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    Aportaciones al estudio de la inseminación artificial cunícola : estacionalidad y conservación seminal / Silvia Martínez Miró ; directores Jorge Roca Aleu, Juan María Vázquez Rojas.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Veterinaria, Departamento de Patología Animal,, 1998) Martínez Miró, Silvia; Vázquez Rojas, Juan María; Roca Aleu, Jorge
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    Criopreservación espermática en la especie porcina : optimización de la técnica
    (2014-06-04) Martínez Alborcia, María José; Roca Aleu, Jorge; Parrilla Riera, Inmaculada; Facultad de Veterinaria
    La inseminación artificial (IA) es una biotecnología ampliamente utilizada en la industria porcina, jugando un papel fundamental en la mejora de la productividad. Idealmente, los programas de IA en porcino, deberían utilizar espermatozoides congelados-descongelados dadas las ventajas adicionales que poseen en comparación con el semen refrigerado, en particular las relacionadas a la bioseguridad y comercio internacional. Sin embargo, los espermatozoides congelados-descongelados se utilizan con poca frecuencia en los programas de IA porcina comerciales debido a su menor eficiencia con respecto al semen refrigerado, ya que se requieren más espermatozoides por dosis de IA alcanzando por lo general peores resultados de fertilidad. La razón biológica de este hecho está relacionada con la gran sensibilidad de los espermatozoides porcinos a la criopreservación. Además, los espermatozoides que sobreviven a dicho proceso, poseen una vida funcional más corta. El principal objetivo de esta Tesis es el de optimizar el protocolo de criopreservación de espermatozoides de porcino con el fin de mejorar la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación. Para ello, se han desarrollado los siguientes estudios. En el primer estudio, se evaluó el impacto de los espermatozoides no funcionales presentes en los eyaculados de porcino sobre la capacidad de los espermatozoides funcionales para soportar el proceso de criopreservación. Para ello, se congelaron 15 fracciones ricas (FR) de 5 machos fértiles con diferentes proporciones de espermatozoides no funcionales (0- muestra de semen nativa, 25, 50 y 75 %). Tras la descongelación, se evaluaron los espermatozoides mótiles y viables que se recuperaron, así como la funcionalidad espermática en términos de fluidez de membrana de plasmática y producción intracelular de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS) en condiciones de capacitación in vitro. Además, se evaluó la peroxidación lipídica de la membrana plasmática mediante la medición indirecta de la producción de malondialdehído (MDA). Tanto la motilidad (evaluada mediante sistema CASA) como la viabilidad espermática normalizadas (evaluada mediante citometría de flujo y triple tinción de los espermatozoides con Hoechst 33342, H-42; yoduro de propidio, PI, y aglutinina de cacahuete conjugado con fluoresceína, PNA-FITC) fueron menores (p<0’01) cuanta mayor proporción de espermatozoides no funcionales había en las muestras seminales antes de la congelación, independientemente del verraco. Sin embargo, la magnitud del efecto fue diferente (p<0’01) entre los verracos. Las muestras de semen con la mayor subpoblación de espermatozoides no funcionales antes de la congelación mostraron los mayores (p<0’01) niveles de MDA tras la descongelación. En cuanto a la funcionalidad de los espermatozoides supervivientes a la descongelación, la muestra con 75 % de espermatozoides no funcionales antes de la congelación tuvo una generación intracelular de ROS (evaluada con 5-(y-6) clorometil-20,70-dichlorodihydrofluorescein éster acetil diacetato; CM-H2DCFDA) más alta (p<0’01) y un aumento (p<0’01) de la fluidez de la membrana espermática (Merocianina 540, M540) con respecto a la muestra control. El objetivo del segundo estudio fue determinar si los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen antes y durante la congelación influyen en la capacidad de fertilización in vitro (FIV) de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. Usando el mismo diseño experimental que en el estudio anterior, se prepararon y criopreservaron 4 muestras de semen procedentes de 15 FR con las mismas proporciones de espermatozoides no funcionales. Tras la descongelación, las muestras seminales fueron centrifugadas con PorciPureTM. La concentración (evaluada usando un Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) y viabilidad espermática (evaluada del mismo modo que en el estudio anterior) de cada pellet de espermatozoides fueron evaluadas para calcular la cantidad de espermatozoides viables totales en cada muestra de semen tras la centrifugación. La funcionalidad de los espermatozoides, en términos de generación intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear (Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), se evaluó antes y después de la centrifugación con el gradiente de PorciPureTM en condiciones de capacitación in vitro. La capacidad de FIV espermatozoides supervivientes al proceso de criopreservación se evaluó se evaluó de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma) y del desarrollo embrionario. Un total de 1.041 ovocitos madurados in vitro fueron inseminados utilizando un número fijo de espermatozoides viables purificados con PorciPureTM (ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1), independientemente de los diferentes porcentajes de espermatozoides no funcionales de las muestras. El desarrollo embrionario se evaluó a los 2 y 7 días después de la inseminación mediante la tasa de división (porcentaje de ovocitos divididos a 2-4 células/total cigotos putativos cultivados) y la formación de blastocistos (porcentaje de blastocistos/total cigotos putativos cultivados), respectivamente. El número total de células de los blastocistos resultantes se evaluó por tinción de los blastocistos con H-42. Los resultados revelaron que una alta proporción de espermatozoides no funcionales en muestras de semen antes y durante la congelación inducen un aumento (p <0’001) de la generación de intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear en espermatozoides congelados-descongelados. Estos cambios funcionales resultaron en bajas proporciones (p <0’01) de ovocitos penetrados y embriones desarrollados in vitro. En el tercer estudio, se evaluó la eficacia de la selección de espermatozoides usando un gradiente de centrifugación de una sola capa (Single Layer Centrifugation; SLC) antes de la congelación sobre la supervivencia espermática. Para ello, 24 FR recogidas de 24 verracos, se dividieron en 2 grupos en función de sus características seminales iniciales (concentración, morfología, motilidad y viabilidad espermática): estándar (n = 15) y sub-estándar (n = 9). Las muestras seminales de cada FR se dividieron en 2 alícuotas, una permaneció sin tratar (muestras control) y la otra se centrifugó con el gradiente de una sola capa (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 mL de Androcoll-P-Large® (muestras SLC). El rendimiento de espermatozoides totales, motiles (evaluados mediante CASA) y viables (evaluados mediante citometría como se mencionó anteriormente) después de SLC fue mayor (p<0’05) en las muestras estándar que en las sub-estándar. Las muestras de semen fueron criopreservadas. Tras la descongelación, la motilidad y viabilidad espermáticas fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control, independientemente de las características iniciales eyaculado. Además, los espermatozoides descongelados de las muestras SLC fueron más resistentes (p<0’05) a la peroxidación lipídica (Bioxytech MDA - 586 Kit de ensayo) que los de las muestras de control. El tratamiento con SLC también influyó en la funcionalidad de los espermatozoides descongelados bajo condiciones de capacitación in vitro. El porcentaje de espermatozoides viables que mostraron alta fluidez de membrana fue menor (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control. Los espermatozoides descongelados de las muestras SLC generaron menor (p<0’05) cantidad de ROS que los de las muestras control en los eyaculados sub-estándar. El objetivo del cuarto estudio experimental fue el de evaluar la idoneidad y eficacia de SLC, empleando el coloide Androcoll-P-XL®, como un procedimiento de rutina para la selección de los espermatozoides funcionales de los eyaculados de porcino para la criopreservación. Trece FR (una por verraco) se dividieron en tres alícuotas. Dos alícuotas de 15 y 150 mL se centrifugaron (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 y 150 mL (v/v) de Androcoll-P-Large® y Androcoll-P-XL®, respectivamente. La tercera alícuota se mantuvo sin procesa (control). Tras la centrifugación, los porcentajes de espermatozoides morfológicamente normales y con motilidad rápida y progresiva (CASA) fueron mayores (p<0’01) tras en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll -P® utilizado. Sin embargo, el porcentaje de espermatozoides con ADN nuclear fragmentado fue menor (p<0’01) en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll-P® utilizado. Las tasas de recuperación de espermatozoides totales, mótiles, viables y morfológicamente normales oscilaron entre el 20 y 100 %, mientras que los porcentajes de espermatozoides con ADN nuclear intacto oscilaron entre el 60 y 100 %, con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la SLC, las muestras espermáticas fueron criopreservadas. Tras la descongelación, los porcentajes de espermatozoides mótiles, viables y con ADN nuclear intacto, fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en el control con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la descongelación, se inseminaron 679 ovocitos madurados in vitro con un ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1. La SLC también mejoró (p<0’01) la capacidad de FIV de los espermatozoides congelados-descongelados, evaluada de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma). Sin embargo, no hubo ningún efecto de SLC sobre capacidad in vitro de los cigotos putativos para desarrollar a blastocistos. Tras todo lo anteriormente expuesto, podemos concluir que: Los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen de porcino antes de la congelación influyen negativamente en la congelabilidad de los espermatozoides funcionales. Lo cual se evidencia por una reducción en la proporción de espermatozoides funcionales recuperados tras la descongelación y por una menor capacidad fecundante y habilidad para desarrollar embriones in vitro por los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. La selección espermática mediante el gradiente de centrifugación de una sola capa Androcoll-P® utilizado antes de la congelación, mejora la congelabilidad espermática y la capacidad fecundante de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. Artificial insemination (AI) is extensively used by swine producers worldwide, playing a pivotal role in the improvement of herd productivity. Ideally, swine AI-programs should use frozen-thawed (FT) sperm, given its additional advantages compared to liquid-stored semen, particularly those concerning international trade and biosecurity. However, FT-sperm are infrequently used in commercial swine AI programs because of their lower efficiency with respect to liquid-stored semen; more FT-spermatozoa are required per AI dose to achieve typically lower fertility outcomes. The biological reason for the large number of spermatozoa required per AI dose is related to the high cryosensitivity of boar spermatozoa. In addition, the spermatozoa that survive the cryopreservation process exhibit an impaired and shortened functional lifespan. Therefore, this thesis was designed to optimize the boar sperm cryopreservation protocol in order to improve the sperm survival after thawing. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the impact of non-functional spermatozoa on the cryopreservation success of functional spermatozoa was assessed. Fifteen sperm-rich ejaculate fractions (SREF) collected from 5 fertile boars were frozen (following a standard 0.5-mL straw freezing protocol) with different proportions of induced non-functional sperm (0-native semen sample-, 25, 50 and 75% non-functional spermatozoa). After thawing, the recovery of motile and viable spermatozoa was assessed, and the functional of the spermatozoa was evaluated from plasma membrane fluidity and intracellular reactive oxygen species (ROS) generation upon exposure to capacitation conditions. In addition, the lipid peroxidation of the plasma membrane was assessed by the indirect measurement of malondialdehyde (MDA) generation. The normalized (with respect to a native semen sample) sperm motility (assessed by CASA) and viability (cytometrically assessed after staining with Hoechst 33342, H-42; propidium iodide, PI; and fluorescein-conjugated peanut agglutinin, PNA-FITC) decreased (p<0.01) as the proportion of functional spermatozoa in the semen samples before freezing decreased, irrespective of the semen donor. However, the magnitude of the effect differed (p<0.01) among boars. Moreover, semen samples with the largest non-functional sperm subpopulation before freezing showed the highest (p<0.01) levels of MDA after thawing. The thawed viable spermatozoa of semen samples with a high proportion of non-functional spermatozoa before freezing were also functionally different from those of samples with a low proportion of non-functional spermatozoa. These differences consisted of higher (p<0.01) levels of intracellular ROS generation (assessed with 5-(and-6) chloromethyl-20,70-dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester; CM-H2DCFDA) and increased (p<0.01) membrane fluidity (assessed with Merocyanine 540, M540). The objective of the second study was to evaluate the impact of non-functional spermatozoa on the in vitro fertilization (IVF) ability of FT-spermatozoa. Using the same experimental approach as the previous study, 4 sperm semen samples from 15 SREF with the same different proportions of induced non-functional sperm were also prepared and cryopreserved following the protocol indicated above. After thawing, the semen samples were centrifuged with PorciPureTM Bottom Layer. The sperm concentration (measured using a Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) and viability (as indicated in the previous study) of each sperm pellet were assessed to calculate the total viable sperm count in each semen sample. The functionality of the spermatozoa, in terms of intracellular ROS generation and nuclear DNA fragmentation (sperm chromatin dispersion test; Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), was assessed before and after the PorciPureTM centrifugation gradient in sperm samples incubated under capacitating conditions. The IVF ability of cryosurviving spermatozoa was assessed according to oocyte fertilisation (2 pronuclei and a sperm tail inside of the ooplasm) and embryo development. A total of 1,041 in vitro-matured oocytes were inseminated using a fixed number of PorciPureTM-purified viable spermatozoa (viable sperm: oocyte ratio of 300:1), regardless of the differing percentages among the 4 semen samples (native, 25 %, 50 %, and 75 % non-functional spermatozoa). Embryo development was evaluated at 2 and 7 days after insemination by the assessment of the cleavage rate (percentage of oocytes divided to 2–4 cells/total putative zygotes cultivated) and blastocyst formation (percentage of blastocyst/total putative zygotes cultivated), respectively. The total cell number of the resulting blastocysts was evaluated by staining the blastocysts with H-42. The results revealed that high proportions of dead spermatozoa in raw semen samples before and during freezing induce (p<0.001) increased ROS generation and nuclear DNA fragmentation in frozen-thawed spermatozoa. These dysfunctional changes resulted in low ratios (p<0.01) of in vitro penetrated oocytes and healthy developing embryos. The effectiveness of sperm selection using single-layer centrifugation (SLC) prior to freezing on the sperm cryosurvival of boar ejaculates was evaluated in the third study. Twenty-four SREF, collected from 24 boars, were divided into 2 groups according to their initial semen traits: standard (n=15) and substandard (n=9). Semen samples from each SREF were split in 2 aliquots, one remained untreated (control samples) and the other was single-layer centrifuged (500 g for 20 min) using 15 mL of Androcoll-P-Large® (SLC-samples). The yield of total, motile (assessed by CASA) and viable (cytometrically evaluated as mentioned above) sperm after SLC was higher (p<0.05) in standard than substandard semen samples. The semen samples were cryopreserved using a standard 0.5-mL straw freezing protocol. Post-thaw sperm motility and viability were higher (p<0.05) in SLC than in control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Additionally, thawed spermatozoa from SLC samples were more resistant (p<0.05) to lipid peroxidation (BIOXYTECH MDA-586 Assay Kit) than those from control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. The SLC-treatment also influenced the functionality of thawed spermatozoa undergoing an in vitro capacitation process. The percentage of viable sperm showing high membrane fluidity (assessed with M540) was lower (p<0.05) in the SLC than in the control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Thawed viable spermatozoa of SLC samples generated less (p<0.05) reactive oxygen species (assessed with CM-H2DCFDA) than those of control samples in the substandard ejaculates. The objective of the fourth experimental study was to evaluate the suitability and effectiveness of SLC as a routine procedure for selecting boar spermatozoa for cryopreservation. Thirteen sperm rich ejaculate fractions (one per boar) were split into three aliquots. Two aliquots of 15 and 150 mL were SLC-processed (500 g for 20 min) using 15 and 150 mL (v/v) of Androcoll-P-Large® and Androcoll-P-XL®, respectively. The third aliquot remained un-processed as a control. The percentages of spermatozoa that were morphologically normal and showed rapid and progressive motility (assessed by CASA) spermatozoa were higher (p<0.01) and those with fragmented nuclear DNA were lower (p<0.01) after SLC than control semen samples, regardless of the Androcoll-P® used. The recovery rates of total, motile, viable (flow cytometric evaluated after staining with H-42, PI and FITC-PNA) and morphologically normal spermatozoa ranged between 20 and 100% and those with intact nuclear DNA ranged between 60 and 100%, irrespective of the Androcoll-P® used. Thereafter, the semen samples were cryopreserved as mentioned above. Post-thaw percentages of sperm motility, viability and intact nuclear DNA were higher (p<0.05) in SLC-processed than in control semen samples, irrespective of the Androcoll-P® used. SLC-processing also improved (p<0’01) the IVF ability of FT-sperm (679 in vitro matured oocytes inseminated with a viable sperm:oocyte ratio of 300:1 following the same procedure mentioned above), measured as the percentage of penetrated oocytes and the mean number of swollen sperm heads and/or male pronuclei in penetrated oocytes. However, there was no effect of SLC-processing on the in vitro ability of putative zygotes to develop to blastocysts. The results achieved in these four experimental studies have generated the following conclusions: Non-functional spermatozoa present in boar semen samples before freezing negatively influence the cryopreservation of functional spermatozoa by reducing the proportion of recovered surviving spermatozoa after thawing and also by altering the functional and fertilisation ability of the sperm that survive the cryopreservation process. Single Layer Centrifugation prior to freezing improves the boar sperm cryopreservation and post-thaw fertilisation ability of cryosurvival spermatozoa. However, further studies aimed at optimising the yield of SLC procedure are needed.
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    Efecto antioxidante del glutatión aplicado en el medio de descongelación seminal de tres especies de interés pecuario
    (2016-01-25) Gumbao Baño, David; Gadea Mateos, Joaquín; Departamento de Fisiología
    El uso de muestras seminales criopreservadas es muy habitual en la reproducción asistida humana y de animales con interés en ganadería, así como en la conservación de razas y especies en peligro de extinción. Sin embargo, la congelación y descongelación de muestras seminales implica alteraciones en la membrana y en el ADN del espermatozoide, procesos de apoptosis y modificaciones asociadas al estrés oxidativo (Polge y Jakobsen, 1959; Pursel y Johnson, 1975; Holt, 2000; Thomson et al. 2009). Los espermatozoides y las células del sistema reproductor masculino presentan sistemas de defensa frente a los radicales libres (Sies, 1993). En este contexto, el glutatión es uno de los antioxidantes más ubicuos e importantes en los sistemas biológicos (Gadea et al., 2005). Sin embargo, en ocasiones tiene lugar una producción excesiva de radicales libres, un detrimento en la capacidad total antioxidante o ambas situaciones a la vez. Esta circunstancia implica un desbalance denominado “estrés oxidativo” (Sies y Cadenas, 1985). La adición de antioxidantes a los medios de congelación y descongelación seminal es una alternativa frente al estrés oxidativo (Agarwal et al, 2013). El objetivo principal de esta Tesis fue evaluar el efecto antioxidante del GSH aplicado al medio de descongelación, sobre muestras seminales procedentes de tres especies de mamíferos con importancia en ganadería (porcina, bovina y caprina). En el primer trabajo (Experiencia 1) se evaluó el efecto de la adición de diferentes concentraciones de GSH (1 mM y 5 mM) al medio de descongelación de semen porcino. Las técnicas aplicadas incluyeron el análisis computarizado de imagen (CASA), citometría de flujo y ensayos de fecundación in vitro. En los resultados se observó una reducción en el número de espermatozoides viables capacitados, el número de espermatozoides con cambios en los grupos sulfhidrilo de sus proteínas de membrana, la producción de ERO y la condensación de la cromatina. Se obtuvo un incremento en el número de ovocitos penetrados y en la proporción de cabezas espermáticas descondensadas. Sin embargo, no se evidenció cambio alguno en los parámetros de movilidad evaluados con CASA. En el segundo trabajo (Experiencia 2), desarrollado en bovino, se realizaron ensayos similares a los de la experiencia 1 y se incluyeron nuevos análisis centrados en el estudio del ADN espermático, mediante las técnicas de TUNEL y SCSA. Además, se evaluaron los resultados de las técnicas de fecundación in vitro y desarrollo embrionario.. La adición de GSH supuso un incremento en el número de espermatozoides viables no capacitados, en el porcentaje de penetración y desarrollo embrionario in vitro. Se obtuvo un descenso en la producción de ERO y la fragmentación del ADN. No se observó mejoría en los parámetros de movilidad (CASA) y de reacción acrosómica. El último trabajo (Experiencia 3) tuvo lugar en caprino y fue diseñado con el objetivo de saber si la presencia de la forma reducida (GSH) y/o oxidadada del glutatión (GSSG) en el medio de descongelación tenía algún efecto sobre la funcionalidad espermática. Los ensayos incluyeron la valoración por CASA y citometría de flujo. La adición de GSH supuso un incremento en la movilidad y viabilidad espermática, el número de espermatozoides viables no capacitados y con membrana acrosomal intacta. Se observó una reducción en la producción de ERO y la condensación de la cromatina. A diferencia de lo ocurrido con GSH, la adición de GSSG no reveló efecto alguno sobre los parámetros seminales evaluados Estos trabajos demuestran que la adición de GSH al medio de descongelación seminal mejora los parámetros seminales y la fertilidad de las muestras. SUMMARY Sperm cryopreservation is widely used in assisted reproduction procedures in humans and in animals, such us domestic livestock and endangered species. Although being the most effective method for the maintenance of seminal samples on a long term, cryopreservation has negative effect on semen quality and fertility (Aitken et al., 2004), because of the temperature drops and osmotic changes (Polge & Jakobsen, 1959). In addition to changes in the plasma membrane and in DNA of spermatozoa. (Pursel & Johnson, 1975; Holt, 2000). The spermatozoa and other masculine reproductive cells have different defense systems against free radicals, including antioxidant enzymatic and non-enzymatic defenses (Sies, 1993). In some conditions, an excess on the production of free radicals, a diminished antioxidant capacity or both situations can lead to an imbalanced condition called “oxidative stress” (Sies & Cadenas, 1985). Supplementation of antioxidants in the freezing and thawing media is an alternative against oxidative stress (Agarwal et al, 2013) In this sense, glutathione is one of the most ubiquitous and important antioxidants in the biological systems. (Gadea et al., 2005). The main aid of this thesis was to evaluate the antioxidant effect of GSH when added to the thawing solution in seminal samples from three species with importance in livestock. In the first study (Experiment 1) it was evaluated the addition of 3 different concentrations of GSH (1 mM and 5 mM) to the thawing solution of board semen, with an incubation time of 0 and 30 minutes. The techniques used were computer assisted sperm analysis CASA, flow cytometry and in vitro assays. The results obtained support the hypothesis, the presence of GSH had a protective effect in some of the seminal parameters studied. It was observed a reduction in the number of capacitated viable spermatozoa, in the number of sperm with changes in sulfhydryl group content in membrane proteins, in the ERO production as well as the chromatin condensation. An increase on the number of penetrated oocytes and decondensed sperm heads was also noted. Nevertheless, there was no evidence of any change in the motility scores recorded by CASA. The second study (Experiment 2), conducted on bovine, incudes apart from the studies developed on experiment 1 new analysis on sperm DNA, by TUNEL and SCSA techniques. Furthermore, it was evaluated the results of the in vitro techniques and the embryo development in presence of GSH in the thawing solution. The collected data from Experiment 2 showed concordance with the results from Experiment 1. With the addition GSH in the thawing solution, it was observed an increase in non-capacitated viable spermatozoa, in the percentage of penetration and in vitro development. ERO production and DNA fragmentation values were reduced. No changes were observed on sperm motility (CASA) o presence of spontaneous acrosome reaction. The third study (Experiment 3) on caprine, was designed with the propose of knowing if the presence of GSH 1 mM and 5 mM or GSSG 2.5 mM in the thawing media has any effect on sperm motility and sperm functionality. This assay included CASA evaluation and flow cytometry. In this case, the samples were incubated 30 and 60 minutes. The collected results demonstrated and increase on motility and sperm viability, in the number of non- capacitated viable spermatozoa and spermatozoa with acrosome membrane untouched. A reduction on the ERO production and on the condensation of chromatin was also observed. Opposite to GSH, the addition of GSSG did not show any effect on the evaluated seminal parameters independent to the exposure time. These studies demonstrate that the addition of GSH to the thawing media improves seminal parameters and fertility on the samples studied.
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    Estrategias para mejorar la fertilidad y prolificidad del semen criopreservado en la especie porcina utilizando la inseminación intrauterina profunda = Strategies for enhancing the fertility and prolificacy of cryopreserved boar spermatozoa by using deep intrauterine insemination
    (2013-01-15) Bolarín Guillén, Alfonso; Roca Aleu, Jorge; Martínez García, Emilio Arsenio; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Medicina y Cirugía Animal
    Con el objetivo de mejorar la eficiencia reproductiva de los espermatozoides criopreservados (EC) de porcino, se realizaron 6 experimentos de campo (877 cerdas) para (1) reducir el número de EC por dosis de inseminación artificial (IA) y (2) precisar factores que expliquen la variabilidad entre granjas en la fertilidad de EC. Los resultados demostraron que (1) la fertilidad de EC depende más del intervalo inseminación-ovulación que del número de EC por dosis de IA, alcanzándose alta fertilidad inseminando dentro de las 4-8 h previas a la ovulación con 1.000 x 106 de EC depositados mediante inseminación intrauterina profunda. (2) La variabilidad entre granjas en la fertilidad de EC estaría relacionada con diferencias en el intervalo inseminación-ovulación entre granjas. (3) Las diferencias entre estaciones en la fertilidad de EC (menor en verano-otoño que en invierno-primavera) estaría relacionada con diferencias en el intervalo inicio del estro-ovulación entre ambos periodos del año. PALABRAS CLAVE: Porcino, espermatozoides criopreservados, inseminación intrauterina profunda, ecografía trans-rectal, ovarios, folículos pre-ovulatorios, ovulación, estacionalidad. With the aim of improving reproductive efficiency of boar cryopreserved spermatozoa (CE), 6 field experiments were performed (877 sows) in order to (1) reduce the number of CE per artificial insemination (AI) dose, and (2) determine factor that may explain the variability found between farms in fertility of CE. Results showed that (1) fertility of CE is more influenced by the insemination-ovulation interval rather than by the number of CE per insemination dose, attaining high fertility in inseminations within 4-8 h before ovulation with 1.000 x 106 CE inseminated using deep intrauterine insemination. (2) Variability of fertility among farms with CE is related to differences in the insemination-ovulation interval between farms. (3) Differences of fertility of CE among seasons (lower in summer-autumn than in winter-spring) are related to differences in beginning of estrus-ovulation interval among both periods of the year. KEY WORDS: Swine, cryopreserved spermatozoa, intrauterine insemination, trans-rectal ultrasonography, ovary, pre-ovulatory follicles, ovulation, seasonality.
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    Influencia del tratamiento de los espermatozoides de verraco sobre su capacitación in vitro / María Isabel Alonso Bartolomé ; directores Emilio Martínez García, Juan María Vázquez Rojas.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Veterinaria, Departamento de Patología Animal,, 1995) Alonso Bartolomé, María Isabel
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    Productive output of post-cervical insemination in porcine : study of sperm selection in the female genital tract through backflow analysis = Rendimiento productivo de la inseminación post-cervical en la especie porcina : estudio de la selección espermática en el tracto genital de la hembra a través del análisis del reflujo
    (2015-09-08) Hernández Caravaca, Iván; García Vázquez, Francisco Alberto; Izquierdo Rico, María José; Facultad de Veterinaria
    El objetivo principal de este trabajo fue el estudio y rentabilidad de la aplicación de la inseminación post-cervical en granja así como el estudio de la influencia de distintas poblaciones espermáticas con diferentes características en su selección en el útero de la cerda; para ello se analizaron los espermatozoides que fueron expulsados en el reflujo tras la inseminación y aquellos que llegaron a la unión útero-tubárica. Los resultados se reflejan en la publicación de cuatro artículos. En el artículo I, los resultados mostraron que la aplicación de inseminación post-cervical tiene unos rendimientos reproductivos similares o superiores que la inseminación cervical, siendo los rendimientos mayores cuando se inseminan cerdas con 2-3 o ≥6partos.Al mismo tiempo se realizó un estudio económico detallado de la aplicación de la inseminación post-cervical en granja, siendo éste sustancialmente beneficioso al aplicar dicha técnica en comparación con la inseminación tradicional. Además, se pudo observar que tanto el volumen (%) como el número de espermatozoides (%) en el reflujo eran superiores cuando se utilizaba la inseminación cervical en relación a la post-cervical. Por otro lado, la calidad espermática se encontraba reducida en aquellos espermatozoides recogidos en el reflujo comparados con la dosis seminal inicial. En el artículo II, se evaluó la influencia de diferentes niveles de motilidad espermática en la dosis de inseminación sobre el % de cerdas con reflujo, el volumen (%), concentración espermática (%) y tipo de espermatozoides (%) (basados en sus características mótiles) recolectados en el reflujo a diferentes tiempos tras la inseminación post-cervical. Los resultados mostraron que no había diferencias en el % de cerdas que presentaban reflujo independientemente de la dosis de inseminación recibida (motilidad baja, media o alta). De la misma manera no se observaron diferencias en relación al volumen (%) y número de espermatozoides (%) entre los diferentes grupos experimentales a los distintos tiempos de recogida. Sin embargo, el % de espermatozoides de media o baja motilidad recolectados en el reflujo eran mayores que si presentaban una motilidad alta. Este hecho se observó a partir de los 16 minutos tras la inseminación, indicando un proceso de expulsión de espermatozoides aleatorio en los primeros momentos tras la inseminación (0-15 min) mientras que entre los 16-60 minutos, la eliminación espermática se correspondía a un proceso selectivo descartando en mayor medida espermatozoides con una capacidad mótil disminuida. En el artículo III, se evaluó la diferencia morfométrica entre los espermatozoides recolectados en el reflujo y en los que se encontraron en la unión útero-tubárica con aquellos que conformaban la dosis seminal de inseminación. Los resultados mostraron que el reflujo está formado por poblaciones espermáticas con una determinada dimensión y forma, siendo los de un tamaño de cabeza y longitud del flagelo menor los que tienden a ser encontrados en el reflujo. Además se comprobó que ni el fluido uterino, ni la alteración de acrosomas ni la osmolaridad estaban implicados en los cambios morfométricos. Por otro lado, se observó que el lugar de deposición espermático influía en el tamaño del espermatozoide que se recolectaba en el reflujo. Además, los datos obtenidos muestran que los espermatozoides que alcanzan la unión útero-tubárica presentan la misma longitud del flagelo que aquellos presentes en la dosis inicial de inseminación. En el artículo IV, barajamos la hipótesis de que los espermatozoides con morfoanomalías podían ser descartados o modificados por el ambiente uterino tras la deposición en el tracto genital de la hembra. Los resultados mostraron un mayor % de espermatozoides con morfoanomalías en el reflujo que en la dosis seminal y prácticamente la totalidad de la población espermática que colonizaba la unión útero-tubárica presentaban una morfología normal. Por otro lado, se observó que el fluido uterino no tenía ninguna influencia en cambios morfológicos de los espermatozoides eyaculados, sin embargo, cuando el fluido uterino se incubó con espermatozoides epididimarios se produjo una drástica reducción de las morfoanomalías. En conclusión, la presente tesis doctoral muestra que la inseminación artificial post-cervical es una técnica viable para su uso en las granjas. De hecho las ventajas obtenidas tanto a nivel reproductivo como económico son claras, siendo su implementación y aplicación a nivel de campo unarealidad. Por otro lado, se ha comprobado que los eyaculados son poblaciones heterogéneas con diversas características de motilidad, morfología y morfometría, y que estas particularidades propias de cada espermatozoide, influyen en su interacción con el tracto genital de la hembra una vez que son depositados. La mayor parte de los espermatozoides son eliminados en su trayecto hacia el lugar de fecundación, y esa discriminación parece ser un proceso selectivo o debido a modificaciones de algunas de las características propias del espermatozoide que sufren en su interacción con el útero. The main objective of this work was to study the viability of applying post-cervical insemination on the farm, as well as to the study the influence of different spermatozoa populations - with different characteristics - on the selection that takes place in the sow uterus; for this we analyzed spermatozoa which were expelled in the reflux after insemination and those which did reach the utero-tubal junction. In article I, the results showed that the use of post-cervical insemination produces a very similar or even higher reproductive yield than cervical insemination, the yield being much higher when inseminating sows with 2-3 or ≥6 births. At the same time, a detailed economic study of post-cervical insemination on the farm showed that this method produced substantially greater benefits than traditional insemination. Moreover, we were able to observe that the volume (%) as well as the number of spermatozoa (%) in the reflux was higher when using cervical insemination compared to post-cervical. On the other hand, the sperm quality was lower in those spermatozoa collected from the reflux compared to the initial insemination quality. In article II, we evaluated the influence of different levels of sperm motility in the insemination dose on the percentage of sows with reflux, the volume (%), sperm concentration (%), and type of spermatozoa (%) (based on the motility characteristics) collected from the reflux at different times after post-cervical insemination. The results showed that there were no differences in the % of sows which had reflux, regardless of the insemination dose received (low, medium or high motility). In the same way, there were no observable differences as regards the volume (%) and number of spermatozoa (%) between the different experimental groups at different times of collection. However, the % of spermatozoa of medium or low motility collected in the reflux was higher than those of higher motility. This observation was made 16 minutes after insemination, indicating the expulsion of random spermatozoa in the first moments following insemination (0-15 min), while at 16-60 minutes sperm elimination was a selective process, whereby spermatozoa with a low motility were expelled. In article III, we evaluated the morphometric differences between spermatozoa collected in the reflux and utero-tubal junction and those that formed the initial insemination dose. The results showed that the reflux was formed of sperm populations with a certain size and shape, mainly those with a small head and flagellum. It was also demonstrated that the uterine fluid, acrosome alteration and osmorality were not involved in these morphometric changes. On the other hand, we observed that the sperm deposition place was related with the size of the spermatozoa collected during reflux. Moreover, the data obtained showed that spermatozoa which reached the utero-tubal junction had the same length as those in the initial insemination dose. In article IV, we considered the hypothesis that the spermatozoa with morphoanomalies could be eliminated or modified by the uterine environment after deposition in the female genital tract. The results showed a higher % of spermatozoa with morphoanomalies in the reflux than in the seminal dose, while practically the whole spermatozoa population which colonized the utero-tubal junction had a normal morphology. Moreover, it was seen that the uterine fluid had no effect on the morphological changes that occurred in the ejaculated spermatozoa, although when the uterine fluid was incubated with epididymal spermatozoa, there was a drastic decrease in the number morphoanomalies. In conclusion, this PhD thesis shows that post cervical artificial insemination is a viable technique for use in farms, where the advantages are clear from both reproductive and economic points of view. Indeed, its implementation and application on farms is firmly established. Furthermore, we demonstrate that ejaculations are heterogeneous populations with a diverse motility, morphology and morphometry, and that these particularities - characteristics of each spermatozoon - influence any interaction with the genital tract of the female once deposited. Most spermatozoa are eliminated during their journey to the site of fecundation in what seems to be a selective process of discrimination or due to modifications in some of the characteristics of each individual spermatozoon as it interacts with the uterus.