamente. Aunque el CNTF no, la brimonidina, el BDNF, PEDF y el bFGF muestran efectos neuroprotectores significativos sobre los conos-L y conos-S. La HTO provoca sectores con su vértice en el disco óptico carentes de CGR Brn3a pero que aún contienen gran número de núcleos DAPI positivos. Los niveles de todas las opsinas disminuyen a las 2 semanas y esta disminución progresa hasta el 20% de los niveles basales a los 3 meses. Las secciones transversales revelan áreas focales de degeneración en las capas externas de la retina (CER). Las CGR supervivientes a los 15 días representan aproximadamente el 28% y no cambian con el tiempo, mientras que de las poblaciones de conos-L y conos-S sobreviven un 80% y un 65% a un mes o un 35% y un 20% a 6 meses, respectivamente. Conclusiones. Se ha establecido, por primera vez, el número total y la distribución topográfica de los conos-L y conos-S en dos cepas de rata y dos de ratón y se ha demostrado el paralelismo topológico de la distribución de los conos-L y las CGR. Se han proporcionado las bases para estudiar la degeneración de conos y su prevención en condiciones patológicas. Se ha descrito por primera vez que, en la rata P23H-1, la degeneración de bastones y conos está espaciotemporalmente relacionada y se produce en anillos. La pérdida de conos sigue a la pérdida de bastones, que comienza de forma temprana, incluso antes de P30, la primera edad analizada. Las características de los anillos sugieren que la degeneración secundaria de conos está influenciada por la localización en la retina y / u otros factores intrínsecos o extrínsecos. Se ha evidenciado que la FTIL provoca una pérdida de conos y bastones y es un modelo fiable, cuantificable y reproducible para estudiar la degeneración de los fotorreceptores. La administración intravítrea de BDNF, PEDF o bFGF, o la administración tópica de brimonidina proporcionan neuroprotección significativa sobre los conos, en este modelo. Se ha demostrado que la HTO induce una pérdida selectiva de CGR en la capa de la CGR que no progresa después de 1 mes, mientras que los conos-L y conos-S presentan una pérdida progresiva hasta los 6 meses. Por lo tanto, HTO provoca graves daños tanto en las capas más internas como en las CER. SUMMARY. Purpose. To determine the total number and topography of the cone population in two rat and two mouse strains using automated routines which allowed us to investigate objectively the effects of different experimental models of human pathologies such as Aging Macular Degeneration (AMD), Retinitis Pigmentosa (RP) and Glaucomatous Optic Neuropathy (GON) on the photoreceptor population. Material y methods. A total of 303 rats and 23 mice were used in this thesis, five different strains of rodents were used: albino Sprague-Dawley (SD), pigmented Piebald Virol Glaxo (PVG) and P23H-1 transgenic rats, albino Swiss and pigmented C57/BL6 mice. All experimets and procedures were carried out in strict accordance with the recommendations in the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) and the European Union guidelines for the use of animals in research, and all the protocols were approved by the Ethical and Animal Studies Committee of the University of Murcia. Several techniques such as, the identification of the three different types of photoreceptors and other retinal populations by immunohistofluorescence analyzed in whole flat-mounted retinas and in oriented radial sections, classical staining as H-E, imaging advanced technologies as Spectral Domain Optical Coherence Tomography (SD-OCT), and protein analysis by western blot, have been used. In this thesis the P23H-1transgenic rat has been used as a model of RP, this animal bears an autoasomal dominat mutation in the rhodopsin gene (proline to histidine substitution at codon 23 of the rodopsin protein) that causes photorecptor dystrophy and death. A new experimental model useful to understand the AMD pathology, has been developed for this thesis, Light Emmitting Dioede (LED)-induced cone-photoreceptor phototoxicity (LIP), the blue-light LED exposition on the rat retina causes a damage-area located in the retinal zone with maximun L-cones densities and a cone to rod ratio similar to the human macular fovea. And finally, an experimental model of Laser-induced ocular hypertension developed recently in our Laboratory of Experimental Ophthalmology at the University of Murcia has been used to understand the effects of GON on the cone population. Results. The mean number of L-opsin+cones is 231,736 ± 14,517 in SD rat; 239,939 ± 6,494 in PVG rat; 117,424 ± 17,721 in Swiss mouse and 135,155 ± 8,742 in C57/BL6 mouse. The mean number of S-opsin+cones 41,028 ± 5,074 in SD rat; 27,316 ± 2,235 in PVG rat; 146,682 ± 24,958 in Swiss mouse and 119,616 ± 8,756 in C57/BL6 mouse. The percentage of dual cones is 3.2% in SD rat; 2.9% in PVG rat; 73% in Swiss mouse and 40% in C57/BL6 mouse. In all strains, and both species, there is a parallel distribution of retinal ganglion cells (RGC) and L-cones. The topography of L-cones is similar in all strains of rats and mice analyzed, the highest densities are observed in the superior nasotemporal axis, medium densities around the optic nerve, and this density gradually decreases from the center to the periphery. However, obvious differences are found in S-cones distribution. While in the two rat strains there is a increasing gradient of S-cones density along the inferonasal quadrant and the highest densities are found in the retinal rim, in the Swiss mouse strains S-cones are abundant in the dorsal retina although their highest densities are ventral but the C57/BL6 mouse shows a low number of S-cones in the dorsal retina and very dense population in the ventral retina, being densest in its nasal aspect. In P23H-1 rats, rod degeneration occurs rapidly: first the rod outer segment shortens, at P30 there is extensive rod loss, and by P180 rod loss is almost complete except for the most peripheral retina. The numbers of L cones are, at all postnatal ages, lower in P23H-1 rats than in control SD rats, and decrease significantly with age (by P180). Rod and cone degeneration is spatiotemporally related and occurs in rings that appear already at P90 and spread throughout the entire retina. At P180, the rings of rod-cone degeneration are more abundant in the equatorial retina and are larger in the dorsal retina. In a novel in vivo model of focal LED-induced photoreceptor phototoxicity SD-OCT showed damage in a circular region of the superotemporal retina, whose diameter varied from 1,842.4 ± 84.5 mm (at 24 hours) to 1,407.7 ± 52.8 mm (at 7 days). This region had a progressive thickness disminution from 183.4 ± 5 mm (at 12 h) to 114.6 ± 6 mm (at 7 d). Oriented cross-sections showed within the light-damaged region of the retina massive loss of rods and cone-photoreceptors. Wholemounts documented a circular region containing lower numbers of L- and S-cones. Within a circular area (1 mm or 1.3 mm radius, respectively) in the left and in its corresponding region of the contralateral-fellow-retina, total L- or S-cones were 7,118 ± 842 or 661 ± 125 for the LED exposed retinas (n=7) and 14,040 ± 1,860 or 2,255 ± 193 for the fellow retinas (n=7), respectively. Brimonidine, BDNF, PEDF and bFGF but not CNTF showed significant neuroprotective effects on L- and S-cones. Ocular hypertension (OHT) resulted in wedge-like sectors with their apex on the optic disc devoid of Brn3aRGC but with large numbers of DAPI+nuclei. The levels of all opsins diminished by 2 weeks and further decreased to 20% of basal-levels by 3 months. Cross-sections revealed focal areas of outer retinal layers (ORL) degeneration. RGC survival at 15 days represented approximately 28% and did not change with time, whereas the L-cone and S- populations diminished to 80% and 65%, or to 35% and 20% at 1 or 6 months, respectively. Conclusions. It has been established, for the first time, the total number and the topographical distribution of S- and L-cones in two rat and two mouse strains and demonstrated the correlation of L-cones and RGC spatial distribution. It has been provided the basis to study cone degeneration and its prevention in pathologic conditions. It has been described for the first time that in the P23H-1 rat, rod and cone degeneration is spatiotemporally related and occurs in rings. Cone loss follows rod loss and starts very soon, even before P30, the first age analyzed here. The characteristics of the rings suggest that secondary cone degeneration is influenced by retinal position and/or other intrinsic or extrinsic factors. It has been evidenced that LIP results in rod and cone-photoreceptor loss, and is a reliable, quantifiable model to study cone-photoreceptor degeneration. Intravitreal BDNF, PEDF or bFGF, or topical BMD afford significant cone neuroprotection in this model. It has been demostrated that OHT induces in the ganglion cell layer selective RGC loss that does not progress after 1 month, whereas the S- and L-cones exhibit progressive loss up to 6 months. Thus, OHT results in severe damage to both the innermost and the ORL. Palabras clave: Retina, Fotorreceptores, Conos, Retinosis Pigmentaria, Degeneración Macular Asociada a la Edad, Glaucoma. Key words: Retina, Photoreceptors, Cones, Retinitis Pgmentosa, Aging Macular Degeneration, Glaucoma.
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Análisis de la evolución del queratocono tratado con Crosslinking
(2014-04-08) López Izquierdo, Inmaculada; Gutiérrez Ortega, Ángel Ramón; Gómez Ramírez, Ana María; Facultad de Medicina
El queratocono es una patología no inflamatoria de la córnea en la que se produce un adelgazamiento corneal, que causa un aumento progresivo de la curvatura de la córnea, con miopía y astigmatismo irregular (defectos ópticos que causan una importante pérdida de visión). Es una enfermedad que evoluciona aumentando progresivamente y llegando en la fase avanzada a un adelgazamiento y una ectasia (deformidad) grave, que explicaría la acusada distorsión de las imágenes y la pérdida de agudeza visual. Las opciones terapéuticas dependen del mayor o menor adelgazamiento y la deformidad corneal y van desde el uso de gafas ó lentillas, aplicación de Crosslinking, la implantación de anillos intracorneales, hasta la queratoplastia. En el caso que nos ocupa nos centraremos en el Crosslinking, que es un tratamiento que consiste en la activación, mediante luz ultravioleta, de una sustancia llamada riboflavina que produce una especie de polimerización entre las láminas de colágeno corneales, cuyas uniones moleculares se encuentran debilitadas o ausentes, para reforzar la rigidez de la córnea. Por lo tanto, el propósito de este estudio es determinar los cambios inducidos por el Crosslinking en ojos con queratocono tratados mediante esta técnica, durante un periodo de tiempo de dos años tras la intervención. Para ello, se han analizado 22 ojos de 18 pacientes, todos ellos diagnosticados de queratocono en progresión y tratados con Crosslinking. Se han realizado exámenes de agudeza visual, refracción subjetiva, presión intraocular, biomicroscopía, exploración de fondo de ojo y análisis de Scheimpflug con el Pentacam. Este protocolo de exámenes se realizó tanto preoperatoriamente como al mes, tres meses, seis meses, un año y dos años tras la intervención. Los resultados obtenidos muestran como la máxima agudeza visual corregida aumentó 1,33 líneas a los dos años del Crosslinking, la esfera de la mejor corrección óptica se mantuvo estable a lo largo del tiempo de seguimiento, al igual que el cilindro y la presión intraocular. En la superficie anterior de la córnea, tanto la K media como el astigmatismo, la asfericidad, el grado del queratocono, todos los índices corneales analizados, incluido el radio mínimo anterior, y la elevación en esta cara se mantuvieron estables sin diferencias con respecto al valor preoperatorio. En la superficie posterior corneal la K media, el astigmatismo, la asfericidad y la curvatura mínima no sufrieron cambios durante este periodo de tiempo. Sin embargo, los valores de la elevación si que se encontraron por encima de los valores preoperatorios. Los valores de la paquimetría en el ápex y en el punto más delgado a los dos años del Crosslinking se encontraron por debajo de los valores preoperatorios, por el contrario, la paquimetría en el centro pupilar mantuvo su valor tras el periodo de seguimiento. Tampoco se han encontrado diferencias en la posición de ninguno de los puntos analizados. La densitometría corneal, el volumen corneal y el poder refractivo real de la córnea, mantuvieron su valor transcurridos dos años de la intervención. En la cámara anterior, ni el ángulo, ni la profundidad cambiaron tras el Crosslinking pero el volumen de la cámara anterior fue menor. En la densitometría del cristalino, no se registró cambio alguno durante el periodo de seguimiento. La impresión general que se obtiene, a la vista de los resultados obtenidos, es que el Crosslinking parece ser eficaz para detener la progresión del queratocono, ya que casi todos los parámetros estudiados se mantienen estables transcurridos dos años de la intervención. Keratoconus is a non-inflammatory disorder of the cornea that produces corneal thinning, which causes a progressive increase in the curvature of the cornea, with myopia and irregular astigmatism (optical defects that cause an important loss of vision). It is a condition that becomes progressively worse and leads to the advanced phase of thinning and serious ectasia (deformity), which would explain the attributed distortion of images and the loss of visual acuity. The therapeutic options depend on the greater or lesser extent of the thinning and corneal deformation and can range from the use of glasses or contact lenses, implementation of Crosslinking, implantation of intracorneal rings, and corneal transplantation. In the case that interests us we will focus on Crosslinking, which is a treatment that consists of the activation, by means of ultraviolet light, of a substance called riboflavin that produces a sort of polymerization among the corneal collagen layers, whose molecular bonds are found weakened or absent, in order to strengthen the rigidity of the cornea. Therefore, the intention of this study is to determine the changes provoked by Crosslinking in eyes with keratoconus treated with this technique, during a two-year period of time after the procedure. To do this, 22 eyes from 18 patients have been analyzed, all of them diagnosed with progressing keratoconus and treated with Crosslinking. Examinations were performed for visual acuity, subjective refraction, intraocular pressure, biomicroscopy, fundus photography and a Scheimpflug analysis with a Pentacam. This protocol of examinations was performed pre-operatively as well as within one month, three months, six months, one year and two years after the procedure. The results obtained show how the maximum visual acuity corrected increased 1.33 lines two years after the Crosslinking procedure, the sphere of the best optical correction remained constant throughout the monitoring time, the same was seen in the cylinder and intraocular pressure. On the anterior surface of the cornea, the mean K value, astigmatism, asphericity, the degree of keatoconus, all of the analyzed corneal indices, including the minimum anterior radius, and the elevation in this surface remained stable without differences in respect to the pre-operatory values. In the posterior surface of the cornea the mean K value, astigmatism, asphericity and the minimum curvature did not experience any changes during this period of time. However, the elevation values were found to be higher than those of the pre-operatory values. The pachymetry values of the apex and finest point two years after Crosslinking surgery were found to be below pre-operatory values, on the contrary, the pachymetry of pupil center maintains its values after the monitoring period. No differences have been found in the position of any of the analyzed points. Corneal densitometry, corneal volume and actual refractive power of the cornea maintained their values two years after the procedure. In the anterior chamber, neither the angle, nor the depth changed after Crosslinking but the volume of the anterior chamber was less. Lens densitometry did not register any change during the treatment period. The general impression, in light of the obtained results, is that Crosslinking seems to be effective in halting the progression of keratoconus, due to the fact that almost all of the studied factors remain stable two years after the operation.
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Aplicaciones del suero autólogo en la consulta del servicio de oftalmología en el Hospital Donostia.
(Murcia : Servicio de Publicaciones de la Universidad de Murcia, 2008) Solórzano Sánchez, M.; Pernas Pena, A.; Zabala Largo, AI.
Introducción: La etiología del ojo seco se relaciona con la falta de factores de crecimiento, responsables de mantener una adecuada proliferación de la superficie del epitelio ocular. En la sangre se encuentran estos componentes, por lo que la utilización del suero autólogo es una opción terapéutica para el ojo seco. El suero autólogo es un preparado a base de tu propia sangre centrifugada a 3.000 rev/minuto. Objetivo: Protocolizar el procedimiento de prescripción, elaboración, y dispensación de colirio de suero antólogo. Material y Métodos: En el año 2004 se acordó con el Servicio de Oftalmología definir la protocolización del colirio de suero autólogo. Resultados: Entre mayo de 2004 y abril de 2006 se ha tratado a 42 pacientes. En el 2004 se elaboraron colirios para 11 pacientes, en el 2005 para 32, y hasta abril del 2006 para 22. El 50% de los pacientes ha necesitado ser retratado al menos una vez, siendo los casos con EICH, con una media de 8 dispensaciones por paciente, los más retratados. Conclusiones: El aumento de la demanda justifica la protocolización de este preparado. La elaboración y dispensación del colirio por parte del Servicio de Farmacia garantiza la esterilidad y estabilidad del mismo, y posibilita la atención farmacéutica orientada a la mejora de la eficacia y correcto uso del colirio. Todos los pacientes tratados con Suero Autólogo han mejorado de su patología de ojo seco. Han mejorado en su calidad de vida (menos molestias en la visión, mejor visión).
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Base de datos normativa del grosor de las capas retinianas maculares segmentadas usando el algoritmo de polo posterior 8x8 de la SD-OCT Spectralis
(Universidad de Murcia, 2020-07-29) Palazón Cabanes, Ana; García Medina, José Javier; Villegas Pérez, María Paz; Escuela Internacional de Doctorado
Introducción: Las bases normativas de datos, creadas a partir de sujetos sanos, permiten la interpretación de los espesores retinianos obtenidos mediante los dispositivos de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT). Sin embargo, actualmente no existe una base normativa de datos para el algoritmo de polo posterior (APP) 8x8 de la SD-OCT Spectralis™. Objetivo: Proporcionar valores normales del espesor de todas las capas macular para el APP 8x8 de la SD-OCT Spectralis™ en la población caucásica y analizar el impacto de diferentes variables como la edad, el sexo, la longitud axial y la lateralidad del ojo explorado sobre el espesor de las diferentes capas maculares. Material y métodos: Se trata de estudio observacional y transversal en el que se han incluido 300 ojos de 300 individuos sanos caucásicos con edades comprendidas entre 18 y 84 años (ambos sexos representados por igual). Los criterios de inclusión y de exclusión han predeterminado el tamaño y sexo de la muestra para los diferentes grupos de edad y han evitado la inclusión de pacientes con enfermedades que pudieran afectar el espesor de las capas maculares. Todos los sujetos fueron explorados oftalmológicamente y se les realizó el APP 8x8 de la SD-OCT Spectralis™, que está compuesto por una rejilla de 64 celdas (8x8). Se realizó la segmentación automática y el análisis del espesor de las siguientes capas retinianas: capa de fibras nerviosas (CFNR), capa de células ganglionares (CCG), capa plexiforme interna (CPI), capa nuclear interna (CNI), capa plexiforme externa (CPE), capa nuclear externa (CNE), epitelio pigmentario de la retina (EPR), retina interna (INT), retina externa (EXT) y el espesor completo de la retina (RETINA). Resultados: Se han obtenido los valores medios, así como los percentiles 1, 5 y 95, para cada celda y capa de la retina macular. Se ha observado correlaciones negativas significativas entre la edad y el espesor medio de la mayoría de las capas maculares, excepto para la CFNR, CPE y el ERP. La mayoría de las capas maculares han mostrado un espesor significativamente mayor en los hombres que en las mujeres, excepto la CFNR, CPE y el EPR. El espesor medio de la mayoría de las capas retinianas no ha mostrado correlaciones significativas con la longitud axial, excepto la CFNR ha mostrado una correlación positiva significativa con la longitud axial. Sin embargo, se han observado correlaciones positivas significativas entre la longitud axial y el espesor de la CCG, CPI y CNI en las celdas más centrales y correlaciones negativas significativas en las celdas cercanas al nervio óptico. La CFNR, CNI y CPE han mostrado un espesor significativamente mayor en los ojos derechos que en los ojos izquierdos, mientras que el resto de las capas maculares no han mostrado diferencias significativas entre los dos ojos. Conclusiones: Esta es la primera base normativa de datos del espesor de las diferentes capas de la retina macular para el APP 8x8 de la SD-OCT Spectralis™ en la población caucásica. Nuestro estudio documenta variaciones topográficas del espesor de las capas retinianas característicos para cada capa y que la edad, el sexo y la longitud axial influyen en los espesores de las diferentes capas de la retina macular.
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Calidad de vida en pacientes con uveítis
(Universidad de Murcia, 2022-07-28) Medina Tovar, Blanca; Gómez Ramírez, Ana María; Navarro Zaragoza, Javier; Escuela Internacional de Doctorado
Introducción. Las uveítis se caracterizan por la inflamación de la capa media de la pared del globo ocular, sin embargo, estructuras adyacentes pueden verse implicadas. Aunque, puede afectar a la población de cualquier edad, la mayor prevalencia se da en adultos jóvenes. Además, más de un 50% de los afectados por esta inflamación ocular desarrollarán complicaciones relacionadas con la uveítis y más de un 30% sufrirá discapacidad visual. Estas condiciones llevan no sólo a un importante gasto sanitario derivado de la atención de estos pacientes, sino que asocian una importante carga económica, social y personal que conlleva la reducción de la productividad y la incapacidad laboral. La evaluación de la calidad de vida relacionada con la visión (CVRV) del paciente a través de cuestionarios estandarizados nos permite valorar de forma objetiva la carga real de la enfermedad y el grado de sufrimiento del paciente en relación con su visión. Así mismo, varias características sociodemográficas y clínicas relacionadas con las uveítis se han asociado con el deterioro de la calidad de vida en estos pacientes. Objetivos. Evaluar la CVRV y sus diferentes dominios en pacientes con uveítis. Describir el perfil sociodemográfico y clínico de los pacientes con uveítis, así como evaluar la influencia de las características sociodemográficas, localización anatómica de la uveítis, afectación uni o bilateral, la severidad de la inflamación ocular, el tratamiento recibido y la mejor agudeza visual corregida (MAVC) binocular de lejos en las diferentes subescalas de la CVRV. Material y métodos. Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Uveítis del Hospital General Universitario Reina Sofía de Murcia. Se trata de un estudio observacional, transversal que incluye 136 pacientes con uveítis no infecciosa de más de 12 meses de evolución (grupo estudio) y 136 pacientes con características sociodemográficas y clínicas similares a los del grupo estudio, pero sin enfermedad inflamatoria ocular (grupo control). De todos ellos, se recogieron variables sociodemográficas, antecedentes personales y variables clínicas en relación con su enfermedad sistémica de base. Además, de los pacientes del grupo estudio fueron recogidas las siguientes variables relacionadas con su proceso inflamatorio: mejor agudeza visual corregida (MAVC) binocular de lejos, presión intraocular, exploración con lámpara de hendidura para valorar la actividad inflamatoria en la cámara anterior y vítreo, exploración del fondo de ojo, tomografía de coherencia óptica y angiografía si se requería. A ambos grupos de pacientes se les administró el cuestionario NEI VFQ-25 para conocer el estado de su CVRV. Resultados. Para el tratamiento de los datos obtenidos se empleó el paquete estadístico de software libre R (R Core Team, 2021. Se realizó un estudio descriptivo y correlacional, con el uso del coeficiente de correlación de Spearman. Para la búsqueda de diferencias significativas se optó por la prueba t de Student y el ANOVA, según el tipo de variable. En todo el análisis se tomó p-valor inferior a 0,05 y nivel de significación α = ,05. La edad media de los pacientes del grupo estudio fue de 47,2 ± 15,7 años y el 50,74% de la muestra de dicho grupo eran varones. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las variables sociodemográficas y clínicas de ambos grupos. La forma de presentación más frecuente en nuestros pacientes fue la uveítis bilateral de localización anterior; la MAVC binocular de lejos fue de 0,84 ± 0,24. En relación a la CVRV encontramos diferencias estadísticamente significativas en todas las subescalas del cuestionario NEI VFQ-25, con una peor puntuación en los pacientes del grupo estudio, menos en la subescala de salud general (p=0,054) y en la visión del color (p=0,28). Respecto a la relación entre la localización anatómica de la uveítis y la CVRV, los pacientes con panuveítis obtuvieron un peor resultado en todos los dominios del cuestionario NEI VFQ-25 menos en las dificultades laborales (p=0,052). Los pacientes con uveítis bilaterales fueron los que obtuvieron peor puntuación en las subescalas del cuestionario para la CVRV, pero solo se observaron diferencias significativas en el dominio de la funcionalidad social (p= 0,049) y en el grado de dependencia (p= 0,047). Los pacientes que recibían tratamiento sistémico fueron los que obtuvieron mejores puntuaciones en las subescalas del cuestionario NEI VFQ-25, encontrando diferencias estadísticamente significativas en dolor ocular, visión de lejos y salud mental. Por último, en relación con la MAVC, encontramos una correlación positiva (0,71) con la CVRV y negativa con la edad y la localización del proceso inflamatorio (-0,44), así mismo, se correlacionó positivamente con las subescalas visión general (0,46), visión de cerca (0,38), visión de lejos (0,44), funcionalidad social (0,45), salud mental (0,28), conducción (0,39) y visión periférica (0,26). Conclusiones. Los pacientes con uveítis tienen una peor CVRV respecto a otros pacientes con enfermedades similares, pero sin inflamación ocular, presentando puntuaciones inferiores en casi todas las subescalas de la CVRV. Se debe realizar una mejor valoración integral de estos pacientes por la repercusión que la inflamación ocular tiene en su CVRV.
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Calidad de vida relacionada con la visión, utilidades en salud y efectividad de la facoemulsificación en el paciente con cataratas.
(2013-07-08) Díaz Calvo, Francisca Sonia; Pérez Fernández, Pedro; Iniesta Navalón, Carles; Gascón Cánovas, Juan José; Facultad de Medicina
Objetivo: explorar las limitaciones en la calidad de vida derivadas del padecimiento de cataratas y determinar el nivel de calidad de vida relacionada con la visión (CVRSV), la agudeza visual (AV), las utilidades en salud y la efectividad de la facoemulsificación en estos pacientes. Metodología: Se han combinado la investigación cualitativa y la epidemiológica. En esta última se ha empleado un diseño preexperimetal pre-post cirugía en una población de 201 pacientes intervenidos de cataratas. Para determinar la CVRSV del paciente se ha empleado el cuestionario VFQ25+14. Resultados: La facoemulsificación de la catarata tiene una utilidad media de 0,36. Con ella mejoran, en relación con la situación basal, tanto la AV (79,8%±7,3), como la CVRSV global (69,1%±6,1), especialmente en pacientes sin retinopatía, con catarata subcapsular predominante y con una mayor agudeza visual basal. Conclusiones: la facoemulsificación es una técnica valorada por el paciente y eficaz para mejorar la CVRSV; no obstante esta última depende de la comorbilidad y la sintomatología clínica basal. Palabras clave: Calidad de vida relacionada con salud visual, agudeza visual, VFQ25+14, catarata, facoemulsificación, medida de utilidad, compensación temporal.Objectives: To explore the life quality limitations caused by eye cataracts, to define vision-related quality of life (VRQOL), the visual acuity (VA) and the healthcare utilities of phacoemulsification procedure on these patients. Methods: This one had combined qualitative and epidemiological researches. In the last one we used a pre experimental design, having regard to the previous and posterior results of the eye cataracts surgery in a 201 population patients. It has been used VFQ25+14 questionnaire to determine the patient´s VRQOL with cataracts. Results: The eye cataracts phacoemulsification has average usefulness rate of 0.36. This procedure improve the (VA) (79,8% +/- 7,3) and the global VRQOL (69,1% +/- 6,1) with respect the baseline; especially in patients without retinopathies, those with a prevailing subcapsular cataract and a higher basal visual acuity. Conclusions: The phacoemulsification is highly valued to enhance the VRQOL according the patient´s comments, nevertheless this procedure depends upon the comorbidity and symptom baseline. Keywords: vision-related quality of life, visual acuity, VFQ25+14, cataract, phacoemulsification, utility measure, time trade-off.
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Calidad óptica del ojo humano en función de la edad
(Universidad de Murcia, 2009-09-09) Guirao Piñera, Antonio; Artal Soriano, Pablo; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Física
Se ha estudiado la calidad óptica del ojo en función de la edad para entender mejor el envejecimiento del sistema visual humano. Se ha construido un sistema experimental de registro de imágenes, adaptado a un entorno clínico, para medir la función de transferencia (MTF) ocular, y se ha desarrollado un procedimiento computacional para obtener las aberraciones ópticas de la córnea. Se han realizado medidas en una población de 60 sujetos distribuidos en tres grupos de edad (20-30 años, 40-50 años y 60-70 años), y en un grupo de pacientes implantados con lente intraocular. La MTF media ocular empeora de cada grupo de edad al siguiente, y las aberraciones corneales tienden a aumentar. La calidad óptica del ojo humano se reduce progresivamente con la edad; la córnea es parcialmente responsable de esa reducción. La calidad óptica en pacientes con lente intraocular es similar a la media de los sujetos mayores normales. The optical quality of the eye was studied as a function of age to better understand the aging process in the human visual system. An experimental imaging system, adapted to a clinical environment, was constructed to measure the ocular modulation transfer function (MTF). A computational procedure was developed to obtain the optical aberrations of the cornea. Measurements were performed in a population of 60 subjects within three age groups (20-30 years, 40-50 years, and 60-70 years), and in a group of 20 patients implanted with intraocular lenses. The average MTF declines as age increases from young to middle and older groups. Corneal aberrations tends to increase with age. Optical quality of the human eye progressively deteriorates with age. The cornea may partially explain the reduction of optical performance of the complete eye. The average image quality in patients with intraocular lenses was similar to the average of normal older subjects.
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Caracterización de las células ganglionares de la retina melanopsínicas y estudio de la degeneración y neuroprotección de las células ganglionares de la retina en el roedor
(2014-03-13) Galindo Romero, Caridad; Agudo Barriuso, Marta; Vidal Sanz, Manuel; Villegas Pérez, María Paz; Facultad de Medicina
Objetivos Caracterizar la población de células ganglionares de la retina melanopsínicas (CGRm) en la rata adulta en relación con la población total de células ganglionares de la retina (CGR) y analizar su distribución espacial en la retina. Caracterizar si el Brn3a es un buen marcador de las CGR en ratones albino (Swiss) y pigmentado (C57BL/6). Analizar la curva temporal de muerte de las CGR de ratón después de la sección del nervio óptico (SNO), y evaluar el efecto neuroprotector del factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) sobre estas neuronas. Investigar la respuesta de las células de microglía fagocítica en las retinas axotomizadas y en las contralaterales a la lesión. Material y métodos La caracterización de las CGRm se llevó a cabo en 16 ratas albinas adultas Sprague-Dawley (SD). Para saber si las CGRm envían sus axones a través del nervio óptico (NO), se aplicó Fluorogold (FG) en el muñón del NO. Para conocer la proporción de CGRm que proyectaban a los colículos superiores (CS), región retinorrecipiente a la que proyectan el 98,4% de las CGRs en la rata, se aplicó FG en ambos CS. para saber si las CGRm expresan Brn3a y cuantificar automáticamente y comparar el número y distribución espacial de ambas poblaciones, se realizó la inmunodetección doble de melanopsina y Brn3a en retinas de animales intactos. Se utilizaron 158 ratones adultos pigmentados C57BL/6 y 34 albinos Swiss. Una semana antes de la SNO (a 0,5 mm del disco óptico), las CGR se trazaron retrógradamente con metanosulfonato de hidroxistilbamidina (OHSt), un análogo del FG. Para caracterizar el Brn3a como marcador de las CGR y su curso temporal de muerte tras SNO, los animales fueron sacrificados a diferentes intervalos de supervivencia tras la SNO (2, 5, 7, 9, 14 o 21 días). Como control se usaron animales intactos. Las retinas se disecaron en montajes globales y se incubaron con anticuerpos contra Brn3a. En un segundo grupo de experimentos se evaluó el efecto de una inyección intravítrea de BDNF (2,5 µg) o vehículo (PBS) en la población de CGR y de la microglía fagocítica. A tiempos crecientes tras la cirugía (3, 5, 7 y 14 días) se disecaron las retinas a plano y se inmunodetectó el Brn3a (CGR) e Iba1 (células de la microglía). Las CGR-OHSt+ y Brn3a+ se cuantificaron y se analizó la distribución espacial de las CGR-Brn3a+ construyendo mapas de isodensidad celular. Además, se cuantificaron las células de microglía fagocítica marcadas transcelularmente con OHSt e inmunodetectadas con Iba1 y se analizó su distribución espacial mediante mapas de vecinos. El mismo análisis de las CGR y las células de microglía se realizó en las retinas contralaterales a la SNO. Resultados En las retinas de rata en las que las CGR habían sido marcadas con FG aplicado en el MNO, se observó que el 99,05% de las CGR que expresan melanopsina se marcaban también con FG, por lo que estas neuronas proyectan sus axones a través del NO. Un 90,62% de las CGRm se encontraban marcadas con FG aplicado en los CS, por lo que estas células emiten proyecciones retinotectales. Tan sólo un 0,20% de las CGRm expresan Brn3a. La población total de CGRm fue de 2.046±48, lo cual supone un 2,62% de la población de CGR de rata adulta. Los mapas de vecinos revelaban una mayor densidad de CGRm en la periferia de la retina, y más concretamente en la región superotemporal. Esta distribución es complementaria a la distribución de la población de general CGR. En la retina de ratón, el Brn3a se expresa únicamente en las CGR y su expresión no se afecta por la SNO. En la retina de ratón pigmentado C57BL/6 y albino Swiss, el Brn3a se expresa en un 85,5% y 92,6% de las CGR-OHSt+, respectivamente. En ambas estirpes de ratones, los mapas de isodensidad revelan que la distribución de las CGR-Brn3a+ es muy similar a las CGR-OHSt+. En ambas cepas de ratón, la pérdida de CGR después de la SNO comienza a ser significativa con ambos marcadores a los 3 días después de la SNO y disminuye significativamente hasta los 9 días postlesión, momento en el que sobrevive un 15% de la población original Los mapas de isodensidad muestran que la muerte de CGR inducida por la SNO es difusa. En los grupos tratados con BDNF, la muerte se retrasa hasta los 5 días después de la SNO y la supervivencia de CGR es, a todos los tiempos post-lesión, significativamente mayor que al tratar con vehículo. Los mapas de isodensidad muestran que el BDNF retrasa la muerte de las CGR por toda la retina, no únicamente en la zona de la inyección. Conforme aumenta el tiempo después de la SNO, aumenta el número de células de microglía fagocítica, tanto en los grupos tratados con BDNF como en los tratados con vehículo, pero el número es menor en las retinas tratadas con BDNF. Los mapas de vecinos revelan que las células de microglía fagocítica aparecen a los 3 días de manera homogénea por toda la retina y que, conforme aumenta el tiempo post-SNO, aumenta el número de células microgliales que se distribuyen con un gradiente de densidad decreciente del centro a la periferia de la retina. Finalmente, en las retinas contralaterales a la SNO, se observa un aumento significativo del número de células de microglía fagocítica en comparación con las retinas control, aumento que es igual en los grupos tratados con BDNF o con vehículo. Estas células aparecen a los 3 días después de la SNO y su número y distribución se mantiene estable hasta los 14 días post-SNO. En cuanto a la población de CGR en estas retinas contralaterales a la SNO, el número de CGR es significativamente menor a los 21 días después de la SNO comparado con retinas control. SUMMARY Objectives To characterize the total numbers and spatial distribution of melanopsin retinal ganglion cells (mRGC) in the adult rat retina, in relation with the total population of retinal ganglion cells (RGC). To characterize whether Brn3a is a good marker for RGC in two mouse strains, an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) one. To analyze the temporal loss of RGC after optic nerve transaction (ONT), to assess the neuroprotective effect of BDNF in axotomized RGCs. To investigate the response of phagocytic microglial cells after ONT in the injured and contralateral to the lesion retinas. Material and methods Two months old albino Sprague-Dawley (SD) rats (n=16) were used to characterize the mRGC population. To investigate whether all retinal neurons immunodetected with melanopsin sent their axons through the optic nerve (ON), FG was applied in the ON stump. To assess the proportion of mRGC that project their axons to the superioir colliculi (SCi), the retinotectal area where 98.4% of the RGC project their axons in the rat, FG was applied onto both SCi. To assess whether mRGC express Brn3a and to quantify and compare the numbers and spatial distribution of both populations, Brn3a and melanopsin were double immunodetected in retinas from intact animals For the study in mouse, two months old mice were used (n= 158 pigmented C57BL/6 mice, and n= 34 albino Swiss mice). RGC were traced one week before ONT (at 0.5 mm from the optic disk), or euthanasia with hydroxystilbamidine methanesulfonate (OHSt, a FG analogue). To characterize Brn3a as a RGC marker and analyze the temporal loss of RGC after ONT, animals were sacrificed at increasing intervals post-ONT (2, 5, 7, 9, 14 or 21 days). As control, retinas from naive animals were used. Retinas were dissected as flat-mounts and immunodetected for Brn3a. In a second experimental group, the effect of an intravitreal injection of BDNF (2,5 µg) or vehicle (PBS) on RGC and phagocytic microglia was investigated. At increasing times post-surgery, ( 3, 5, 7, and 14 days) retinas were dissected as flatmounts, and Brn3a (RGC) and Iba1 (microglial cells) were double immunodetected. OHSt+RGC and Brn3a+RGC were quantified and the spatial distribution of Brn3a+RGC was assessed by isodensity maps. Phagocytic microglial cells transcellularly labelled with OHSt and Iba1+ were also quantified and their spatial distribution analyzed with neighbour maps. The same analyses were carried out in the contralateral to the lesion retinas. Results In rat retinas traced with FG from the ON, 99.05%, of the RGC that express melanopsin (mRGC) were traced. Thus, mRGC send their axons through the ON. When the tracer was applied to both SCi, 90.6% of the mRGC were traced, thus, most of the mRGC project to them. Finally, Brn3a and melanopsin were doubly immunodetected to assess whether ipRGCs express this transcription factor, and we found that only 0.20% of them were Brn3a+. In flat-mounted retinas, the total number of mRGC was 2,047±309, which amounts to a 2.6% of the total population of RGC. Neighbour maps disclosed that mRGC are placed preferentially in the retinal periphery and that their density is higher in the supero-temporal quadrant. This distribution is complementary to the general RGC population. In mouse retinas, Brn3a is only expressed by RGC and its expression does not change after ONT. In flat-mounted retinas of pigmented C57BL/6 and albino Swiss mice, Brn3a is expressed in 85.5% and 92.6% of the OHSt+RGC, respectively. In both mouse strains, isodensity maps reveal a similar distribution of Brn3a+RGC and OHSt+RGC. In mouse, RGC loss after ONT is first significant 3 days after ONT with both markers, OHSt and Brn3a. From 3 to 9 days post-ONT, the number of RGC decreases significantly. At 9 days, only 15% of the total population is still alive. Isodensity maps reveal that ONT induces a diffuse loss of RGC in the whole retina. In the experimental groups treated with BDNF, RGC death is delayed until 5 days after ONT, and the survival of RGC was higher than in the vehicle-treated groups at all time post-ONT. Isondensity maps showed that BDNF delays RGC death across the whole retina and not only in the localized area of the injection. In both experimental groups, phagocytic microglial cells appeared at 3 days after ONT and the number of these cells increased as the time post-lesion increased, although this response was significantly attenuated by BDNF administration. At 3 days, phagocytic microglial cells were distributed homogenously across the retina. As the time post-lesion increased, their density was higher in the centre than in the periphery of the retina. Finally, in the contralateral to the lesion retinas, there was a significant increase of phagocytic microglial cells compared to control retinas and this increease was the same in the BDNF and vehicle treated groups. These cells appear at 3 days post ONT and their number and distribution is stable up to 14 days post-ONT. Concerning the RGC population in the contralateral retinas, their number significantly decreased at 21 days after ONT, compared to control retinas.
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Caracterizacion en roedores adultos de la población de células ganglionares de retina melanopsínicas y estudio de la degeneración de las células ganglionares tras hipertensión ocular y neuroprotección
(2015-07-02) Valiente Soriano, Francisco Javier; Vidal Sanz, Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Avilés Trigueros, Marcelino; Facultad de Medicina
Objetivos • Caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto. • Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado. • Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta. Material y métodos Para la realización de los experimentos se utilizaron ratones machos pigmentados y albinos adultos y ratas hembras adultas albinas. Las manipulaciones de los animales se realizaron siguiendo la normativa europea (Directiva 2010/63/UE) y nacional (RD 53/2013) sobre la protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Para caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto, se inmunodetectaron secciones transversales de retina y retinas a plano con el anticuerpo contra la melanopsina, con el anticuerpo contra Brn3a y se contratiñeron los núcleos de todas las células de la retina con DAPI. Para estudiar la proyección de las CGRm, se aplicó en ambos CS o en el muñón del nervio óptico el trazador neuronal OHSt. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado, se caracterizó el modelo de HTO fotocoagulando con láser las venas perilimbares y epiesclerales del ratón. Para analizar el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y las CGRm, las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con OHSt, las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y melanopsina, y se analizaron a las 2 y 4 semanas. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta, se analizó el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y CGRm tras HTO en retinas tratadas con BDNF o vehículo. Las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con FG, y las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y se analizaron a 12 y 15 días tras la inducción de la HTO. Para el análisis estadístico, el test Kruskal-Wallis se utilizó cuando se compararon dos o más grupos y el test Mann-Whitney cuando se compararon dos grupos solamente. Las diferencias entre grupos se consideraron estadísticamente significativas para p<0.05. Resultados Los ratones pigmentados y albinos tienen un número similar de CGRm (1.021±109 CGRm pigmentado y 962±169 CGRm albino). En los ratones pigmentados las CGRm son más abundantes en la retina tempora y en los albinos están más localizadas en la retina superior. Ambos ratones también tienen CGRm desplazadas (CGRm-d) en la capa nuclear interna, que representan el 14% del total de CGRm en ratones pigmentados y el 5% en los albinos. El marcaje desde ambos CS muestra que el 98% (pigmentado) y el 97% (albino) de la población total de CGRm se marcan retrógradamente, mientras que el estudio de colocalización de melanopsina y Brn3a confirma que un porcentaje muy pequeño de CGRm expresa este factor de transcripción en ratones. En el estudio del marcaje retrógrado colocando OHSt en el muñón del nervio óptico demuestra que no todas las CGRm eran trazadas. Existía una subpoblación de CGRm-d (14% en pigmentados y 28% en albinos) y CGRm residentes en la zona ciliar marginal de la retina (20% en pigmentados y 24% en albinos) que no se trazaban desde el nervio óptico; por lo que estas células no envían el axón a través del nervio óptico y pueden ser consideradas interneuronas de la retina, quizá relacionadas con el reflejo pupilar intrínseco. En el estudio de la caracterización del modelo de hipertensión ocular en el ratón pigmentado observamos un aumento significativo de la presión intraocular desde las primeras 6 horas de la fotocoagulación láser hasta los 5 días. En ratón pigmentado, la HTO resulta en una pérdida difusa y/o sectorial de CGR trazadas con el trazador neuronal OHSt (CGR OHSt+) (50% a 2 semanas y 62% a 4 semanas). Sin embargo, a las 2 semanas aún se observa un 66% de CGR marcadas con Brn3a (CGR Brn3a+). Esto indica que sobreviven en la retina aproximadamente un 16% de CGR cuyo transporte axonal retrógrado está comprometido. Parte de estas CGR acaban muriendo y a las 4 semanas el número de CGR trazadas con OHSt e inmunodetectadas con Brn3a se iguala. La población de CGRm disminuyó aproximadamente al 59% a las 2 semanas y al 46% a las 4 semanas, valores similares a los de las CGR Brn3a+ para los mismos tiempos. La distribución topográfica de la pérdida de CGRm, aunque era mayor en la zona supero-temporal de retina, no era sectorial, sino difusa a lo largo de la retina y no se complementaba con la distribución de la pérdida del resto de CGR. En rata albina, la HTO resulta en una pérdida sectorial de las CGR FG+ (78 y 84% a los 12 y 15 días, respectivamente). El número de CGR Brn3a+ fue significativamente mayor para ambos tiempos de estudio, esto indica que una proporción considerable (≈21 - 26%) de CGR sobreviven en la retina con su transporte axonal retrógrado deteriorado. Las CGRm también presentaron una disminución significativa (50-51%) y esta pérdida, al igual que en ratón, fue difusa. La administración intravítrea de BDNF aumentó la supervivencia de las CGR Brn3a+ a 81 y 67% a los 12 y 15 días, respectivamente, pero no tuvo ningún efecto sobre las CGRm. D. Francisco Javier Valiente Soriano “Characterization in adult rodents of the melanopsin retinal ganglion cells population and study of the retinal ganglion cells degeneration after ocular hypertension and neuroprotection” SUMMARY Objetives • Characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse. • Study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse. • Study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat. Material and methods To perform the experiments we used adult pigmented mice, adult albino mice and female adult albino rats. Manipulations of animals were carried out according to the European (Directive 2010/63/UE) and National (RD 53/2013) regulations existing on the protection of animals used for experimentation and other scientific purposes. To study the characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse, cross sections of retina and whole mounts were immunoreacted with anti-melanopsin antibody, with anti-Brn3a antibody and stained with DAPI. To study the projection of the mRGC, the neuronal tracer OHSt was applied in both SC or in the optic nerve. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse, ocular hypertension model was performed by laser photocoagulation of the perilimbar and epiescleral veins of the experimental eye. To study the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death caused, the RGC were traced from the SC with OHSt and retinas were immunodetected with Brn3a and melanopsin and analyzed at 2 and 4 weeks. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat, we analyzed the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death after OHT in BDNF or vehicle-treated retinas, RGC were retrogradely traced from the SC with the retrogradely transported tracer fluorogold (FG), retinas were immunodetected with Brn3a and analyzed at 12 and 15 days after the induction of OHT. For statistical analysis, Kruskal–Wallis test was used when comparing more than two groups and Mann–Whitney when comparing two groups only. Differences were considered significant when p<0.05. Results Both pigmented and albino mice have a similar number of mRGC (1,021±109 mRGC in pigmented, 962±169 mRGC in albino). The mRGC are most abundant in the temporal retina in pigmented mice, and in dorsal retina in albino mice. Both mice also have displaced mRGC (d-mRGC) located in the inner nuclear layer representing 14% of the total population of mRGC in pigmented mice and 5% in albino mice. The 98% (pigmented) or 97% (albino) of the total population of mRGC were marked retrogradely from both SC, while the colocalization study of melanopsin and Brn3a confirms that a very small percentage of this transcription factor was expressed by mice mRGC. A surprising fact in the study of retrograde labeling with OHSt applied on the ON stump was that not all the mRGC were traced. A subpopulation of d-mRGC (14% in pigmented and 28% in albino) and mRGC located in the ciliary marginal zone of the retina (20% pigmented and 24% in albino) that were not traced from the optic nerve, that means that these cells do not send an axon into the optic nerve and can be considered an interneuron of the retina, perhaps related to the intrinsic pupil reflex. In the study of the characterization of ocular hypertension model in pigmented mouse, a significant increase of the intraocular pressure (IOP) was observed from 6 hours of laser photocoagulation up to 5 days. OHT results in a sectorial and/or diffuse loss of RGC traced with OHSt (OHSt+RGC) (50% at 2 weeks and 62% at 4 weeks). However, at 2 weeks, 66% of RGC, which were immunodetected with Brn3a (Brn3a+RGC) were still present. This indicates that at this time around 16% of RGC survive in the retina with their retrograde axonal transport committed. These RGC, however, died at 4 weeks and the number of traced OHSt+RGC and immunodetected Brn3a+RGC was equal. The mRGC population decreased to 59% at 2 weeks and to 46% at 4 weeks. These percentages of loss were similar to the Brn3a+RGC at the same time points. The loss of the mRGC was higher in the supero-temporal area of the retina. However, this loss was not sectorial, but was diffuse along the retina, and did not parallel the distribution of loss of the rest of RGC. In albino rat, OHT resulted in a sectorial loss of FG+RGC (78-84% at 12 and 15 days, respectively). The number of Brn3a+RGC was significantly higher in both times of study, which indicates that a significant proportion (≈21-26%) of RGC survive in the retina with their impaired retrograde axonal transport. The mRGC also presented a significant reduction of approximately 50-51%, and this loss, as in mice, was diffuse. The intravitreal administration of BDNF increased the Brn3a+RGC survival to 81% and 67% at 12 and 15 days, respectively, but had no effect on the mRGC. The study of the inner retinal vasculature did not show any abnormality that could explain the sectorial loss of RGC.
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Clinical validation of an adaptive optics visual simulator
(Universidad de Murcia, 2022-01-24) Hervella Ginestá, Lucía Ascoa; Artal Soriano, Pablo; Villegas Ruiz, Eloy Ángel; Escuela Internacional de Doctorado
Los simuladores visuales de óptica adaptativa se han utilizado ampliamente en los laboratorios de investigación para diversas aplicaciones, sin embargo, su uso en la práctica clínica ha sido hasta ahora limitado. Recientemente se ha introducido comercialmente, como producto sanitario, un simulador visual de óptica adaptativa (VAO, Voptica S.L) para su uso clínico. Este simulador visual realiza medidas objetivas de las aberraciones del ojo humano, así como también medidas de la refracción subjetiva y la simulación de diferentes perfiles ópticos, entre otras funciones. Generalmente, antes de que un nuevo instrumento se utilice en la práctica clínica, se debe realizar su validación, para comprobar el buen funcionamiento del nuevo producto sanitario. Cuando este se diseña y desarrolla, debe demostrarse a través de dicha validación clínica que se alcanzan los objetivos y seguridad previstos por el fabricante, así como que el uso y las aplicaciones del producto den los resultados esperados. Esta verificación, o validación, suele juzgarse en función de cómo las medidas son precisas (repetibles y reproducibles) y además que coincidan con las medidas tomadas con el producto estándar de referencia. Para poder así sustituir a otros instrumentos y métodos que se utilizan convencionalmente en la exploración y el diagnóstico visual por otros con una tecnología más avanzada. El simulador visual de óptica adaptativa, VAO, es un instrumento que en su conjunto es capaz de realizar medidas ópticas objetivas y medidas subjetivas. Incorpora un aberrómetro con un sensor del tipo Hartmann-Shack que mide el frente de onda del ojo, obteniendo así la refracción objetiva y las aberraciones de alto orden (HOA). Una pantalla de cristal líquido sobre silicio (LCoS), que actúa como un modulador espacial de luz, permite corregir o inducir cualquier perfil de fase óptica, pudiendo situar ópticamente los estímulos visuales a cualquier distancia requerida. De la misma manera, también tiene integrada una pantalla (OLED) para presentar estímulos visuales al paciente. El instrumento además permite realizar una refracción subjetiva y puede inducir y corregir diferentes cantidades de aberraciones de alto orden, así como diversos perfiles ópticos. Los principales objetivos de esta tesis son: 1. Evaluar la precisión (repetibilidad y reproducibilidad) y la concordancia entre examinadores de la refracción objetiva y las aberraciones de alto orden tomadas con VAO, para poder determinar el grado en que las mediciones repetidas en condiciones invariables y las mediciones repetidas realizadas por diferentes operadores muestran resultados similares. 2. Validar la refracción subjetiva y las agudezas visuales tomadas con VAO evaluando la concordancia entre los examinadores y comparando los resultados con el procedimiento estándar de referencia, para medir la precisión de VAO y la concordancia con dicho procedimiento. 3. Estudiar cómo cambia la profundidad de foco en función de la aberración esférica y si es diferente para cada persona. Para ello, se indujeron diferentes cantidades de aberración esférica negativa, y se realizó una curva de desenfoque para investigar el potencial beneficio de la personalización de la aberración esférica. El análisis de los resultados de los diferentes estudios realizados en esta tesis sugieren que VAO es capaz de proporcionar mediciones consistentes y fiables de los parámetros de la refracción objetiva al igual que de las aberraciones de alto orden y RMS entre las medidas realizadas por un mismo examinador y las realizadas entre dos examinadores diferentes. Los resultados obtenidos en la concordancia de la refracción subjetiva entre examinadores fueron valores similares o incluso mejores que la reproducibilidad de la refracción subjetiva con los métodos estándares (gafa de prueba y foróptero), los cuales indican una buena correlación entre ambos examinadores. En cuanto a la concordancia entre VAO y el método estándar de referencia (gafas de prueba) no hubo diferencias significativas en las mediciones de la refracción subjetiva y BCVA, habiendo una buena correlación entre ellos. Deduciendo así que los dos métodos comparados son análogos, pudiéndose estos intercambiarse, sin ningún perjuicio en la fiabilidad de las medidas. Además, estas medidas con VAO pueden utilizarse como referencia para la simulación visual de cualquier perfil óptico corneal o diseño de lente intraocular para pacientes de cirugía refractiva. Por último, la inducción de diferentes valores de aberración esférica negativa con VAO, aumentó la profundidad de foco de los sujetos. Sin embargo, el comportamiento fue diferente para cada uno (alta variabilidad entre sujetos). Con este estudio, se ha demostrado que VAO puede utilizarse para determinar el beneficio en la agudeza visual al inducir diferentes cantidades de aberración esférica y que este beneficio depende de cada sujeto. Con estos hallazgos arriba descritos, podemos concluir que VAO, un aberrómetro de frente de onda Hartman-Shack que mide objetivamente las aberraciones totales de bajo y alto orden del ojo y un instrumento capaz de realizar refracciones subjetivas e inducir cualquier patrón óptico o aberraciones mientras se realizan pruebas visuales, se ha validado con éxito.
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Conferencia: 'Investigación Aplicada en Oftalmología'
(2011-01-24) Urbina, Luis
Conferencia: 'Investigación Aplicada en Oftalmología', a cargo de José Carlos Pastor Jimeno, Universidad de Valladolid. Facultad de Óptica y Optometría. Campus de Espinardo.
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Desarrollo de sistemas de tiempo real mediante el uso de aceleradores gráficos y específicos aplicados a la óptica visual humana
(Universidad de Murcia, 2021-02-10) Mompeán Esteban, Juan; Aragón Alcaraz, Juan Luis; Artal Soriano, Pablo; Escuela Internacional de Doctorado
Esta Tesis viene motivada por la necesidad de procesar grandes cantidades de datos en un corto espacio de tiempo. El tipo de datos sobre los que se ha trabajado presenta, en la mayoría de los casos, una estructura uniforme y un procesamiento repetitivo, aunque no siempre es así. Por ello, la paralelización del procesamiento se ha realizado principalmente mediante procesadores gráficos (GPUs) que obtienen un muy buen rendimiento ante este tipo de algoritmos y, en algunos casos, con aceleradores específicos implementados en una FPGA. El trabajo realizado se ha centrado en la paralelización de algoritmos utilizados en diferentes aplicaciones de la óptica. Esta Tesis se divide en seis capítulos: introducción, seguimiento pupilar de alto rendimiento, gafas de corrección automática y en tiempo real de la presbicia, procesado de imágenes de Hartmann-Shack en tiempo real, paralelización del procesado de imágenes de OCT, y conclusiones y vías futuras. En cuanto al seguimiento pupilar se han implementado y paralelizado varios algoritmos con el fin de obtener una versión de alto rendimiento. Además, se ha caracterizado un conjunto de imágenes de pupilas con el que se ha llevado a cabo un análisis de la precisión y rendimiento de los diferentes algoritmos implementados. En la implementación GPGPU se han llevado a cabo numerosas optimizaciones para mejorar el rendimiento, consiguiéndose velocidades de procesamiento superiores a 1000 imágenes por segundo en algunas configuraciones. Partiendo de los avances conseguidos en el capítulo sobre seguimiento pupilar se han desarrollado las gafas de corrección automática y en tiempo real de la presbicia. Este dispositivo es completamente autónomo, siendo controlado únicamente a través de un teléfono móvil inteligente. Dicho teléfono es el encargado de procesar las imágenes de los ojos y, a partir de los datos obtenidos, calcular la corrección que se debe aplicar en las lentes optoelectrónicas. Todo el dispositivo se alimenta de la batería del teléfono móvil y de una pequeña batería externa utilizada para la iluminación infrarroja. Además, se ha llevado a cabo un experimento con 8 sujetos présbitas que han mejorado su agudeza visual en 0.3 de media en escala decimal sobre un test situado a 35cm de distancia. Por otra parte, se ha realizado una implementación en OpenCL optimizada para FPGAs con el propósito de explorar la idoneidad de estas plataformas para controlar este dispositivo. De forma que se ha medido tanto su consumo como su rendimiento, y se ha comparado con el obtenido por el teléfono inteligente. En el capítulo relativo a las imágenes de Hartmann-Shack se han paralelizado y optimizado tres algoritmos de procesado de éstas para su ejecución en procesadores gráficos. Además, se ha desarrollado, paralelizado y optimizado un novedoso algoritmo de seguimiento pupilar en imágenes de Hartmann-Shack. Asimismo, se ha caracterizado tanto su precisión como su rendimiento, mediante el uso de imágenes generadas mediante simulaciones. Se han obtenido resultados significativos tanto en precisión como en rendimiento. Si bien se han comparado una gran variedad de configuraciones y resoluciones, con algunas de las imágenes utilizadas se consiguen aceleraciones superiores a 100x entre la versión secuencial y la versión paralela GPGPU. Por último, se ha paralelizado y optimizado el procesado de imágenes obtenidas mediante un sistema OCT (Tomografía de Coherencia Óptica). Los sistemas OCT generan grandes cantidades de datos en cada medida, pudiendo alcanzar fácilmente los 2GB según el sistema de adquisición utilizado. Estos datos requieren un procesamiento muy intensivo en cómputo para obtener las imágenes finales. Es por ello que la paralelización de este procesamiento mediante el uso de procesadores gráficos ha arrojado resultados con aceleraciones que alcanzan hasta 8x.
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Diagnosis and Imaging of Corneal Astigmatism
(InTech, 2012) Tejedor, Jaime; Guirao, Antonio; Física
Se discuten los principios de funcionamiento y las limitaciones de los principales dispositivos utilizados para la evaluación de la refracción y el astigmatismo de la córnea. Se trata de un tema de enorme importancia, ya que se necesita una medida precisa del astigmatismo corneal para el diagnóstico y el correcto tratamiento de los defectos ópticos. Se muestra la variabilidad que existe en las mediciones de la potencia corneal utilizando diferentes instrumentos de queratometría, tanto manuales como automatizados. Y se muestra la variabilidad en medidas sucesivas hechas con el mismo aparato, que pueden interpretarse erróneamente con cambios refractivos o astigmáticos inducidos quirúrgicamente. Estos problemas pueden deberse a un error sistemático de los dispositivos y a diferentes metodologías subyacentes.
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Efecto a corto y largo plazo de diferentes períodos de isquemia transitoria en la supervivencia de las células ganglionares de la retina de rata adulta: estudio cuantitativo
(2012-12-21) Sellés Navarro, Inmaculada; Vidal Sanz, Manuel; Villegas Pérez, María Paz; Miralles de Imperial Mora-Figueroa, Jaime; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica
La retina es un tejido nervioso que parece tener una mayor tolerancia ante situaciones de hipoxia que el resto del sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, las consecuencias funcionales derivadas de la privación de flujo sanguíneo son graves y en la mayoría de los casos irreversibles. Se han realizado numerosas investigaciones con el fin de conocer las alteraciones morfológicas y funcionales de la retina ante situaciones de isquemia de diferente intensidad, sin embargo se carecen de … [+]estudios que caractericen específicamente el comportamiento de las células ganglionares de la retina (GCR) ante la isquemia utilizando métodos que nos permiten cuantificar la muerte de las (GCR). Queremos determinar su grado de tolerancia ante la isquemia, y estudiar el patrón de muerte de estas células tras someterlas a diferentes periodos de isquemia transitoria basándonos en técnicas neuroanatómicas. Hemos marcado las CGR con un trazador neuronal fluorescente, el fluoro-Gold, que aplicado en los principales núcleos de proyección de la vía óptica de la rata adulta nos ha permitido distinguir y diferenciar las CGR
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Efecto de la hipertensión ocular en la población de células ganglionares de la retina de rata y ratón
(Universidad de Murcia, 2011-09-19) Salinas Navarro, Manuel Ángel; Vidal Sanz, Manuel; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica
En esta tesis estudiamos la población total de las células ganglionares de la retina (CGR) en rata y ratón, y desarrollamos un modelo experimental de hipertensión ocular mediante fotocoagulación láser. La población de CGR proyecta masivamente a los colículos superiores. Se observa una estría visual en la retina dorsal donde se encuentra las densidades más altas de CGR. La pequeña población de CGR ipsilateral se distribuye mayoritariamente en la periferia de la retina temporal. El aumento de la presión intraocular induce una compresión de los axones en la cabeza del nervio óptico que provoca una alteración del transporte axonal retrógrado, que induce una degeneración sectorial localizada y difusa de las CGR, preferentemente en la retina dorsal, así como de sus axones. La pérdida selectiva de las CGR en la capa de CGR, sugiere que la causa de la muerte de las CGR no se debe a una isquemia retiniana. In this thesis we have studied the total population of retinal ganglion cells (RGCs) in rat and mouse, and developed an experimental model of ocular hypertension by laser photocoagulation. The RGC population projects massively to the superior colliculi. There is a visual streak in the dorsal retina where the highest densities of RGCs are found. The small population of ipsilateral RGCs is distributed mainly in the periphery of the temporal retina. The increase of intraocular pressure induces a compression of the axons at the optic nerve head that causes a disturbed retrograde axonal transport, inducing a localized, diffuse and sectorial degeneration of RGCs and their axons, preferably in the dorsal retina. The selective loss of RGCs in the RGC layer, suggests that the cause of the RGC loss is not due to retinal ischemia
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Efecto de las células madre sobre la función visual y retiniana en pacientes con retinosis pigmentaria
(Universidad de Murcia, 2024-09-30) García Navarro, Ana Vanesa; Juan Manuel Bueno García, Juan Manuel; Escuela Internacional de Doctorado
INTRODUCCIÓN: La Retinosis Pigmentaria o Retinitis Pigmentosa (RP) es la más frecuente de las enfermedades hereditarias de la retina. Actualmente no existe ni prevención como tal, ni tratamiento efectivo para esta patología ocular, lo que justifica la aplicación de acciones terapéuticas innovadoras, como es el caso de la terapia con células madre. Estudios en modelos animales han mostrado que las células madre mononucleadas derivadas de médula ósea (CMN-MOs) podrían ralentizar los efectos degenerativos de la RP. Los ensayos en humanos, aunque también prometedores, arrojan resultados diversos. OBJETIVOS: Evaluar la seguridad y viabilidad de la inyección intravítrea de CMN-MOs autólogas en pacientes con RP avanzada. Analizar e interpretar los cambios visuales y fisiológicos producidos en los pacientes durante el tiempo que dura en ensayo, para conocer si el tratamiento es capaz de frenar la progresión de la degeneración retiniana producida por dicha patología ocular. MATERIAL Y MÉTODOS: 8 pacientes con RP participaron en las medidas experimentales de este trabajo, basado en un ensayo clínico en fase I, aleatorizado, prospectivo, paralelo, doble ciego y controlado por placebo. El periodo de estudio fue de 1 año, a lo largo del cual se midió la evolución la agudeza visual (AV), la sensibilidad al contraste (SC) y la visión cromática. Se registraron imágenes de tomografía de coherencia óptica (OCT) para obtener los valores de espesor retiniano en las zonas foveal y parafoveal. Las medidas de microperimetría permitieron evaluar la sensibilidad retiniana y la fijación foveal. RESULTADOS: El procedimiento no dio lugar a incidencias graves ni no-graves lo que garantiza que es factible y seguro. Al final de periodo analizado, la AV tanto en lejos como en cerca se mantuvo estable en algunos pacientes y aumentó en otros. Por su parte, la SC mostró un ligero aumento (especialmente a frecuencias bajas), aunque los valores finales seguían estando en el rango considerado como patológico. Los pacientes que originariamente no presentaban anomalía a la visión del color permanecen como tal al terminar el periodo de estudio. Las imágenes OCT mostraron valores iniciales de espesores retinianos anormales que se mantuvieron básicamente constantes o se redujeron (en presencia de edema). La sensibilidad retiniana de los pacientes se situó en el rango de niveles patológicos, al igual que la integridad macular y la estabilidad de fijación. Mientras que la primera se mantuvo o aumentó durante el tratamiento, las últimas no mostraron tendencia alguna hacia la mejoría. CONCLUSIONES: Puesto que la inyección intravítrea de CMN-MOs en pacientes con RP no ha mostrado efectos adversos y ha conseguido mantener o mejorar moderadamente en el tiempo diferentes parámetros visuales y anatómicos analizados, se puede considerar que el tratamiento, al menos en esta fase I, es seguro, factible y con posibilidad de éxito.
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Efectos de la convergencia, el tamaño pupilar, la fenilefrina y la iluminación del objeto en la acomodación ocular
(2016-09-05) Lara Lacárcel, Francisco; López Gil, Norberto; Fernández Sánchez, Vicente Antonio; Facultad de Medicina
Objetivos. La acomodación en el ojo humano va acompañada de convergencia ocular y miosis pupilar. Ambas pueden afectar la calidad óptica y la iluminación de las imágenes retinianas, cambiando la máxima capacidad de acomodación del ojo: amplitud acomodativa (AA). Se presentan cuatro estudios en los que se analizan los efectos de esos dos parámetros en la AA. Metodología. En el primero se evaluó objetivamente la acomodación de 15 ojos con un aberrómetro Shack-Hartmann (SH), en cuatro demandas de convergencia monocular (0º, 5º, 10º, 15º). Se analizaron los cambios de AA, astigmatismo, aberraciones de tercer, cuarto y sexto orden. El segundo experimento consistió en evaluar en 15 ojos con SH la media de AA, tamaños de pupila relajada y contraída, desenfoque y Aberración Esférica (AE) de cuarto orden. Se hizo en condiciones de luz alta y baja lo que generó dos tamaños pupilares para todas las demandas acomodativas (DA). El tercero surgió de la necesidad de utilizar en nuestra investigación el fármaco fenilefrina. Existe controversia sobre si ésta tiene efecto en la AA. Para dilucidarlo, calculamos en 8 ojos la curva estímulo/respuesta obtenida a diferentes vergencias con SH. Lo hicimos en pupilas naturales antes y a los 30 minutos de instilar fenilefrina al 10%. En el segundo experimento encontramos diferencias de 1 D en la AA paraxial entre alta y baja iluminación. En el último experimento buscábamos saber cómo afecta a la acomodación un cambio de imagen retiniana en el que la iluminación de la imagen retiniana al acomodar fuera independiente del tamaño pupilar. Lo hicimos en cuatro diferentes iluminaciones, lo que permitió comprobar el efecto de las mismas en la AA subjetiva. Participaron 20 personas divididas en dos grupos: jóvenes y présbitas. Se evaluó la AA del ojo izquierdo antes y tras 40 minutos de instilar 2 gotas de fenilefrina, con un optómetro Badal y un foróptero con pupila artificial de 5mm. Resultados y Conclusiones. La AA objetiva cambia levemente con distintas convergencias monoculares. Este aumento es significativo en jóvenes en la convergencia de 5º, y en présbitas en convergencia de 15º. Las aberraciones oculares de alto orden no presentan diferencias en sus cambios al acomodar en distintas convergencias monoculares. El astigmatismo cambia ligeramente al acomodar: aumenta la potencia y el eje gira contra la regla, especialmente en jóvenes y en convergencia monocular de 15º. La AA objetiva depende del tamaño pupilar. Si se utiliza para evaluarla una medida de refracción que incluya la AE, el cambio de tamaño pupilar variará la AE y la medida de AA. Si el tamaño pupilar aumenta al disminuir la luz, la AA objetiva puede reducirse más de 1 D, aunque la luminancia de la imagen foveal del estímulo acomodativo sea constante. La fenilefrina no parece afectar, o afecta poco, la RA. Su efecto se debe al cambio de la formación de imágenes en la retina por la midriasis pupilar y por tanto de las aberraciones de alto orden. Hemos encontrado un aumento significativo de AA subjetiva obtenido con un mismo tamaño pupilar cuando la iluminación retiniana aumenta, atribuible al cambio de contraste percibido en esas diferentes iluminaciones y que sería la señal que activaría el músculo ciliar. Este aumento es en jóvenes (2 D) y présbitas (0,6 D) y su origen es sensorial. Un control de las condiciones de luz ambiental debería ser un factor importante en la clínica optométrica. Purpose. Accommodation of the human eye is accompanied by binocular convergence and pupil myosis, both of which may affect optical quality and retinal luminance. This, in turn, changes the maximum capacity of accommodation of the eye or accommodative amplitude (AA). Four studies are presented where the effects are studied of convergence and myosis on AA. Methods. In the first experiment, objective accommodation was evaluated on 15 eyes with a Shack-Hartmann aberrometer on four demands of monocular convergence at 0º, 5º, 10º, 15º. Changes in AA, astigmatism, and third-, fourth-, and sixth-order aberrations were analyzed. The second experiment consisted on evaluating in 15 eyes the average AA, pupil size when relaxed and contracted, defocus and fourth-order spherical aberration (SA). These evaluations were made on high and low luminance conditions, which generated 2 pupil sizes for all accommodative demands. In the third experiment the effects of phenylephrine, used on the previous studies, was studied and there is controversy on whether it affects accommodation. To answer this question, the accommodative demand/response curves were obtained objectively before and 30 minutes after instillation of phenylephrine. The results of the second experiment, that there are differences of about 1 D in AA high and low luminance conditions, lead to the fourth and last experiment. In paraxial optics, high-order aberrations and depth-of-field do not affect calculated accommodation. The last experiment, the effect of retinal luminance on accommodation ensuring that pupil size remained constant over accommodative response and illumination conditions. Four illumination conditions were considered and subjective AA recorded. Twenty subjects, divided in two groups, young and presbyopic, participated in the experiment. Subjective AA was measured in the left eye before and 40 minutes after instillation of 2 drops of phenylephrine with a Badal optometer and a phoropter with an artificial pupil of 5 mm of diameter. Results and Conclusions. Monocular objective AA changes slightly with eye convergence. A statistical significance increase in young subjects was obtained at convergences of 5º and in presbyopic subjects at 15º. High-order ocular aberrations did not present differences following changes in accommodation at different convergences. Astigmatism did change slightly with accommodation: power increased and axis rotated against the rule, specially in young subjects and convergence of 15º. Objective AA depended on pupil size. If SA is included in the calculation of objective accommodation, and because it changes with pupil size, such calculated accommodation would vary with pupil size. If pupil size increases as light dims, objective AA can be reduced up to 1 D, even if retinal luminance remained constant. Phenylephrine did not seem to affect the eye’s ability to accommodate. Its effect on accommodative response is an indirect result of mydriasis, which increases high-order aberrations and retinal luminance. A statistically significant increase in subjective AA was obtained when pupil size was set to be constant and retinal luminance increased. This increase was attributed to an increase in retinal contrast as room illumination was increased. Increased contrast may be the signal that activates the ciliary muscle. The increase in subjective AA was observed in young subjects (by about 2 D) and in presbyopic subjects (by about 0.6 D) and its origin is sensorial. Control of room lighting conditions should be an important factor to be considered in optometric clinic.
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Estudio clínico de la queratoconjuntivitis seca canina : diseño y validación de un sistema de gradación y respuesta al tratamiento con células madre mesenquimales
(Universidad de Murcia, 2021-03-10) Giménez Mainer, Eva; Bayón del Río, Alejandro Ángel; Talavera López, Jesús; Escuela Internacional de Doctorado
La queratoconjuntivitis seca es una patología que se observa en el día a día de la clínica de medicina veterinaria, suponiendo un malestar para el animal en el caso de encontrarse en los estadios moderados, graves y severos de la enfermedad; y también para el dueño ya que requiere de un tratamiento diario de por vida. La frecuencia de administración del tratamiento convencional puede llegar a ser un inconveniente en este tipo de enfermedades debido a su alta frecuencia en gotas, por lo que el uso de nuevas terapias abre un horizonte en la posibilidad de actuar como tratamientos adyuvantes. En este estudio se propuso la infusión de células madre mesenquimales en la glándula orbital y de la membrana nictitante y comparar los resultados con la terapia médica convencional. Previo a ello se creo una escala clínica con 8 variables que se correspondían con los diferentes signos clínicos de la enfermedad. Dichas variables fueron el Test de Schirmer I, descarga ocular, hiperemia conjuntival, edema, pigmento y vascularización corneal, test colorimétrico y valoración de la cámara anterior. Dicha escala permitió un seguimiento y evolución de los pacientes a lo largo del tiempo y clasificarlos en diferentes estadios según su gravedad. Para poder utilizar la escala se seleccionó una población con queratoconjuntivitis seca y se testó la fiabilidad y concordancia de ella mediante tres observadores con diferente formación y experiencia clínica. Los observadores mostraron una fiabilidad y concordancia óptima de la escala, lo que permitió extrapolarla al estudio médico posterior. El posterior estudio terapéutico tuvo una duración de un año para cada paciente, con controles de seguimiento a los 45 días, 3, 6 , 9 y 12 meses, tanto para la terapia médica y celular. Los lipoexplantes se obtuvieron de grasa subcutánea de donantes sanos que fueron sometidos a cirugías electivas. Alcanzado el pase de cultivo deseado, las células fueron criopreservadas hasta su utilización. La infusión de células madre mesenquimales de origen adiposo solo se realizó una vez, y para ello se procedió a la sedación y mantenimiento con mascarilla de los pacientes y posterior administración de la terapia a nivel de la glándula orbital y de la membrana nictitante de ambos ojos. En estos pacientes se redujo el tratamiento tópico a la mitad, mientras que en el grupo médico se dejo la pauta convencional durante todo el periodo del estudio. El grupo terapia celular estuvo compuesto por 10 perros y el de terapia médica por 28. En el caso del grupo que recibió la infusión celular no se encontraron diferencias que afectaran según su conformación, sexo y ojo; mientras que en el otro si que las hubo según la conformación craneal. La respuesta a ambos tratamientos fue positiva con la mejoría de los signos clínicos, observándose con la terapia celular una reducción del 44% en la puntuación total a los 3 meses en comparación con un 24% con la terapia médica convencional. Dicha mejoría dio lugar a una estabilidad que se mantuvo hasta los 6 meses, sin realizar modificaciones en el tratamiento tópico, para luego ir empeorando hasta finalizar el estudio. El empeoramiento de los signos clínicos fue evidente a los 9 meses con un aumento en la puntuación de los signos clínicos de un 20% con respecto al control número dos; y sin hallar ya diferencias entre ambas terapias. Por lo que en base a los resultados obtenidos, el tratamiento adyuvante con células madre permite una reducción de la pauta en gotas y una mejoría en los signos clínicos, pero con un punto de inflexión a los 6 meses en el cual se recomendaría volver a inyectar la terapia celular.
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Estudio cuantitativo de la supervivencia de las células ganglionares de la retina de rata adulta tras la sección del nervio óptico y la administración de las neurotrafinas BDNF, NT-3 y NT-4 / Paloma Peinado Ramón ; director Manuel Vidal Sanz.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Medicina,, 1995) Peinado Ramón, Paloma