Browsing by Subject "Neurobiología"

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    Bases moleculares de la interacción, de proteínas de transporte vesicular
    (Universidad de Murcia, 2022-05-31) López Martínez, David; Corbalán García, Senena; Escuela Internacional de Doctorado
    Las vesículas intracelulares se transportan de un orgánulo a otro en respuesta a distintos estímulos. La dirección y eficacia de la entrega de vesículas hasta su membrana de destino están mediadas por la señalización celular, llevada a cabo por numerosas proteínas y segundos mensajeros. Rabfilina3A (Rph3A) es una proteína del tráfico de membranas, sensible a dos segundos mensajeros, calcio (Ca2+) y fosfatidil inositol 4,5-bisfosfato (PIP2). PKCε es una proteína quinasa implicada en rutas de señalización que actúa fosforilando a otras proteínas, y responde a distintos lípidos como diacilglicerol (DAG) y ácido fosfatídico (PA). Nuestro grupo de investigación en colaboración con el Instituto de Biología Molecular de Barcelona, han resuelto las estructuras 3D de los dominios C2 de Rabfilina3A unidos a Ca2+ y PIP2, y también del dominio C2B unido a SNAP25. Además, se determinó previamente que PKCε responde a PA. Por tanto, uno de los objetivos de esta tesis doctoral fue caracterizar la función de Rabfilina3A y descubrir nuevas proteínas moduladoras de su función. El segundo objetivo fue investigar el papel que podría tener el PA sobre PKCε en la secreción de vesículas de los mastocitos. Para lograr estos objetivos, se utilizaron técnicas de biología molecular para clonar y mutar genes. Se usaron dos líneas celulares como modelos vivos: la línea celular PC12 como modelo adrenal, también diferenciada con factor de crecimiento neuronal (NGF) a un modelo neuronal, y la línea celular RBL-2H3 como modelo de mastocitos. Se empleó el ensayo de ligación por proximidad (PLA) con microscopía confocal para estudiar la localización e interacciones proteína-proteína. Además, se utilizaron técnicas "ómicas" para la identificación masiva de proteínas cercanas a Rabfilina3A, acoplando la técnica de marcaje por proximidad dependiente de biotina (BioID2) con espectrometría de masas. Los resultados obtenidos muestran que el dominio C2B de Rabfilina3A presenta una fuerte región electropositiva, en la zona de interacción con SNAP25 que no está conservada en Sinaptotagmina1. Rabfilina3A parece interaccionar con VAMP2, Sinaptotagmina1 y SNAP25 en las vesículas de transporte, pero sólo con SNAP25 y Sinaptotagmina1 en la membrana plasmática. La zona de interacción de SNAP25 con Rabfilina3A, y la interacción de Rabfilina3A con PIP2 parecen ser claves para la correcta localización de SNAP25 en la membrana plasmática. Además, la sobreexpresión de Rabfilina3A en un fenotipo neuronal promueve la localización de SNAP25 en la membrana plasmática. Se caracterizó el interactoma circundante a Rabfilina3A y se descubrió que Rabfilina3A interacciona con STIM1, y Tcp11l1. STIM1 es una proteína del retículo endoplasmático (RE) encargada de detectar y ayudar a restaurar los valores de Ca2+ en el RE. Tcp11l1 es una proteína de función desconocida. El interactoma realizado de Tcp11l1 muestra que es una proteína que interacciona con proteínas del citoesqueleto como tubulina y β-actina. En consecuencia, en relación con el primer objetivo de este tesis, se propone un modelo en el que Rabfilina3A contribuye al transporte de vesículas y de SNAP25 a la membrana plasmática gracias a la interacción con Tcp11l1, posteriormente Rabfilina3A vuelve a su situación de partida gracias a STIM1. Los resultados del segundo objetivo sugieren que el borde del bolsillo de unión a DAG del dominio C1B de PKCε es fuertemente electropositivo permitiendo su unión a PA. La activación de PKCε por PA junto con el Ca2+ desencadena un incremento de la fusión de vesículas en mastocitos. Este hallazgo se correlaciona con el aumento de la fosforilación de SNAP23 en respuesta a la interacción de PKCε con PA. Por tanto, se sugiere un modelo en el que PKCε es activada por PA y fosforila a SNAP23 facilitando la fusión de vesículas.
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    Development of essential bases to study the neural mechanisms of forced exercise and its effects on health in a rat model
    (Universidad de Murcia, 2023-10-11) Garrigós García, Daniel; Ferrán Bertone, José Luis; Escuela Internacional de Doctorado
    El ejercicio físico se ha relacionado con efectos beneficiosos para la salud cerebral desde los tiempos de Herófilo, hace más de 2000 años. Sin embargo, los mecanismos por los que actúan estos beneficios siguen siendo poco conocidos. El modelo roedor es adecuado para estudiar los aspectos mecanísticos que implican la respuesta del cerebro a los aspectos motores de la actividad física, pero también las consecuencias mecanísticas que el ejercicio produce en el organismo (positivas y negativas). Además, comparten un plan general de desarrollo del sistema nervioso central, determinando que algunos derivados cerebrales básicos y sus funciones se conserven entre ellos. Por este motivo, la presente tesis pretende desarrollar las bases esenciales para estudiar los mecanismos neurales del ejercicio forzado y sus efectos sobre la salud en un modelo de rata. Para ello, el primer objetivo (Estudio 1) fue determinar si los protocolos de carrera en rueda forzada de los estudios publicados incluyen las variables necesarias para reproducir experimentalmente la investigación. Encontramos que sólo el 13% de los protocolos de ejercicio eran totalmente reproducibles, y ningún artículo informaba de los 21 ítems completos, siendo 18 ítems el máximo (2 trabajos). La inversión del ciclo de luz (25,9%) fue la variable menos descrita junto con la humedad ambiental relativa (27,8%). En cuanto a los parámetros del ejercicio, la variable menos descrita fue la relacionada con el protocolo de progresión de la carga (49%) y la fase del periodo de luz/oscuridad en la que tuvo lugar el ejercicio (55,5%). Tampoco hubo correlación entre el año de publicación y los ítems reportados ni entre el factor de impacto y los ítems reportados. Dada esta falta de reproducibilidad, desarrollamos una nueva guía con las recomendaciones de los ítems a reportar en un artículo reproducible experimentalmente. El segundo objetivo (Estudio 2) fue determinar la posición topológica de las neuronas TH-positivas en la región hipotalámica según el modelo prosomérico en la rata Sprague Dawley adolescente. Nuestro análisis reveló que la clasificación alfanumérica es topográficamente imprecisa en varios aspectos y por lo tanto tiene una utilidad limitada, particularmente para la comprensión causal. Asimismo, el mapa de áreas prosoméricas es en general más discriminativo que el columnar, permitiendo postular aspectos mecanicistas causales relacionados con el origen de cada población catecolaminérgica. Finalmente, nuestro tercer objetivo (Estudio 3) fue determinar las condiciones para el desarrollo de un paradigma de ejercicio forzado para mantener la capacidad de ejercicio a través del tiempo en ratas adolescentes y adultas. Descubrimos que un protocolo de carga incremental provocaba la respuesta locomotora máxima en ratas adolescentes y adultas. Sin embargo, las ratas adolescentes fueron las únicas que se beneficiaron de un entorno enriquecido mientras intentaban obtener la máxima respuesta locomotora. Descansar durante 24h entre test disminuyó el rendimiento locomotor en el segundo test en adolescentes y adultos. Separar los test 72h también disminuyó el rendimiento en el segundo test en adolescentes y adultos. Sin embargo, la realización de sesiones de carrera entre pruebas separadas por 72h amortiguó la caída del rendimiento en adolescentes y aumentó el rendimiento locomotor en adultos. El descanso activo rescató el rendimiento deteriorado por las drogas, alcanzando el de los test anteriores en adolescentes y adultos. En conjunto, estos resultados establecen bases esenciales que permitirán en futuros estudios la manipulación de las vías hipotalámicas mediante técnicas como la optogenética o la quimiogenética para establecer relaciones causales entre los núcleos hipotalámicos y el ejercicio físico, analizando las diferencias en etapas críticas de maduración cerebral como la transición de la adolescencia a la edad adulta.
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    Estudio de la migración tangencial intrahipotalámica del núcleo ventral premamilar y posibles mecanismos causales
    (Universidad de Murcia, 2021-09-07) López González, Andrea Lara; Puelles López, Luis; Escuela Internacional de Doctorado
    El núcleo ventral premamilar hipotalámico (VPM) es una estructura descrita en mamíferos, que integra las señales olfativas y energéticas con el comportamiento reproductivo, y está involucrado en el desarrollo de la pubertad, así como en comportamientos de lucha o huida. Aunque hay información disponible acerca de su función y conectividad, no se conoce cómo se forma durante el desarrollo embrionario. El presente estudio aporta evidencia descriptiva y experimental sobre el proceso migratorio de sus componentes celulares durante los días E12.5 y E13.5 en ratón. Estas células se originan en la mitad dorsal del área retromamilar (RM), y desde este territorio comienzan su migración tangencial, esquivando los cuerpos mamilares y cruzando un territorio molecularmente distinto, la banda perimamilar (PM), hasta alcanzar una posición tuberal relativamente rostroventral. Corroborando estudios transcriptómicos recientes en los que se identifican diversos tipos neuronales glutamatérgicos en el VPM, en el presente estudio se detectó que parte de esta heterogeneidad emerge de manera temprana en el desarrollo. Durante la migración tangencial, se detectaron 2-3 poblaciones, con diferencias en la expresión de determinados genes, posiblemente derivadas de zonas ligeramente distintas en el área RM. Estas poblaciones se distribuyen de manera segregada entre el core y el shell del VPM Se analizaron proteínas de señalización cuya expresión sugiriese un papel en el desarrollo del VPM. Aunque se detectó expresión de la pareja Netrina1/DCC, así como del ligando ephrin-B2 en la migración del VPM y/o en zonas adyacentes, no se observaron alteraciones en el núcleo en ratones deficientes en estas proteínas. Además, el área acroterminal es fuente del morfógeno Fgf8 y existe expresión de su receptor Fgfr2 en el hipotálamo basal. Se evaluó la posible influencia de Fgf8 en el desarrollo del VPM, mediante el análisis de ratones hipomorfos (Fgf8neo/null). Estos resultados revelaron un rol trófico de Fgf8 en el área RM y las células que migran tangencialmente a partir de este territorio (VPM y el núcleo subtalámico). Los hipomorfos presentan una celularidad reducida y cierta desorganización en las estructuras derivadas del área RM a partir de E15.5, sin una alteración específica de estas migraciones.
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    Neuroprotección en procesos neurodegenerativos asociados al parkinsonismo y al envejecimiento : correlación entre muerte neuronal dopaminérgica y activación glial
    (Universidad de Murcia, 2019-07-12) Gil Martínez, Ana Luisa; Herrero Ezquerro, María Trinidad; Escuela Internacional de Doctorado
    Diferentes estudios señalan que los procesos neuroinflamatorios tienen un papel fundamental en el inicio y la progresión de la enfermedad de Párkinson (EP). Estos mecanismos están regulados principalmente por las células de la glia, de las que destacan las células de la microglia y los astrocitos. Estas células son los componentes principales que intervienen en los procesos neuroinflamatorios desencadenados tras una lesión en las neuronas dopaminérgicas. En base a esto, se investigan posibles estrategias terapéuticas basadas en anti-inflamatorios y/o anti-oxidantes para diseñar tratamientos más efectivos que reduzcan o eviten los efectos secundarios producidos por los fármacos comúnmente utilizados en la EP. Con esto en mente, los estudios presentados en esta tesis examinan la implicación de los procesos neuroinflamatorios en la neurodegeneración dopaminérgica producida por la inducción de parkinsonismo por la administración de una neurotoxina, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), en ratones jóvenes y viejos. En primer lugar, el Capítulo 1 familiariza al lector con la patología y la patogénesis de la EP. Después de esta breve introducción, el Capítulo 2 presenta una descripción completa del papel de la neuroinflamación en esta enfermedad. En esta revisión se recogen las principales contribuciones desde los primeros trabajos que sugirieron la implicación de los procesos neuroinflamatorios en la EP hasta las principales cuestiones todavía por resolver. Se exponen que los principales desafíos que debe superar la investigación están centrados en las estrategias terapéuticas para tratar a los pacientes parkinsonianos. Como alternativa, se describen las diferentes ventajas que ofrece el "reposicionamiento de fármacos" entre las que destacan la disminución de efectos secundarios y la aceleración en cuanto a la identificación de nuevas dianas farmacológicas. El primer trabajo experimental de esta tesis, recogido en el Capítulo 3, comienza con una investigación sobre el efecto de la inflamación sistémica en la neurodegeneración y en la activación glial en ratones parkinsonianos. La hipótesis de este trabajo está inspirada en publicaciones que sugieren que tanto la inflamación cerebral como la periférica podrían desempeñar un papel clave en la progresión de este trastorno. Para llevar a cabo este trabajo, se utilizó un modelo de colitis ulcerosa y se combinó cuidadosamente con un modelo experimental de parkinsonismo. Los estudios post mortem mostraron una disminución muy significativa de las neuronas dopaminérgicas en el SNpc, así como una disminución significativa de las fibras dopaminérgicas estriatales del grupo tratado con MPTP+DSS en comparación con el grupo control. Además, hubo una exacerbación significativa de la activación glial en los animales MPTP+DSS en comparación con el grupo no tratado. En general, los datos indicaron que una lesión gastrointestinal, que induce una respuesta inflamatoria sistémica, puede exacerbar los mecanismos de muerte celular de las neuronas dopaminérgicas restantes desencadenando en una degeneración progresiva en la enfermedad. Estos resultados abren nuevas líneas de investigación sobre el papel de la inflamación sistémica en la progresión de la degeneración dopaminérgica. La segunda parte de esta tesis recoge estudios experimentales enfocados en el diseño de estrategias terapéuticas como el "reposicionamiento de fármacos". En el Capítulo 4, se evaluó el posible efecto neuroprotector de la combinación de dos fármacos: (i) la N-acetilcisteína (NAC), un precursor de glutatión e inhibidor de JNK con acciones antioxidantes, y (ii) HA-1077, un inhibidor de ROCKinase y polarizador de microglia. Junto con esto, se estudió el efecto de la combinación de NAC y HA-1077 sobre la neurodegeneración y la respuesta glial en ratones añosos intoxicados con MPTP. Curiosamente, los estudios post mortem demostraron que el tratamiento basado en NAC+HA-1077 produjo un aumento significativo en la degeneración de las terminales estriatales dopaminérgicas. Este evento estuvo acompañado por un aumento de la activación glial. En general, los inesperados efectos tóxicos, encontrados después de la administración combinada de NAC y HA-1077 en ratones viejos parkinsonianos, resaltan la importancia de tener en cuenta que la combinación de algunos fármacos en pacientes ancianos parkinsonianos puede tener efectos secundarios que pueden resultar en la exacerbación del proceso neurodegenerativo. El capítulo 5 sigue una línea de investigación similar a la del capítulo anterior. De acuerdo con los efectos neuroprotectores obtenidos por la administración de NAC, este estudio tuvo como objetivo analizar si hubo un efecto sinérgico positivo de NAC a lo largo de la actividad física voluntaria (PA) sobre la neurodegeneración dopaminérgica y la respuesta glial en ratones jóvenes parkinsonianos. Los resultados de los estudios post mortem en la vía nigroestriatal demostraron un aumento significativo de la degeneración dopaminérgica. Así, el tratamiento combinado no protege las neuronas dopaminérgicas contra una intoxicación subcrónica de MPTP. Con respecto a la respuesta glial, los resultados obtenidos del análisis microglial no muestran un aumento significativo en el número de células Iba-1+ en MPTP+NAC y MPTP+PA+NAC. Estos resultados se ven reforzados por los obtenidos del análisis de la activación astroglial, en la que se observa una disminución en la expresión de células GFAP+ en MPTP+NAC y MPTP+PA+NAC en comparación con los grupos MPTP en la vía nigrostriatal. Estos resultados muestran un efecto potencialmente positivo, solo debido al tratamiento con NAC, en la respuesta neuroinflamatoria después de una intoxicación subcutánea por MPTP. Sin embargo, estos resultados sugiere que la actividad física, utilizada con fines terapéuticos, tiene un efecto beneficioso a largo plazo por lo que estudios más largos podrían demostrar su efecto como estrategia neuroprotectora. La última parte experimental de esta tesis se presenta en el Capítulo 6, que profundiza en los cambios, a lo largo del tiempo, de los eventos relacionados con la degeneración dopaminérgica, la respuesta astroglial y la expresión de las MAPKinasas. Las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) se han señalado como una de las principales vías metabólicas involucradas en la regulación de la inflamación y, como consecuencia, se ha relacionado con diferentes enfermedades neurodegenerativas. Los resultados mostraron que ambos procesos relacionados con la neurodegeneración y la respuesta astroglial comenzaron a aumentar significativamente en comparación con los animales no tratados a partir de las 24 h. Además, no se encontraron diferencias significativas en la expresión fosfo-ERK mientras que los niveles de fosfo-p38 aumentaron a partir de las 4 h en la vía nigrostriatal y, específicamente, se hicieron significativas a las 48 h solo en el cuerpo estriado. La importancia de estos datos radica en la descripción de los eventos primarios desencadenados en ratones viejos después de la intoxicación con MPTP. En conclusión, estos resultados abren la puerta a estudios más profundos para evaluar las diferentes vías metabólicas tanto en sentido ascendente como descendente, junto con su comparación entre diferentes regímenes de intoxicación (aguda y crónica). En este proyecto, los tratamientos están diseñados en función del uso de antiinflamatorios y/o antioxidantes para ver su efecto neuroprotector en la muerte neuronal dopaminérgica y en la activación de procesos neuroinflamatorios en ratones parkinsonianos (jóvenes y viejos). La importancia de estos estudios radica en la posibilidad de dilucidar los mecanismos subyacentes de los procesos neurodegenerativos para mejorar la calidad de vida de los pacientes y proporcionar conocimiento para la búsqueda de soluciones que retrasen el desarrollo y la progresión de la degeneración neuronal. Por lo tanto, esta tesis proporciona diferentes observaciones que resaltan la importancia de la participación de los procesos neuroinflamatorios, mediados por las células gliales, en el desarrollo y la exacerbación de los procesos neurodegenerativos en la enfermedad de Parkinson.
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    Study of the interpeduncular nucleus and the trigeminal sensory complex as paradigms of neuronal migration and brain segmentation in the hindbrain
    (Universidad de Murcia, 2022-03-09) García Guillén, Isabel María; Aroca Tejedor, Pilar; Marín San Leandro, Faustino; Escuela Internacional de Doctorado
    Esta tesis doctoral se incluye en el campo de la Neurobiología del Desarrollo. El objetivo principal ha sido profundizar en el conocimiento de dos procesos fundamentales para la formación del encéfalo: la migración neuronal y la segmentación cerebral. Para ello, me he centrado en dos estructuras relacionadas respectivamente con estos procesos: el núcleo interpeduncular (IPN), que estudios previos han descrito como modelo de migración neuronal en el rombencéfalo rostral; y la columna sensorial del trigémino, que se extiende a través de sucesivas unidades segmentarias a lo largo del rombencéfalo. Para el estudio de ambas estructuras, este trabajo toma como base el modelo neuromérico, que considera sucesivas unidades segmentarias o metaméricas a lo largo del eje longitudinal del encéfalo. Estos neurómeros se denominan rombómeros (r) en el rombencéfalo. Muestran expresión específica de combinaciones de genes de desarrollo y dan lugar a dominios transversales respectivos del rombencéfalo adulto. En cuanto aI IPN, está formado íntegramente por la migración neuronal de diversas poblaciones neuronales con diferentes orígenes dorsoventral y rostrocaudal. Esta estructura se subdivide en tres componentes rostrocaudales, el prodromal (Pro) ubicado en el istmo (también llamado r0), y el rostral interpeduncular (IPR) y caudal interpeduncular (IPC), localizados en rostral r1 (r1-r) y caudal r1 (r1-c), respectivamente. Algunos autores han propuesto que r1-r y r1-c pueden considerarse como segmentos independientes, de modo que los tres dominios del IPN antes mencionados corresponderían a sus respectivos neurómeros. Estudios previos demostraron que las poblaciones celulares del IPN expresan varios factores de transcripción (TF) (Nkx6.1, Pax7, Otp, Otx2, Irx2) durante el desarrollo de esta estructura, permitiendo así determinar su origen, vías migratorias y destino final. En el estudio 1 (García-Guillén et al., 2020) el objetivo fue estudiar el proceso de migración del IPN en un ratón mutante que carece de DCC (Deleted in Colorrectal Cancer), que es un receptor de Netrin-1. Esta molécula participa en múltiples procesos de migración durante el desarrollo del rombencéfalo. La técnica principal utilizada fue la hibridación in situ con sondas de ARN para los TF mencionados anteriormente en encéfalos de ratón DCC- / - knockout frente a sus homólogos de tipo salvaje. A continuación, en el estudio 2 (García-Guillén et al., 2021) nos centramos en la regionalización molecular dentro de este núcleo, mediante la búsqueda de genes expresados diferencialmente dentro de las subregiones del IPN. Realizamos esta selección y análisis utilizando los datos de Allen Developing Mouse Brain Atlas (ADMBA) (https://developingmouse.brain-map.org/). Los estudios 1 y 2 se realizaron en estadios perinatales (principalmente E18.5 y también P4) debido a que el IPN es un núcleo de formación tardía, por lo que se pensó que el cribado daría lugar a genes que podrían participar tanto en la migración neuronal como en la regionalización de este núcleo. En cuanto a la columna sensorial del trigémino, se extiende a lo largo de la mayor parte del rombencéfalo, abarcando así varios rombómeros. Esta columna está formada por el núcleo sensorial principal (Pr5), ubicado en los rombómeros r2 y r3, y el núcleo espinal del trigémino (Sp5), que cubre desde r4 hasta el límite rombencéfalo/médula espinal, según estudios previos en ratón. El objetivo perseguido en el estudio 3 (García-Guillén et al., 2021b) fue estudiar su organización segmentaria, buscando genes expresados diferencialmente dentro de esta estructura. Para ello, buscamos en las bases de datos ADMBA y Allen Mouse Brain Atlas (AMBA) (https://mouse.brain-map.org/) en juveniles (P4, P14, P28) y adultos (P56), ya que pretendíamos brindar un nuevo soporte molecular para las posibles subdivisiones romboméricas de esta estructura que no solo serían transitorias en el embrión, sino que también se mantendrían en los encéfalos adultos. Los resultados del estudio 1 muestran que la vía de señalización Netrin-1 / DCC es uno de los mecanismos implicados en la migración de la IPN, ya que en el mutante existe un deterioro general pero diferencial de la migración neuronal de todas las poblaciones analizadas. La ausencia de DCC afecta principalmente a aquellas poblaciones de los dominios Pro e IPR de este núcleo. En el estudio 2 obtuvimos 135 genes expresados en el IPN de forma regionalizada. El análisis funcional de estos genes destacó una sobrerrepresentación de familias de genes relacionadas con el desarrollo de neuronas, la morfogénesis celular y la guía de axones. En el estudio 3, caracterizamos el patrón de expresión de 12 genes expresados diferencialmente a lo largo de la columna del trigémino: Baiap3, Camk2a, Calb1, Calb2, Irx2, Kcng4, Fn1, Mafb, Tac1, Tac2, Pde1c y Zbtb16. A través del análisis del patrón de estos genes, proporcionamos un nuevo soporte genético de la segmentación de esta columna en el adulto. En general, estos trabajos aportan nuevos conocimientos sobre los mecanismos de desarrollo de dos estructuras del rombencéfalo, el IPN y la columna sensorial del trigémino, como ejemplos de migración y segmentación celular. Este conocimiento puede servir de base para futuros estudios sobre la función o farmacología de ambas estructuras, o puede aplicarse también al estudio de otras poblaciones neuronales en cuya formación están implicadas la migración y / o la segmentación.