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    Activación por lípidos de proteínas quinasas C
    (2014-02-07) Egea Jiménez, Antonio Luis; Gómez Fernández, Juan Carmelo; Corbalán García, Senena; Facultad de Veterinaria
    1. OBJETIVOS  Determinación de la función del dominio regulador C2 de la PKCα en la activación provocada por Ca2+, PtdSer y PIP2.  Caracterizar la interacción entre los dominios C1B de las PKC nuevas y fosfolípidos negativos, su especificidad y su dependencia de DOG y PtdOH.  Caracterizar los residuos aminoácidos involucrados en la interacción entre el dominio C1Bε y fosfolípidos negativos (PtdSer, PtdOH y cardiolipina). 2. METODOLOGÍA  Clonación de los dominios C1Bs de las isoenzimas de PKC nuevas (Ɵ, η, δ, ε) y clásica (γ) en vector de expresión de células de mamíferos (pECFP) para estudiar las interacciones lípido-proteína existentes entre ellos a diferentes concentraciones de fosfolípidos negativos, diacilglicerol y forbol-12-miristato acetato a través de la técnica de transferencia de energía por resonancia (FRET).  Purificación de la proteína PKCα silvestre y del mutante del clúster rico en lisinas de esa misma isoenzima utilizando el sistema de expresión de baculovirus para la realización de ensayos de actividad quinasa en presencia de fosfato radiactivo (ATP-32γ) a diferentes concentraciones de calcio, diacilglicerol, fosfatidilserina y PIP2. 3. RESULTADOS DE LA TESIS DOCTORAL 3.1. El phosphatidilinositol 4,5-Bifosfato disminuye la concentración de Ca2+, fosfatidilserina y diacilglricerol requerida para la activación de la PKCα. Los resultados obtenidos en este trabajo son compatibles con el mecanismo secuencial previamente propuesto en nuestro grupo y posteriormente confirmado in vivo. Básicamente, el incremento intracelular en la concentración de Ca2+ es el desencadenante de la translocación de la PKCα a la membrana plasmática. Una vez se llega a este punto, se pueden presentar dos situaciones: en microdominios enriquicidos únicamente con fosfatidilserina, el docking del dominio C2 no es suficiente para liberar el el dominio catalítico del sitio de unión a substrato, como ha sido visto en la estructura 3D recientemente resuelta, el dominio C1B permanecería bloqueando el dominio catalítico. Por todo ello, la presencia de diacilglicerol en las vesículas permite el acoplamiento de al menos el dominio C1A, permitiendo a la enzima su total activación. Una segunda situación puede ser dada cuando los microdominios están enriquecidos con fosfatidilserina y PIP2 en la membrana plasmática. En este caso el dominio C2 se acopla con una diferente orientación ya que se ancla en dos diferentes puntos: Ca2+/PS y PIP2, lo que podría inducir a un cambio conformacional que libera el dominio C1 de la conformación de bloqueo y permite que el substrato tenga acceso al sitio catalítico de la enzima, con la consecuente activación completa de la enzima. 3.2. Los dominios C1B de las PKC nuevos ε Y η tienen una mayor afinidad de unión a membranas que las PKC nuevas θ Y δ. Nuestros resultados muestran que los dominios C1B de las PKCs nuevas tienen diferentes afinidades de unión por membranas modelos, dependiendo de la presencia o no de diacilglicerol y de específicos fosfolípidos negativos. Esto es también observado en células RBL-2H3, en las cuales se han expresado los diferentes dominios C1B. Con todo ello podemos hacer dos grupos de dominios C1B de PKCs nuevas de acuerdo a sus afinidades en unión a membranas: por un lado los dominios C1B de las PKCε y PKCη con una gran afinidad de unión a membranas y aquellos con una baja afinidad, los dominios. 3.3.- Rol de los residuos con carga positiva localizados en el dominio C1Bε y su implicación en la unión de membranas. Los aminoácidos con carga positiva presentes en la parte superior del dominio C1Bε están involucrados en la interacción membrana-proteína Concretamente la lisina K251 y las argininas 268, 282 y 283, y R283, y así ha quedado de manifiesto cuando la substitución de estos residuos por alanina reduce de manera significante la afinidad de unión en los mutantes simples, incrementando en los dobles, hasta anularse por completo en los mutantes triples, incluso en presencia de diacilglicerol. Title: ACTIVATION BY LIPIDS OF PROTEIN KINASE C 1. OBJECTIVES  Determination of the importance of PIP2 in the activation of PKCα through its C2 domain in presence of different lipids and concentrations of calcium ion.  Characterization of the different binding affinities of C1B domains of novel PKCs, their specificity and dependence by DOG and negatively charged phospholipids.  Identification of the amino acidic residues involved in the interaction of C1Bε domain with negatively charged phospholipids. 2. METHODOLOGY  Recombinant DNA cloning of C1B domains and sub cloning to expression vector (pECFP-N). Using the FRET method, the binding of C1B domains to small unilamellar vesicles containing different lipid compositions was studied.  Baculovirus expression system for PKCα production and purifcation by FPLC. The wild type PKCα and the mutant of the lysine-rich cluster were used in assays of kinase activity using radioactive isotopes. 3. RESULTS 3.1. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate decreases the concentration of Ca2+, phosphatidylserine and diacylglycerol required for protein kinase C α to reach maximum activity. The results obtained in this work are compatible with the sequential mechanism previously described in our laboratory. Basically, intracytosolic Ca2+ elevations are the trigger to translocate PKCα to the plasma membrane. Once there, two situations can be found: in microdomains enriched only with phosphatidylserine, the docking of the C2 domain is not enough to liberate the catalytic domain for substrate access, and as seen in the 3D structure recently solved, the C1B domain might still keep blocking the catalytic domain. Due to this, the presence of DAG in the lipid vesicles by docking at least the C1A domain enables the enzyme to gain its full activation. A second situation can be found when the microdomains are enriched in phosphatidylserine and PIP2 at the plasma membrane. In this case, the C2 domain docks in a different orientation since it has to anchor through two different points, i.e. the CBR (Ca2+/PS) and the lysine rich cluster (PIP2), this might induce a conformational change that unleash the C1 domain from the blocking conformation and enables the catalytic domain to access the substrate and consequently full activation of the enzyme. 3.2. The C1B domains of novel PKCε and PKCη have a higher membrane binding affinity than those of the also novel PKCδ and PKCθ. Our results show that the C1B domains from novel PKCs have different binding affinities for model membranes depending on the presence or not of diacylglycerol and of specific anionic phospholipids, and this is also observed in RBL-2H3 cells in which the different C1B domains were expressed. According to these data, two groups of C1B domains from novel PKCs can be established as a function of their membrane binding affinity: those from PKCε and PKCη with a higher membrane binding affinity and those with PKCδ and PKCθ with a low affinity. 3.3. Role of positive charged amino acid residues in the C1B domain of PKCε on membrane translocation and enzymatic activity. The importance of the C1B domain of PKCε for the translocation to the membrane and activation of the enzyme has been broadly confirmed in this work, and in particular, the presence of 4 positively charged amino acid residues present on the top of the domain. These residues would be able to lead the interaction of the C1B domain to the membranes and the punctual mutations that were generated in them, were important enough to decrease the membrane affinities of the C1B domains in FRET studies and the translocation to plasma membrane of the full-length protein in stimulations of RBL-2H3 cells, as well as its enzymatic activity.
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    Correlación entre la estructura de diferentes lípidos y su modulación de las propiedades físicas de membranas liposomales / Antonio López Ortiz ; director Juan Carmelo Gómez Fernández.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,, 1987) Gómez Fernández, Juan Carmelo; Ortiz López, Antonio
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    Estudio de subfracciones de lipoproteínas de densidad intermedia (IDL) y muy baja (VLDL) y su relación con distintos factores de riesgo cardiovascular
    (2016-02-10) Calle Luna, Juan Gabriel; Albaladejo Otón, Mª Dolores; Martínez Hernández, Pedro; Departamento de Bioquímica y Biología Molecular "B" e Inmunología
    La primera causa de muerte en nuestro país está constituida por las denominadas enfermedades cardiovasculares. Se estima que en 2030 morirán cerca de 23,3 millones de personas por enfermedades cardiovasculares y se prevé que siga siendo la principal causa de muerte en todo el mundo. Se determinaron las distintas subfracciones de lipoproteínas mediante el sistema Lipoprint (Quantimetrix Corporation) en una población constituida por 166 pacientes pertenecientes a un centro de salud de la Región de Murcia. Nos planteamos los objetivos enunciados a continuación: Objetivo 1: Evaluar el método Lipoprint (Quantimetrix Corporation) para la cuantificación y separación por tamaño de las principales fracciones y subfracciones de lipoproteínas. Objetivo 2: Comparar las concentraciones y tamaños de las fracciones lipoproteícas en distintos grupos de estudio con riesgo cardiovascular (RCV) y correlacionarlos con marcadores de RCV clásicos. Objetivo 3: Valorar la utilidad de la concentración y el tamaño de las lipoproteínas VLDL e IDL para clasificar pacientes con distinto RCV. Se obtienen las siguientes conclusiones: Conclusión 1: Los valores del diámetro medio de partícula LDL son inferiores en hombres frente a mujeres sugiriendo un predominio de partículas LDL pequeñas y densas en éstos, con un mayor RCV asociado. El diámetro medio de partícula LDL se correlacionan con los niveles de triglicéridos y Apo B positivamente y de forma negativa con los niveles del colesterol HDL. El sistema de determinación de subfracciones de lipoproteínas Lipoprint es un método adecuado para su utilización en la práctica clínica habitual. Conclusión 2: La presencia de obesidad, diabetes tipo 1 e hipertensión arterial no se asocian con ningún perfil lipídico concreto. La diabetes tipo 2 presenta una asociación positiva e independiente de la presencia de otras situaciones clínicas con los niveles del colesterol VLDL, el diámetro medio de partícula IDL y el RCV. La presencia de síndrome metabólico en la población se encuentra asociado a unos mayores niveles de colesterol VLDL. Conclusión 3: El diámetro medio de partícula IDL ha demostrado ser útil en el despistaje de RCV, según tablas de riesgo SCORE, empleando el punto de corte de 309 Å con un VPN de 78,8%. Además este VPN aumenta hasta el 84,6% cuando la población que se evalúa no presenta síndrome metabólico. El diámetro medio de partícula IDL ha demostrado ser útil en el despistaje de RCV, según tablas de riesgo Framingham, empleando el punto de corte de 310 Å con un VPN de 87,7%. Además este VPN aumenta hasta el 89,6% cuando la población que se evalúa no presenta síndrome metabólico. The first cause of death in our country is due to the so-called cardiovascular diseases. It is estimated that in 2030 will die about 23.3 million people due to cardiovascular diseases and is expected to remain the leading cause of death worldwide. The different lipoproteins subfractions were determined with Lipoprint system (Quantimetrix Corporation) in a population of 166 patients of a health centre in the Region of Murcia. We consider the objectives sketch out below: Objective 1: To assess Lipoprint method (Quantimetrix Corporation) for quantifying and separation by size of lipoprotein subfractions. Objective 2: Compare the concentrations and sizes of fractions lipoprotein in different groups of study with cardiovascular risk (CVR) and correlate them with classic markers of CVR. Objective 3: Rating the usefulness of the IDL and VLDL lipoproteins concentration and size to classify patients with different CVR. The following conclusions were obtained: Conclusion 1: The average LDL particle diameter values are lower in men front women suggesting a small and dense LDL particles prevalence and a greater CVR associated. The average LDL particle diameter is positively correlated with triglycerides and Apo B levels and negatively with HDL cholesterol levels. Determination of lipoproteins subfractions with Lipoprint system is suitable for use in routine clinical practice. Conclusion 2: Obesity, type 1 diabetes and arterial hypertension presence are not associated with any particular lipid profile. Type 2 diabetes presents a positive and independent of the presence of other clinical situations association with VLDL cholesterol levels, the average IDL particle diameter and CVR. The metabolic syndrome presence in the population is associated with increased VLDL cholesterol levels. Conclusion 3: The average IDL particle diameter has proved useful in screening CVR, according to SCORE risk tables, using the cut-off point of 309 Å with a NPV from 78.8%. In addition this NPV increases up to 84.6% in metabolic syndrome absent people. The average IDL particle diameter has proved useful in screening CVR, according to Framingham risk tables, using the cut-off point of 310 Å with a NPV of 87.7%. In addition, this NPV increases to 89.6% in metabolic syndrome absent people.
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    Influencia de distintos glúcidos y lípidos en la dieta sobre aspectos del metabolismo lipídico en la rata
    (2012-11-29) López Jiménez, José Ángel; Zamora Navarro, Salvador; Universidad de Murcia. Departamento de Fisiología y Farmacología
    Cuando se utilizan dietas isocalóricas, la modificación del tipo de grasa o el tipo de azúcar, no influye sobre el crecimiento, ni la ingesta, incluso cuando los glúcidos simples alcanzan valores del 30%. Solo en el caso de que el glúcido sea sacarosa se produce una disminución de la ingesta y del crecimiento, poniéndose de manifiesto un efecto negativo no solo a nivel metabólico, sino también del apetito, posiblemente a través de receptores intestinales, la existencia de una secuencia de … [+]acontecimientos que se relacionan con los ácidos grasos, que les confiere una regulación muy precisa y, no solo, no se descarta, sino que parece confirmarse, que en parte esta regulación se produzca a nivel genético y bien directamente o indirectamente (sistemas enzimáticos, vías metabólicas, etc.), los ácidos grasos que conforman el perfil plasmático son muy constantes con independencia de las características de la grasa de la dieta, siendo este el principal factor que produce algunas modificaciones, pero no de forma definitiva.
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    Interacción de compuestos antitumorales con membranas lipídicas : su impacto en la terapia del cáncer
    (Universidad de Murcia, 2023-05-17) Aranda Serna, Elisa; Aranda Martínez, Francisco José; Pérez Cárceles, María Dolores; Facultades, Departamentos, Servicios y Escuelas::Escuelas::Escuela Internacional de Doctorado
    El cáncer es una de las principales causas de muerte a escala mundial y su incidencia aumentará de forma importante en los próximos años. La quimioterapia, uno de los tratamientos más importantes contra el cáncer, utiliza compuestos químicos para reducir o destruir las células cancerosas, pero desafortunadamente también afecta a los tejidos normales causando efectos secundarios nocivos. Los antitumorales tienen que atravesar las membranas celulares para producir sus efectos. Las interacciones de los antitumorales con la membrana pueden afectar a su composición y función, por lo que la comprensión del mecanismo de estas interacciones representa un ámbito de investigación de interés básico. Existen evidencias de la participación de los lípidos en la regulación de la actividad de las proteínas de membrana y del funcionamiento de la célula y se han propuesto terapias basadas en la regulación de la estructura de los lípidos de la membrana para controlar los eventos moleculares que se producen durante el proceso canceroso. Desde esta perspectiva, la interacción de los antitumorales con la membrana adquiere una importancia fundamental. Docetaxel (DTX) es un taxano antitumoral que se utiliza en el tratamiento de un amplio espectro de tipos de cáncer y que origina graves efectos secundarios. Las catequinas del té han mostrado diversos efectos beneficiosos sobre el cáncer en humanos. Trimetoxibenzoato de catequina (TMBC) es un análogo semisintético que presenta una alta actividad antiproliferativa frente a células de melanoma y de cáncer de mama. Objetivos y metodología En esta tesis doctoral se estudia la interacción a escala molecular de los antitumorales DTX y TMBC con bicapas lipídicas formadas por importantes fosfolípidos de membrana (fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol y fosfatidiletanolamina). El objetivo general es determinar la alteración que estos antitumorales producen en las propiedades estructurales de la membrana, para intentar comprender la relación entre estas interacciones y sus mecanismos de acción. Se utilizaron membranas biomiméticas y se emplearon técnicas biofísicas de calorimetría diferencial de barrido, difracción de rayos X, espectroscopía de infrarrojo y polarización de fluorescencia, junto con simulaciones de dinámica molecular. Resultados y conclusiones La miscibilidad de DTX es muy baja en membranas de fosfatidilcolina, este antitumoral aumenta el grosor de la bicapa, deshidrata la interfase acuosa y se agrega en la zona media de la empalizada lipídica acercándose a la zona interfacial. La catequina TMBC se incorpora fácilmente en membranas de fosfatidilserina, de fosfatidilglicerol y de fosfatidiletanolamina, ocasionando una disminución del grosor de la bicapa y un aumento de los enlaces de hidrógeno en la interfase acuosa. La catequina induce interdigitación en membranas de fosfatidilserina en fase gel, localizándose mayoritariamente en la empalizada fosfolipídica como monómeros. En membranas de fosfatidilglicerol, la catequina presenta inmiscibilidad tanto en fase gel como en fase fluida y se organiza preferentemente en agregados. En membranas de fosfatidiletanolamina, TMBC impulsa la estabilización de la fase líquido cristalina bloqueando la formación de estructuras no lamelares y se localiza en la parte superior de la empalizada lipídica formando pequeñas agrupaciones que afectan al perfil de presión lateral de la membrana de fosfatidiletanolamina. Los dos antitumorales perturban las propiedades físicas de la membrana originando perturbaciones importantes que podrían alterar su función. Estos resultados apoyan la hipótesis de que los antitumorales, además de tener efectos concretos sobre dianas celulares específicas, pueden tener también efectos inespecíficos causados por su interacción con la membrana, cuyas consecuencias dependerán de la composición y organización de los lípidos y de las proteínas presentes en la membrana de las células particulares. Estos resultados ayudan a comprender la relación entre la interacción de los antitumorales con la membrana y sus acciones anticancerígenas y otras actividades biológicas tanto tóxicas como beneficiosas.
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    Nuevos aspectos moleculares de la transducción de la señal luminosa en la bacteria Myxococcus xanthus
    (Universidad de Murcia, 2020-12-21) Pajares Martínez, Elena; Elías Arnanz, Montserrat; Iniesta Martínez, Antonio Ángel; Escuela Internacional de Doctorado
    La bacteria Myxococcus xanthus dispone de dos mecanismos para regular la síntesis de carotenoides, unos pigmentos que protegen a las células del estrés foto-oxidativo derivado de la producción de oxígeno singlete (1O2) en la luz: uno dependiente de B12 y otro independiente de B12. La transducción de la señal luminosa en la ruta de regulación independiente de B12 depende de la proteína CarF y la pareja de factores σ-ECF (extracytoplasmic function)/anti-σ CarQ/CarR. CarF, el elemento proteico que actúa más temprano en dicha ruta, no se asemeja a ningún fotorreceptor de luz azul conocido. Curiosamente, presenta similitud de secuencia con las proteínas eucarióticas de función desconocida denominadas TMEM189 o Kua (también presentes en humanos). Se desconoce cómo CarF contribuye a la detección de la presencia de 1O2 y de qué manera transduce dicha señal a CarR para provocar su inactivación (quizá mediante proteólisis dependiente de luz) y la liberación de CarQ. La similitud, aunque baja, entre CarF y algunas hidroxilasas y desaturasas de ácidos grasos sugiere que su papel en la carotenogénesis podría estar relacionado con algún cambio en la composición de ácidos grasos de la membrana. Además, dado que CarF interacciona con CarR y CarR con CarQ, las tres proteínas podrían constituir un complejo multiproteico de señalización en la membrana que podría estar asociado a los denominados microdominios funcionales de membrana (FMMs) (análogos a las balsas lipídicas de eucariotas) y que se caracterizan por la presencia de unas proteínas, las flotilinas, que les confieren consistencia y estabilidad. Se desconoce si, aparte de la respuesta carotenogénica, M. xanthus pone en marcha otros mecanismos para paliar el estrés provocado por la luz, que conlleven cambios en la expresión génica, más allá de los ya conocidos. En este trabajo se ha demostrado que CarF presenta una localización membranal en M. xanthus y que se requiere en la respuesta a la luz a través de la síntesis de unos fosfolípidos particulares, los plasmalógenos. Concretamente, CarF es la desaturasa, buscada durante décadas, encargada de generar el enlace vinil éter de los plasmalógenos, que son esenciales en la respuesta a la luz (a diferencia de sus precursores con enlace éter). Además, se ha profundizado en el estudio de otras proteínas (ElbD y MXAN_1676), previamente relacionadas con la síntesis de lípidos éter, demostrando que también están implicadas en la respuesta a la luz, participando en los pasos previos a la generación del enlace vinil éter. El análisis de la localización subcelular y mecanismo de inactivación de CarR ha revelado que dicha proteína se encuentra en la membrana tanto en oscuridad como en luz, y que su inactivación no parece llevarse a cabo mediante un proceso de proteólisis dependiente de luz. El estudio de la presencia de FMMs en M. xanthus y su posible relación con la respuesta a la luz ha puesto de manifiesto que M. xanthus presenta dos posibles flotilinas, con los dominios característicos de estas proteínas y una distribución subcelular similar a otras flotilinas, como las de Bacillus subtilis, formando “parches proteicos” en la membrana. Además, los resultados de este trabajo muestran que CarR se localiza preferentemente en la fracción membranal que suele estar enriquecida en FMMs. Por otro lado, los estudios de expresión global (microarrays y RNA-seq) han permitido identificar nuevos genes (dependientes e independientes de CarQ) implicados en la respuesta a la luz en M. xanthus, que forman parte de mecanismos relacionados con la defensa y regulación frente al 1O2 producido por el estrés foto-oxidativo. Esto sugiere que existen otras vías de percepción y respuesta a la luz, probablemente derivadas del estrés oxidativo generado tras la exposición continuada a la luz.
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    Variation in serum lipids and minerals determined during different productive periods in fasted goats
    (Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1994) Sotillo Mesanza, Juan; Montes Cepeda, Ana María; Benedito, J.L.; Bruss, M.; Cerón Madrigal, José Joaquín; Facultad de Veterinaria