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    Cambios adaptativos cardiacos durante la dependencia de morfina. Implicación e la proteína de choque térmico Hsp27
    (2014-05-19) Martínez Laorden, Elena; Almela Rojo, Pilar; Laorden Carrasco, María Luisa; Facultad de Medicina
    Actualmente se sabe que hay una estrecha relación entre adicción y desórdenes cardiacos. Sin embargo, se conoce muy poco acerca de los mediadores y mecanismos implicados. Nuestros objetivos han sido: 1. Valorar la actividad simpática cardiaca, determinando los niveles de NA y normetanefrina (NMN). Como posibles mecanismos implicados evaluamos: -la expresión de las dos isoformas de la enzima COMT y - la expresión y fosforilación en serina 40 y 31 de la proteína TH. 2. Evaluar el grado de estrés que se produce durante la adicción a morfina valorando la respuesta del eje HHA y la puesta en marcha de mecanismos cardioprotectores. Se cuantificaron los niveles plasmáticos de ACTH y corticosterona y se valoró la expresión de Hsp27 y la fosforilación de la misma. 3. Investigar un posible nexo de unión entre Hsp27 y troponinas para ello valoramos la expresión de Hsp27, TnT y TnI, así como su co-localización. 4. Valorar el papel de los receptores de CRF1 en la actividad del sistema noradrenérgico cardiaco y del eje HHA. También se valoró la implicación de estos receptores en la expresión y fosforilación de Hsp27. Para ello se utilizó el antagonista selectivo de receptores de CRF1 (CP-154,526) y ratones genéticamente deficientes del receptor de CRF1 (CRF-/-, knockout, KO). Metodología Se han utilizado ratas (Sprague-Dawley) y ratones (B6,129 CRHtklee) macho (WT, CRF1R+/+) y homocigotos recesivos (KO, CRF1R-/-). La dependencia de morfina se indujo mediante la implantación subcutánea de pellets de morfina base (75mg) o mediante inyección i.p. de dosis crecientes de morfina (10-60 mg/kg). Para la precipitación del síndrome de abstinencia se utilizó naloxona (1 o 2 mg/kg, s.c.). El análisis de ACTH y corticosterona se realizó mediante un kit de radioinmunoanálisis (RIA). Se utilizó cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) con detector electroquímico para la determinación de NA y NMN. Las proteínas Hsp27 total y fosforilada, las troponinas y la mu-calpaina se determinaron mediante western-blot. Se realizaron experimentos con inmunofluorescencia para determinar Hsp total y las troponinas TnT y TnI; así como para la co-localización de Hsp27 con TnT y TnI. Resultados y conclusiones -Durante el síndrome de abstinencia a morfina se produce un aumento de la expresión de las dos isoformas de COMT, que serían las responsables del aumento de NMN y, por tanto, del turnover de NA. Asimismo, observamos un aumento de la expresión y de la fosforilación de TH . Estos últimos resultados indicarían la puesta en marcha de mecanismos post-transcripcionales. -El síndrome de abstinencia a morfina cursa con una hiperactivación del eje HHA, como indica los elevados niveles plasmáticos de ACTH y corticosterona. Propranolol y SL-327 fueron capaces de antagonizar el incremento de ACTH y no de corticosterona, lo que sugiere que mecanismos independientes de la ACTH hipofisaria mediarían la respuesta de las suprarrenales. -Durante la dependencia de morfina se produce un aumento en la expresión de Hsp27, lo que corrobora que la adicción a opioides provoca un importante estrés celular. Además, nuestro estudio demuestra que los receptores β-adrenérgicos y la vía de señalización ERK estaría implicada en la fosforilación de Hsp27 y, por tanto, en los efectos cardioprotectores que induce esta proteína. Así mismo se evidencia una co-localización entre Hsp27 y cTnT, lo que sugiere la existencia de algún tipo de interacción entre ambas proteínas. -Estos resultados demuestran que el bloqueo selectivo de los receptores de CRF1 y la deleción genética de los receptores de CRF1 antagonizan los cambios adaptativos cardiacos, lo que sugiere que los fármacos antagonistas que tengan como diana el receptor de CRF1 podrían mejorar el estrés y los efectos nocivos cardiacos inducidos durante el síndrome de abstinencia a morfina. ABSTRACT There is a close relationship between addiction and cardiac disorders. However, very little is known about the mediators and mechanisms implicated. Our aims were: 1) To evaluate the cardiac sympathetic activity by determining the levels of NA and normetanephrine (NMN). Asses possible mechanisms involved:-expression of the two isoforms of COMT and - the expression and phosphorylation of TH at serine 40 and 31. 2) To assess the degree of stress that occurs during addiction to morphine assessing the response of the HPA axis and cardioprotective mechanisms. Plasma ACTH and corticosterone levels were quantified and Hsp27 expression and phosphorylation of TH was evaluated. 3) To investigate a possible link between Hsp27 and troponin. For it expression of Hsp27, TnT and TnI, and their co-localization was determined. 4) To evaluate the role of CRF1 receptors in the activity of cardiac noradrenergic system and the HPA axis. The involvement of these receptors in the expression and phosphorylation of Hsp27 was also assessed. Selective CRF1 receptor antagonist (CP-154, 526) and mice genetically deficient CRF1 receptor (CRF-/- knockout, KO) was used. Methods We used rats (Sprague-Dawley) and mice (B6, 129 CRHtklee) male (WT, CRF1R + / +) and homozygous recessive (KO, CRF1R-/ -). Morphine dependence was induced by subcutaneous implantation of pellets of morphine base (75mg) or by ip injection increasing doses of morphine (10-60 mg / kg). For precipitation of withdrawal naloxone (1 or 2 mg / kg, sc) was administered. The ACTH and corticosterone analysis was done using a radioimmunoassay kit (RIA). We used liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detector for NA and NMN determination. Total and phosphorylated Hsp27 proteins, troponins and mu-calpain were determined by western-blot. Immunofluorescence experiments were performed to determine the total Hsp TnT and TnI and troponin, as well as for the co-localization of Hsp27 with TnT and TnI. Results and conclusions - During morphine withdrawal we observed an increased expression of the two isoforms of COMT, which are responsible of increased NMN and therefore the NA turnover. We also observed increased expression and phosphorylation of TH. These latter results indicate the involvement of post-transcriptional mechanisms. - Morphine withdrawal induced an activation of the HPA axis, as indicated by elevated plasma levels of ACTH and corticosterone. Propranolol and SL-327 were able to antagonize the increase in ACTH but not in corticosterone, suggesting that separate mechanisms mediate pituitary ACTH adrenal response. - Morphine dependence produced an increased Hsp27 expression, corroborating that opioid addiction causes major cellular stress. Furthermore, our study demonstrates that the β-adrenergic receptors and ERK signaling would be involved in the phosphorylation of HSP27 and therefore in the cardioprotective effects induced by this protein. Also colocalization between Hsp27 and cTnT is evidence suggesting the existence of some interaction between the two proteins. - These results demonstrate that selective blockade of CRF1 receptors and genetic deletion of CRF1 receptors antagonized the cardiac adaptive changes observed during morphine withdrawal, suggesting that CRF1 receptor antagonists may improve stress and harm cardiac induced during morphine withdrawal.
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    Caracterización de los cambios celulares y moleculares en el sistema cerebral del estrés durante la dependencia de morfina / Cellular and molecular changes in the stress-responsive system during morphine dependence
    (Universidad de Murcia, 2010-06-23) Núñez Parra, Cristina; Laorden Carrasco, María Luisa; Milanés Maquilón, María Victoria; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Farmacología
    Morphine withdrawal increases the HPA axis activity, which is dependent on a hyperactivity of noradrenergic pathways (NTS-A2) innervating the PVN. In this Thesis we found that morphine withdrawal resulted in an increase in ACTH and corticosterone secretion and a neuronal activation in the PVN. Additionally, we found robust increases in CRF and AVP hnRNAs in the PVN, concomitantly with an increase in c-Fos expression. Morphine withdrawal activated ERK1/2 in PVN and NTS, which could be involved in the c-Fos expression. Morphine withdrawal induced an increase in TH mRNA levels in the NTS-A2, total TH protein in the NTS and TH phosphorylation at Ser31 in PVN and NTS-A2, which resulted in an augmentation of TH activity in the PVN. The enhancement in TH phosphorylated at Ser31 was blocked by SL327 in both nuclei. Finally, we have found that adrenalectomy eliminated the hyperactivity of noradrenergic pathways innervating the PVN during morphine withdrawal. Resumen La abstinencia a morfina aumenta la actividad del eje HHA, que depende de la hiperactivación de las vías noradrenérgicas (NTS-A2) que inervan al PVN. En esta Tesis encontramos que la abstinencia a morfina induce la liberación de ACTH y corticosterona y la activación neuronal del PVN. Además, observamos un aumento en los niveles de hnRNA para CRF y AVP en el PVN, concomitantemente con un incremento en la expresión de c-Fos. El síndrome de abstinencia a morfina activó a ERK1/2 en PVN y NTS. También indujo un incremento en el mRNA para TH en el NTS-A2, proteína TH total y fosforilación de TH en su Ser31 en PVN y NTS-A2, que se tradujo en un aumento en su actividad enzimática. El aumento de TH fosforilada en Ser31 fue bloqueado por SL327. Finalmente, la adrenalectomía eliminó la hiperactividad de las vías noradrenérgicas que inervan al PVN durante la abstinencia a morfina.
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    Implicación de diferentes cascadas de señalización intracelular en los cambios adaptativos observados durante la dependencia de morfina
    (Universidad de Murcia, 2010-06-23) Almela Rojo, Pilar; Laorden Carrasco, María Luisa; Milanés Maquilón, María Victoria; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Farmacología
    El objetivo general de este trabajo ha sido estudiar la posible implicación de diferentes cascadas de proteín kinasas en las modificaciones cardiacas que se producen tras la administración de naloxona a ratas dependientes de morfina. Los datos obtenidos indican que durante la abstinencia a morfina se produce un aumento del turnover de NA, de la actividad TH y de su fosforilación en serina 40 y 31, lo que sugiere la puesta en marcha de mecanismos post-transcripcionales. Por otra parte, la vía de la PKA estaría implicada en el incremento del turnover de NA, en el aumento de TH total y en la fosforilación y activación de TH en serina 40 durante dicho síndrome. Por último, la vía de la PKC sería una de las vías implicadas en la expresión de c-fos, así como la de las ERK, que estaría también implicada en la activación de TH en serina 31. ABSTRACT The main aim of this work was to study the posible involvement of different protein kinases in the cardiac adaptive changes induced during morphine withdrawal. Our results show an increase of NA turnover, TH activity and TH phosphorylation at serine 31 and 40, suggesting starting post-trascriptional mechanisms. On the other hand, PKA transduction system could be implicated in the enhanced NA turnover, in the total TH increase and in the phosphorylation and activation of TH at serine 40 during this syndrome. Finally, PKC pathway would be involved in c-Fos expression as well as ERK system which would also be responsible for TH phosphorylation at serine 31.
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    Implicación del sistema cerebral del estrés en la dependencia de morfina: papel de los receptores de CRF y glucocorticoides
    (2012-07-03) Navarro Zaragoza, Javier; Laorden Carrasco, María Luisa; Milanés Maquilón, María Victoria; Facultad de Medicina
    El síndrome de abstinencia a sustancias de abuso activa el sistema cerebral del estrés, que está formado por el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal (HHA) y por la amígdala extendida. Ambas estructuras tienen como neurotransmisor principal el factor liberador de corticotropina (CRF). El CRF se une a los receptores CRF1 y CRF2 en la adenohipófisis y provoca la liberación de ACTH que produce liberación de glucocorticoides desde las adrenales. Es conocido que durante el síndrome de abstinencia a morfina se produce una hiperactivación de las vías noradrenérgicas que inervan el núcleo paraventricular del hipotálamo, produciéndose un aumento del turnover de noradrenalina y también de los niveles de corticosterona, así como una serie de signos somáticos. Los resultados obtenidos tras la administración de antagonistas de CRF1R, CRF2R, receptor glucocorticoide y mineralocorticoide, cuya expresión es conocida en el NTS, permite concluir que CRF2R y GR deben mediar probablemente dicha activación del sistema cerebral del estrés. It is known that morphine withdrawal activates brain stress system which is composed of hypothalamus-pituitary-adrenal axis (HPA) and the extended amygdala. Both systems have the same main neurotransmitter Corticotropin-Releasing Factor (CRF). CRF produces its effects by binding to CRF1 and CRF2 receptors. Binding of CRF to the CRF receptors on pituitary induces the release of ACTH which in turn stimulates GC synthesis and secretion from the adrenal cortex. During morphine withdrawal, noradrenergic pathways that innervate paraventricular nucleus of hypothalamus are hyperactivated resulting in an increase of noradrenaline turnover but also enhanced corticosterone levels and some characteristic morphine withdrawal somatic signs. CRF1R, CRF2R, glucocorticoid receptor (GR) and mineralocorticoid receptor (MR) are expressed in the NTS (noradrenergic nuclei), so the results after administration of their antagonists led us to conclude that probably CRF2R and GR could mediate brain stress system activation during morphine withdrawal.
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    Infografías de la asignatura de Toxicología Molecular del Grado de Bioquímica
    (2024-04-15) Legaz Pérez, Isabel; Facultad de Ciencias Sociosanitarias
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    Mecanismos celulares y moleculares implicados en los cambios comportamentales inducidos durante la dependencia de morfina
    (2014-02-06) Lasheras Ruiz, Carmen; Núñez Parra, Cristina; Milanés Maquilón, María Victoria; Facultad de Medicina
    El objetivo del presente trabajo de investigación fue evaluar la metabolización de DA y NA en el NAc y los lugares específicos de fosforilación de la TH en el NAc, VTA, y NTS en ratones condicionados mediante preferencia de plaza a morfina; estudiar el papel del CRF1-R en los efectos reforzadores positivos de la morfina usando el paradigma de CPP; y examinar el impacto de la administración de morfina crónica y la abstinencia a la misma, en la expresión génica y la actividad en las neuronas orexinérgicas del LH, así como el papel de este neurotransmisor en el sistema cerebral del estrés durante el síndrome de abstinencia a opioides. La fosforilación de TH se determinó en ratones Swiss machos, mediante su cuantificación por western blot e inmunocitoquímica usando anticuerpos específicos para los estados de fosforilación enzimáticos; y los turnover de NA y DA fueron evaluados por HPLC. Un set de animales diferente fue pretratado con un antagonista del CRF1-R (CP-154,526) o con vehículo durante 6 días, seguidos de un test al CPP a morfina. Treinta minutos tras recibir el pretratamiento, los ratones recibieron una dosis de morfina los mismos días que recibían CP-154,526, o salino los mismos días que recibían vehículo, y eran condicionados inmediatamente después. Los animales control siempre recibieron vehículo y salino durante el protocolo. c-Fos y Ox-A, los turnover de DA y NA, y la concentración plasmática fueron evaluados por inmunocitoquímica, HPLC y RIA, respectivamente. Y por último, se indujo la dependencia a opioides en ratas macho Wistar con la administración crónica de morfina seguida por la administración de naloxona para inducir el síndrome de abstinencia. Los antagonistas selectivos de los OxR1 y OxR2, SB334867 y TCSOX229 respectivamente, se usaron para determinar si la actividad orexinérgica está relacionada con los signos somáticos de la abstinencia a opioides y las alteraciones generadas en el eje HHA y en la amígdala extendida durante la dependencia a morfina. De todos estos experimentos se obtuvieron tres bloques de datos: a) el CPP inducido por morfina fosforila la TH en la Ser40 en el NAc, lo que está asociado al incremento de la metabolización tanto de DA como de NA en dicho núcleo. También se observó que el CPP inducido por morfina incrementa los niveles de la TH fosforilada tanto en la Ser40 como en la Ser31 en el NTS. b) al antagonizar el CRF1-R, se bloqueó el CPP inducido por morfina y se incrementó del turnover de NA en el NAc en los ratones que recibieron morfina. Aunque el CP-154,526 antagonizó el incremento de la expresión de c-Fos generada por el CPP a morfina en el VTA y NAc, éste no indujo ningún efecto en el turnover de DA en el NAc. El antagonista de CRF1-R, también bloqueó la activación de las neuronas orexinérgicas en el LLH. c) Durante la abstinencia a morfina, se induce una activación de neuronas Ox-A en el LH. Por otra parte, se observó cómo ambos antagonistas de los OxR atenuaron los signos somáticos del síndrome de abstinencia a morfina, y cómo la administración del SB-334867 redujo la expresión de c-Fos en el NAc, BNST, CeA y PVN previamente inducida por dicho síndrome; aunque la administración de TCSOX229 indujo una hiperactivación en el PVN. La administración de ambos antagonistas orexinérgicos no generó ninguna modificación en la actividad del eje HHA. Recopilando los datos previamente expuestos, se demuestra: 1. que el CPP inducido a morfina estimula la actividad de la TH y acelera la metabolización de DA y NA en el NAc, a través de un mecanismo de fosforilación de dicha enzima. 2. que el CPP inducido a morfina activa diferentes áreas cerebrales implicadas en los mecanismos de recompensa, destacando un papel crítico del CRF1-R en dicha activación, así como en cambios moleculares implicados en el comportamiento inducido por la administración de morfina. 3. el síndrome de abstinencia a morfina, inducido por la administración de naloxona, activa las neuronas orexinérgicas de las tres subdivisiones del LH, acompañado por un aumento en la transmisión orexinérgica al sistema cerebral del estrés. 4. estos datos revelan el papel crítico que juega el sistema de orexinas en los síntomas físicos que ponen de manifiesto el síndrome de abstinencia a opioides. CELLULAR AND MOLECULAR MECHANISMS INVOLVED IN MORPHINE DEPENDENCE-INDUCED BEHAVIORAL ALTERATIONS The purpose of the present research was to evaluate the turnover of DA and NA in the NAc and the site-specific phosphorylation of TH in the NAc, VTA, and NTS on the morphine CPP mice; to study the role of CRF1-R in the positive reinforcement effects of morphine using the CPP paradigm; and to examine the impact of chronic morphine and withdrawal on the lateral hypothalamic (LH) orexin A (Ox-A) gene expression and activity, as well as Ox-A involvement in the brain stress response to morphine abstinence. TH phosphorylation was determined in male Swiss mice by quantitative blot inmunolabeling and immunohistochemistry using phosphorylation state-specific antibodies; NA and DA turnover was evaluated by high performance liquid chromatography. A different set of animals were treated with a CRF1-R antagonist (CP-154,526) or vehicle during 6 days. Thirty min after receiving the antagonist, mice were injected with morphine on the same days that CP-154,526 was administered, or saline on the same days that vehicle was administered, and were immediately conditioned. Control animals received antagonist or vehicle, and saline every day. On day 7, animals were tested for morphine-induced CPP. c-Fos and Ox-A, DA and NA turnovers, and corticosterone plasma concentration were evaluated by immunohistochemistry, HPLC and RIA, respectively. And at last, male Wistar rats received chronic morphine followed by naloxone to precipitate withdrawal. The selective OxR1 antagonist, SB-334867, was used to examine whether orexins’ activity is related to somatic symptoms of opiate withdrawal and alterations in HPA axis and extended amygdala in rats dependent on morphine. All these experiments resulted in three different sets of data: a) Morphine-induced CPP phosphorylates TH at serine (Ser)40 in NAc, which is associated with an enhanced of DA and NA turnover. We also found that morphine-induced CPP increased levels of TH phosphorylated at Ser31 and Ser40 in the NTS. b) CRF1-R antagonism blocked the morphine-induced CPP and the increased NA turnover in the NAc in morphine-paired mice. Although CP-154,526 antagonizes the enhancement in c-Fos expression evoked by morphine-induced CPP in the VTA and NAc, CP-154,526 had no effect in the augmented DOPAC/DA ratio in the NAc. CRF1-R antagonist blocked the activation of the orexinergic neurons in the LLH. c) During morphine withdrawal, there was an activation of Ox-A neurons in the LH. Importantly, SB-334867 attenuated the somatic symptoms of withdrawal, and reduced morphine withdrawal-induced c-Fos expression in the NAc shell, BNST, CeA and hypothalamic PVN, but did not modify the HPA axis activity. The conclusions of the present study demonstrate: 1. that morphine-induced CPP might stimulate TH activity and accelerate DA and NA turnover in the NAc via a mechanism involving phosphorylation of TH. 2. that morphine-induced CPP activates different brain areas involved in reward, and points out a critical role of CRF1-R, in molecular changes involved in morphine-conducted behaviours. Thus, our study supports a therapeutic potential of CRF1-R antagonists in addictive disorders. 3. a critical role of Ox-A signalling, via OxR1, in activation of brain stress system to morphine withdrawal and suggest that all orexinergic subpopulations in the lateral hypothalamic area contribute in this response.
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    Mecanismos neurobiológicos implicados en la preferencia de plaza a morfina y en la aversión a naloxona: papel de los receptores de CRF1
    (2015-12-17) García Carmona, Juan Antonio; Laorden Carrasco, María Luisa; Facultad de Medicina
    OBJETIVOS Diferentes estudios anatómicos, funcionales y de comportamiento sugieren un papel para los sistemas de CRF en los procesos adictivos. Con el fin de buscar dianas terapéuticas que pudieran ser de utilidad para el tratamiento de las adicciones el principal objetivo de este estudio se ha centrado en investigar la implicación de los sistemas de CRF y de los receptores de CRF1 en los efectos reforzantes positivos y negativos de la adicción a morfina, y en los cambios celulares y moleculares observados en diferentes estructuras cerebrales relacionadas con los sistemas de recompensa, los circuitos del estrés y la memoria. Para ello, utilizamos ratones genéticamente modificados en los cuales el CRF1R ha sido borrado (knockdown, KO) y ratones tratados con un antagonista selectivo de los receptores de CRF1. Como modelos de comportamiento utilizamos la preferencia condicionada de plaza (CPP) y la aversión condicionada de plaza (CPA), paradigmas de condicionamiento pauloviano en los que las propiedades reforzantes o aversivas de un fármaco, inicialmente relacionadas con un estímulo ambiental neutro, originan a lo largo del condicionamiento que este estímulo ambiental adquiera propiedades motivacionales, bien de atracción o aversión, cuando el animal es posteriormente expuesto. METODOLOGÍA Se han empleado modelos de comportamiento animal basados en los patrones de dependencia y abstinencia a opioides. Se han empleado muestras de ratones Swiss y ratones modificados genéticamente carentes del receptor de CRF1 para evaluar la implicación del mismo en el proceso adictivo. Así, una vez obtenidas las muestras de tejido cerebral o cardiaco se han evaluado mediante inmunocitoquímica, inmunofluorescencia y westernblot las alteraciones en diferentes proteínas o factores de expresión génica como la tioredoxina, CREB, c-fos, enzimas como la tirosina hydroxilasa o mediadores como la protein kinasa A. Además, mediante HPLC se han analizado los cambios en las concentraciones de dopamina y noradrenalina. Mediante radioinmunoensayo se han analizado variaciones en hornomas como la ACTH y la corticoesterona. Finalmente, los datos fueron tratados estadísticamente con el software GraphPrism y SPSS 19. CONCLUSIONES 1. El aumento de la actividad (co-localización CRF/CREB) de las neuronas de CRF en el PVN, CeA and BNST no se evidenció en animales condicionados a morfina fuera de las cajas de comportamiento lo que nos permite afirmar que las señales asociadas al consumo son las que inducen un aumento de las vías de CRF en el sistema cerebral del estrés, apoyando la idea de que el entorno donde se consume las drogas tiene una importancia fundamental en el tratamiento de la adicción. 2. CP-154,526, abolió la preferencia de plaza observada con morfina así como el aumento de CREB en PVN y DG. Además, la expresión de tioredoxina 1 y la co-localización PCREB/tioredoxina fueron antagonizados en presencia de CP-154,526 en el DG. Por tanto, las vías de CRF a traves de la activación del receptor de CRF1 están claramente implicadas en los procesos adictivos, concretamente en los efectos reforzantes positivos y en la asociación de la recompensa a la droga con el entorno donde se consume. 3. La delección genética de los receptores de CRF1 abolió los efectos aversivos, evaluados mediante el paradigma de CPA, del síndrome de abstinencia. La activación de las neuronas de TH fosforilada en serina 40 ó 31 en el NTS observada después del paradigma de CPA no fue abolida en animales KO del receptor de CRF1 mientras que el estímulo de las neuronas noradrenérgicas en el área VLM fue suprimido. Estos resultados demuestran que los receptores de CRF1 estarían implicados en los efectos aversivos del síndrome de abstinencia y que estos receptores modularían la activación de algunas de las vías noradrenérgicas bulbares que podrían ser responsables de la sintomatología negativa de la abstinencia. 4. Los efectos aversivos del síndrome de abstinencia a morfina están modulados por la activación del eje HPA, con un claro aumento de las concentraciones plasmáticas de ACTH. Además, este aumento retorno a niveles basales tras la extinción de los efectos aversivos, lo que claramente indica la participación del sistema cerebral del estrés hipotalámico en el mantenimiento de la memoria aversiva. La delección genética del receptor de CRF1 abolió los efectos aversivos y el aumento de las concentraciones plasmáticas de ACTH, lo que indica la implicación de estos receptores. La extinción de la memoria aversiva fue más rápida en las hembras que en los machos lo que demuestra distintos patrones adictivos en hombres y mujeres lo que puede tener importancia en el tratamiento clínico de las adicciones. 5. La activación de los receptores de CRF1 está implicada en los cambios adaptativos cardiacos que se producen en tejido cardiaco (aumento del turnover de NA, expresión de TH y PKA) y en las áreas cerebrales (PVN: aumento del turnover de NA; VLM: activación de neuronas de TH) que controlan la función cardiaca. Estos resultados sugieren que las vías de CRF a través de la activación de receptores de CRF1 podrían contribuir al establecimiento de las enfermedades cardiacas asociadas a los procesos adictivos. NEUROBIOLOGICAL MECHANISMS IMPLICATED IN MORHPINE PLACE PREFERENCIE AND AVERSION TO NALOXONE. ROLE OF CRF1 RECEPTORS AIMS Different anatomical, functional and behavioral studies suggest a role for the CRF systems in the addictive processes. In order to find therapeutic targets that could be useful for the treatment of addictions, the main objective of this study was focused on investigating the involvement of CRF systems and the CRF1 receptor in the positive and negative reinforcing effects of morphine addiction, and on cellular and molecular changes observed in different brain structures involved in reward systems, circuits of memory and stress. Here, we use genetically modified mice, in which the CRF1R has been deleted (knockdown, KO), and mice treated with a selective antagonist of the CRF1 mice. As addiction models, we used the conditioned place preference (CPP) and the conditioned place aversion (CPA), both paradigms of Pavlovian conditioning in which the reinforcing or aversive properties of a drug, first related to a neutral environmental stimuli, cause to conditioning throughout this environmental stimulus acquires motivational properties of either attraction or aversion, when the animal is subsequently exposed METHODS We have used models based on animal behavior patterns of dependence and opioid withdrawal. Tissue samples have been used from Swiss mice and genetically modified mice lacking CRF1 receptor to evaluate their involvement in the addictive process. Thus, once the samples of brain or cardiac tissue were obtained, we evaluated by immunocytochemistry, immunofluorescence and Western blot alterations in different proteins or gene expression as thioredoxin, CREB, c-fos, enzymes such as tyrosine hydroxylase or mediators as protein kinase A. In addition, we analyzed the changes in concentrations of dopamine and noradrenaline by using HPLC as well as alterations in hormones such as ACTH and corticosterone using radioinmmunoassay. Finally, the data were treated statistically with GraphPrism and SPSS 19 software. CONCLUSIONS 1. CRF neurons located in the PVN and their projections to the NTS-A2 and VTA regulate the reinforcing effects of morphine showed by using the CPP paradigm. The increased activity (co-location CRF / CREB) of CRF neurons in the PVN, CeA and BNST was not evident in animals conditioned to morphine in their home-cages. Therefore, the signals associated with the consumption induce an increase of the CRF pathways in the brain system stress, supporting the idea that the environment where the drugs are consumed plays a key role in the treatment of addiction. 2. CP-154.526, a selective antagonist of CRF 1 receptors, abolished the CPP acquisition to morphine and the increased expression of CREB in the PVN and DG, an area considered important for memory storage of associated contexts and experiences. Furthermore, the expression of thioredoxin 1, a redox protein capable of phosphorylating CREB, and the co-localization of pCREB / thioredoxin were antagonized in the presence of CP-154.526 in the DG. These results demonstrate that CRF pathways, through the CRF1 receptor activation, are clearly involved in addictive processes, particularly, in the positive reinforcing effects (reward) and the association of drug reward with the environment. 3. The genetic deletion of the CRF1 receptor abolished the aversive effects of the withdrawal syndrome, as assessed by the CPA paradigm. Activation of TH neurons phosphorylated at serine 40 or 31 in the NTS-A2 observed after CPA paradigm was not abolished in KO animals for the CRF1 receptor, while activation of the noradrenergic neurons was suppressed in the area VLM. These results demonstrate that CRF1 receptors are implicated in the aversive effects of withdrawal and modulate the activation of some of the bulbar noradrenergic pathways which could be responsible of the negative symptoms of withdrawal. 4. The aversive effects of morphine withdrawal syndrome are modulated by the activation of the HPA axis, with a clear increase in plasma concentrations of ACTH. Moreover, this increase return to baseline levels after the extinction of the aversive effects, which clearly indicates the involvement of hypothalamic brain stress system in the maintenance of aversive memory. Genetic deletion of the CRF1 receptor abolished the aversive effects and the increased plasma ACTH concentrations, indicating the involvement of these receptors. The extinction of aversive memory was faster in females than in males demonstrating different addictive patterns in men and women which may be important in the clinical treatment of addictions. 5. Activation of CRF1 is involved in cardiac adaptive changes that occur in heart tissue (abolished the increase of NA turnover, TH expression and PKA) and the brain areas (PVN: abolished the increase of NA turnover; VLM: abolished TH activation of neurons) that control heart function. These results suggest that CRF pathways, through the CRF1 receptor activation, may contribute to the development of cardiac diseases associated with addictive process.
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    Regulación de CREB y deltaFosB en el sistema cerebral del estrés durante la exposición crónica a morfina
    (Universidad de Murcia, 2011-10-04) Martín Sánchez, María Rosario Fátima; Martín Sánchez, María Rosario Fátima; Milanés Maquilón, María Victoria; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Farmacología
    FosB be molecular targets for the regulation of plasticity, which leads to addiction.Chronic exposure to opioids and other abused drugs results in adaptive changes in the brain involving alterations in gene expression. It is proposed that the transcription factors CREB and FosB expression in several brain areas involved in addiction and neuroendocrine/neurochemical changes that are responsible for the metabolic alterations seen during chronic morphine treatment. In this work we studied changes in activation of the cAMP-response element binding protein (CREB) in PVN and NTS and the kinases that may mediate this activation during dependence and morphine withdrawal and the HPA axis response after naloxone-induced morphine withdrawal. We also investigated the possibility that the activation of CREB and the transcriptional coactivator of CREB, TORC1, arises from the activation of adrenergic receptors. We also evaluated the possible modifications in FosB. FosB serían dianas moleculares para la regulación de la plasticidad, la cual lleva a la adicción. La exposición crónica a sustancias de abuso lleva a cambios adaptativos en el cerebro que implican alteraciones en la expresión génica. Se ha propuesto que los factores de transcripción CREB y FosB en diferentes áreas cerebrales implicadas en la adicción, así como los cambios neuroendocrinos/neuroquímicos responsables de las alteraciones metabólicas observadas durante el tratamiento crónico con morfina. En este trabajo hemos estudiado los cambios en la activación de CREB, en PVN y NTS, y las quinasas que mediarían su activación durante la dependencia y síndrome de abstinencia a morfina, así como la respuesta del eje HHA durante dicho síndrome. También se investigó la posibilidad de que la activación de CREB y su coactivador transcripcional TORC1 dependan de la activación de receptores adrenérgicos. Además se evaluaron las posibles modificaciones en la expresión de FosB.