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    Estudio de la actividad neuronal de la corteza auditiva en un modelo animal de enfermedad mental con displasia cortical
    (Universidad de Murcia, 2018-02-13) Robles Martínez, Ricardo; Martínez Pérez, Salvador; Facultad de Medicina
    INTRODUCCIÓN.- La etiopatogenia de la esquizofrenia es desconocida, siendo en la actualidad la hipótesis más aceptada, las alteraciones del neurodesarrollo. Diversos estudios demuestran que las alteraciones morfopatológicas de la corteza frontal y temporal en pacientes esquizofrénicos serían compatibles con anomalías en los procesos de migración neuronal. La proteína LIS1 desempeña una función importante en la migración neuronal durante la formación de la corteza cerebral, así como el fosfolípido factor activador de plaquetas (PAF), por lo que es posible que LIS1 y el gen que codifica el receptor de PAF (PAFR), estén alterados de alguna manera en pacientes psicóticos. HIPÓTESIS.- La disminución significativa de interneuronas en las capas superficiales de la corteza cerebral y de la corteza auditiva primaria (A1), causarían un incremento de la actividad neuronal en el ratón mutante (Lis1/sLis1) comparado con ratones Wild Type (WT), en condiciones basales. El estudio del área auditiva del cerebro humano con lisencefalia mostraría el mismo déficit de neuronas inhibitorias en las capas superficiales de la corteza, lo que nos permitiría especular con la posibilidad de una mayor actividad cortical basal y proponer esta anomalía en la migración neuronal como la base estructural de las alucinaciones auditivas en la esquizofrenia. OBJETIVOS.- Describir las alteraciones estructurales de la corteza auditiva y estudiar la actividad basal de la corteza auditiva de los ratones mutantes Lis1/sLis1. Describir las alteraciones estructurales de la corteza temporal en el cerebro de un paciente diagnosticado de lisencefalia tipo I. Desarrollar una hipótesis fisiopatológica para explicar las anomalías estructurales que puedan estar implicadas en las alucinaciones auditivas en la esquizofrenia. MATERIAL Y MÉTODOS.- Estudiamos las cortezas auditivas de estos ratones en condiciones de ruido ambiente normal y evaluamos la activación de las neuronas corticales en estado de no excitación específica. Analizaremos mediante la expresión de genes de respuesta rápida (c-fos) la actividad neuronal. Para ello, utilizaremos los siguientes grupos: a.) Ratones grupo control: 10 ratones WT. b.) Ratones experimentales: 10 ratones mutantes Lis1/sLis1. Diseño experimental: - Estudio morfológico de la corteza auditiva de mutantes heterocigóticos mediante inmunohistoquímica y tinciones citoarquitectónicas. - Determinación de la expresión de c-fos como marcador de la actividad neuronal en la corteza auditiva, en condiciones normales. En ratones WT y ratones Lis1/sLis1 en las mismas condiciones de ruido ambiental. Para la cuantificación se usó el programa Image J y el análisis estadístico se realizó con el programa Sigmaplot v11.0. Se realizaron comparaciones pareadas de las medias de los contajes de células positivas para c-fos, entre el mutante Lis1/sLis1 y WT. Los datos fueron comparados como media más el error standard utilizando el test t de Student. - Estudio morfológico de la corteza auditiva de un cerebro humano diagnosticado de lisencefalia. RESULTADOS Y CONCLUSIONES.- En ratones WT se observa como en la corteza A1 hay escaso número de células con expresión intensa de c-fos, principalmente en capa II y V. En el ratón mutante Lis1/sLis1 se aprecia un gran aumento de neuronas intensamente c-fos positivas en las capas II, IV y V (P˂0.05). La corteza auditiva del ratón mutante Lis1/sLis1, presenta una alteración de la migración de las interneuronas GABAérgicas en la corteza A1. Presenta, además, una actividad aumentada de las neuronas de la corteza A1 en condiciones basales de ruido ambiental. La corteza temporal de un cerebro humano con lisencefalia tipo I presenta una alteración de la migración de las neuronas GABAérgicas de las capas superficiales. Las similitudes observadas en nuestro estudio entre la corteza A1 del ratón Lis1/sLis1 y la corteza temporal del humano con lisencefalia, podría ofrecernos un modelo para el estudio de las causas neurobiológicas subyacentes a las alucinaciones auditivas. INTRODUCTION.- The etiopathogenesis of schizophrenia is unknown, but currently the most accepted hypothesis it is related with the neuronal development disorders. Several studies report that morpho-pathological alterations of the frontal and temporal cortex in schizophrenic patients would be compatible with anomalies in the neuronal migration processes. LIS1 protein and phospholipid platelet activating factor (PAF) play an important role in neuronal migration during the cerebral cortex development, so it is possible that both could be altered in some way in psychotic patients. HYPOTHESIS.- Under basal conditions, the significant decrease of interneurones in the superficial layers of the cerebral cortex and the primary auditory cortex (A1) could increase neuronal activity in mutant mouse (Lis1/sLis1) compare to Wild Type (WT) mouse. The study of the auditory area of the human brain with lysencephaly would show the same deficiency of inhibitory neurons in the superficial layers of the cortex, which would allow us to speculate with the possibility of this anomaly in the neuronal migration as the base of auditory hallucinations in schizophrenia. OBJECTIVES.- To describe the structural alterations of the auditory cortex and to study the basal activity of the auditory cortex of the Lis1/sLis1 mutant mice. To describe the structural alterations of the temporal cortex in the brain of a patient diagnosed with lysencephaly type I. To develop a physiopathological hypothesis to explain the structural abnormalities may be involved in auditory hallucinations in schizophrenia. MATERIAL AND METHODS.- We study the auditory cortex of these mice under normal ambient noise conditions and evaluated the activation of cortical neurons in a non-specific excitation state. We analyze gene expression by rapid response (c-fos) neuronal activity. To do this, we will use the following groups: A.) Control group mice: 10 WT mice. B.) Experimental mice: 10 Lis1 / sLis1 mutant mice. Experimental design: - Morphological study of the auditory cortex of heterozygous mutants by immunohistochemistry and cytoarchitectural stains. - Determination of c-fos expression as a marker of neuronal activity in the auditory cortex under normal conditions. In WT and Lis1/sLis1 mice under the same ambient noise conditions. For the quantification, the Image J program was used and the statistical analysis was performed with the Sigmaplot v11.0 program. Paired comparisons of mean counts of c-fos positive cells between the mutant Lis1 / sLis1 and WT were performed. Data were compared as mean plus standard error using Student's t-test. - Morphological study of the auditory cortex of a human brain diagnosed with lysencephaly. RESULTS AND CONCLUSIONS.- In WT mice, A1 cortex show a less number of cells with intense expression of c-fos, mainly in layer II and V. In the mutant mouse Lis1 / sLis1, a large increase of intensely c-fos positive neurons is observed in Layers II, IV and V (P0.05). The auditory cortex of the mutant mouse Lis1 / sLis1 presents an alteration of the migration of the GABAergic interneurons in the cortex A1. Futhermore has an increased activity of A1 cortex neurons under basal ambient noise conditions. The temporal cortex of a human brain with lysencephaly type I presents an alteration of the migration of the GABAergic neurons of the superficial layers. The similarities observed in our study between the A1 cortex of the Lis1 / sLis1 mouse and the temporal cortex of the human with lisencephaly could provide us a model for the study of neurobiological causes related with auditory hallucinations
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    Estudio de migración de neuronas Pax6+ en el tálamo del pollo y del ratón
    (2015-07-02) Domenech Hita, Jose Manuel; Puelles López, Luis; Departamento de Anatomía Humana y Psicobiología
    OBJETIVO GENERAL El objetivo general de esta tesis es la caracterización de la migración protagonizada por un conjunto de neuronas Pax6+ en el tálamo del pollo y del ratón y su análisis comparativo. MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizaron embriones de pollo (HH28 – HH38) para analizar mediante técnicas de inmunohistoquímica y de hibridación in situ con sondas de mRNA del gen Pax6 en secciones de vibratomo. También se llevaron a cabo marcajes mediante BDA y posterior cultivo organotípico. Las preparaciones fueron escaneadas y analizadas. Las imágenes de secciones de cerebros de ratón procesadas mediante hibridación in situ para el gen Pax6 de estadios embrionarios y postnatales fueron obtenidas del atlas de desarrollo del ratón (Allen Brain Atlas). RESULTADOS Y CONCLUSIONES Las observaciones obtenidas confirman la existencia de una migración neuronal tardía que se origina en la región retrohabenular, en el techo posterior del prosómero 2. Las células migratorias Pax6+ comienzan a visualizarse claramente en la región retrohabenular en el estadio HH31, terminando la migración aparentemente en HH37. Se desplazan desde su origen laterorrostralmente en la zona fronteriza entre la región habenular y el tálamo propiamente dicho. En el caso del pollo, este avance es más marcado y alcanza, a través del núcleo superficial microcelular, regiones cercanas a la frontera intertalámica, incorporándose escasas células de esta migración a la región habenular lateral. En ratón, en cambio, la migración penetra más importantemente en la región habenular lateral donde acaba integrándose en el subnúcleo parvocelular de la división lateral del núcleo habenular lateral y a penas se observan otras células fuera de esa zona habenular. En el pollo se observa un segundo origen celular Pax6+ a continuación del área retrohabenular, ya en la zona pretectal precomisural. Desde este origen existe una pequeña migración que alcanza aparentemente las inmediaciones del núcleo parvocelular de la comisura posterior. El resultado de los marcajes con BDA in vitro en el estadio HH31, de producción inicial de estas células, corroboró la existencia de un movimiento migratorio desde este origen en la región retrohabenular hacia la zona de destino descrita mediante hibridación in situ de Pax6, tanto en el caso de la migración talámica como la pretectal. Desde el punto de vista de la anatomía comparada, se concluye que los fenómenos retrohabenulares migratorios observados en el pollo y en el ratón coinciden en su cronología embriológica, ya que aparecen en estadios comparables y en ambos casos figura como diana la región habenular lateral. Si bien en el pollo aparecen células que parecen invadir zonas no habenulares cercanas cabe preguntarse si no cabría incluir dichas regiones en la zona habenular. En el caso del ratón las células migradas componen una subpoblación menor del área habenular lateral que forma el subnúcleo parvocelular de la división lateral del núcleo habenular lateral. STUDY OF THE MIGRATION OF PAX6+ NEURONS IN THE CHICK AND MOUSE THALAMUS GENERAL AIM The overall objective of this thesis is to characterize the migration of a population of Pax6+ neurons in the chick and mouse thalamus and its comparative analysis. METHODS Chick embryos (HH28 – HH38) were used to analyze by immunohistochemistry and in situ hybridization with Pax6 mRNA probes in vibratome sections. Labelling with BDA were also carried out and subsequent organotypic culture. The preparations were scanned and analyzed. The images of mouse brain sections processed by in situ hybridization for the Pax6 gene in embryonic and postnatal stages were obtained from the atlas of mouse development (Allen Brain Atlas). RESULTS AND CONCLUSIONS The observations confirm the existence of a late neuronal migration originated in the retrohabenular region, in the posterior roof of prosomere 2. Migratory Pax6+ cells become clearly visible in the retrohabenular region at HH31, finishing the migration apparently at HH37. They progress from their origin latero-rostrally through the habenular-thalamic border. This advance is more pronounced in the chick, reaching through the superficial microcellular nucleus regions near the intrathalamic border, joining few of these migrating cells the lateral habenular region. In contrast, the migration in mouse penetrates mainly in the lateral habenular region where it integrates the parvocellular subnucleus of the lateral division of the lateral habenular nucleus and scarce cells are found out of the habenular region. A second Pax6+ cellular origin is found in chick, adjacent to the retrohabenular area, in the precommisural pretectal region. From this origin a small migration takes place apparently to the surroundings of the parvocellular nucleus of the posterior commisure. The results of the in vitro BDA labelling at HH31, initial production stage of these cells, confirmed the existence of a migratory movement from this origin in the retrohabenular region to the target area described by Pax6 in situ hybridization, for both thalamic and pretectal migrations. From a comparative anatomical point of view, the retrohabenular migratory phenomena observed in chick and mouse concur in their embryological chronology, since they appear at comparable stages and the target is the lateral habenular region in both cases. While in chick there appear cells invading nearby non habenular regions, one might wonder whether these regions should be included in the habenular zone. In the case of mouse, the migrated cells shape a minor subpopulation of the lateral habenular area that forms the parvocellular part of the lateral division of the lateral habenular nucleus.