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- PublicationOpen AccessBiomarcadores plasmáticos y urinarios en pacientes con insuficiencia cardíaca aguda. NT-proBNP y la influencia de la disfunción renal en su aclaramiento y valor pronóstico(2014-01-13) Boronat García, Miguel; Manzano Fernández, Sergio; Albaladejo Otón, Mª Dolores; Martínez Hernández, Pedro; Departamento de Bioquímica, Biología Molecular (B) e InmunologíaOBJETIVOS 1. Evaluar como influye la función renal glomerular, medida por TFGe, en la concentración de NT-proBNP urinario. 2. Evaluar la relación entre las concentraciones de marcadores bioquímicos específicos de función renal glomerular y tubular y las concentraciones de NT-proBNP, para ayudar a identificar su mecanismo de eliminación renal. 3. Evaluar el valor pronóstico de los niveles de NT-proBNP urinario y compararlo con el de NT-proBNP plasmático en pacientes con ICA. MATERIAL Y MÉTODOS Se incluyeron prospectivamente 138 pacientes consecutivos ingresados, diagnosticados de ICA, en el Hospital Virgen de la Arrixaca. Se recogieron simultáneamente muestras de sangre y orina al ingreso. Los parámetros de laboratorio medidos en suero fueron: glucosa, creatinina, urea, albúmina, sodio, ácido úrico, PCR, Troponina T, cistatina C, BTP y NT-proBNP. Y en orina: alfa-1 microglobulina, albúmina (MAU) y NT-proBNP. RESULTADOS 1. NT-proBNP plasmático y urinario fue más elevado en pacientes con un mayor deterioro de la TFGe (p<0,001). NT-proBNP plasmático correlacionó positivamente con los valores de NT-proBNP urinario (r=0,61, p<0,001) Las correlaciones TFGe - NT-proBNP también fueron significativas aunque menos potentes (r=-0,44; NT-proBNP plasmático y r=-0,37; NT-proBNP urinario, p<0,001 para ambos). TFGe, tras ajuste multivariable, tan sólo fue predictora independiente de las concentraciones plasmáticas de NT-proBNP (y de una forma débil). El principal predictor independiente de las concentraciones urinarias de NT-proBNP fue el NT-proBNP en plasma. 2. Los niveles urinarios de alfa-1 microglobulina (β = 0,50; p <0,001) y el NT-proBNP plasmático (β = 0,29; p <0,001) fueron los principales predictores independientes de los niveles de NT-proBNP urinario mientras que la creatinina, MDRD, cistatina C, BTP y MAU no alcanzaron significación estadística. 3. Los pacientes que presentaron eventos clínicos tenían una concentración plasmática superior de NT-proBNP (4.561 pg/ml [2.191-8.631] frente a 2.906 pg/ml [1.643-5.823]; p=0,03) pero su concentración urinaria de NT-proBNP fue similar (78 pg/ml [42-294] frente a 71 pg/ml [41-189]; p=0,62) en comparación con las de los pacientes que no sufrieron eventos clínicos. En los análisis de regresión de Cox univariables y multivariables, la concentración plasmática de NT-proBNP por encima de la mediana (3.345 pg/ml) se asoció a un mayor riesgo de eventos clínicos adversos (HR=2,35; IC del 95%, 1,41-3,93; p=0,001). Sin embargo, la concentración urinaria de NT-proBNP por encima de la mediana (73 pg/ml) no alcanzó significación estadística como factor predictivo del pronóstico de eventos en el análisis univariable (HR=1,2; IC del 95%, 0,79-1,96; p=0,46) CONCLUSIONES 1. El deterioro de la función renal glomerular se asocia con un aumento de las concentraciones de NT-proBNP plasmáticas y urinarias. Sin embargo, el filtrado glomerular renal no es predictor independiente de NT-proBNP urinario. 2a. NT-proBNP plasmático fue el mayor predictor de las concentraciones urinarias de NT-proBNP. Podría deberse a una mayor producción de NT-proBNP a nivel cardiaco como consecuencia del mayor estrés cardiovascular de los enfermos con afectación cardiaca y renal concomitante. 2b. Sugerimos que la presencia de disfunción tubular renal podría estar implicada en el aumento de niveles de NT-proBNP urinarios observados en pacientes con IR ya que, a diferencia de los marcadores de filtrado glomerular renal, alfa-1 microglobulina (parámetro de función tubular renal) fue predictor independiente de NT-proBNP urinario. Así, una disminución de la reabsorción de NT-proBNP a nivel del túbulo proximal favorecería un aumento de los niveles urinarios de NT-proBNP. 3. Consideramos que NT-proBNP urinario no debe ser utilizado con fines pronósticos en pacientes con ICA debido a que los niveles plasmáticos de NT-proBNP se asocian de forma independiente con el pronóstico de los pacientes con ICA pero, por el contrario, los niveles urinarios de NT-proBNP no presentan asociación con la aparición de eventos durante el seguimiento en este tipo de pacientes. OBJECTIVES 1. Evaluate how glomerular renal function, as measured by eGFR, influences on urinary NT-proBNP concentration. 2. To evaluate the relationship between specific glomerular and tubular renal function biomarkers and NT-proBNP concentrations, to help identify the mechanism of renal elimination. 3. To evaluate the prognostic value of urinary NT-proBNP levels compared with plasmatic NT-proBNP levels in patients with AHF. METHODS We prospectively included 138 consecutive patients, diagnosed of ICA in Hospital Virgen de la Arrixaca. Blood and urine samples were simultaneously collected on admission. Laboratory parameters were measured in serum: glucose, creatinine, urea, albumin, sodium, uric acid, CRP, troponin T, cystatin C, and NT-proBNP BTP; and in urine: alpha-1 microglobulin, albumin (MAU) and NT-proBNP. RESULTS 1. Plasma and urinary NT-proBNP was higher in patients with a lower eGFR (p <0.001). Plasma NT-proBNP concentration correlated positively with urinary NT-proBNP (r = 0.61, p <0.001) Correlations eGFR - NT-proBNP were also significant although less robust (r = -0.44, NT-proBNP r = -0.37, NT-proBNP, p <0.001 for both). After multivariable adjustment, eFGR was only an independent predictor of plasma NT-proBNP concentrations. Plasma NT-proBNP was the main independent predictor of urinary NT-proBNP concentration. 2. Urinary Alpha-1 microglobulin levels (β = 0.50, p <0.001) and plasma NT-proBNP (β = 0.29, p <0.001) were the main independent predictor of urinary NT-proBNP concentration while creatinine, MDRD, cystatin C, BTP and MAU concentrations were not accepted as statistically significant. 3. Patients with clinical events had a higher plasma NT-proBNP concentration (4.561 pg / ml [2191-8631] vs 2,906 pg / ml [1643-5823], p = 0.03) but urinary NT-proBNP concentration was similar (78 pg / ml [42-294] vs 71 pg / ml [41-189], p = 0.62) compared with those patients who did not experience clinical events. In Cox regression univariate and multivariate analysis, the plasma NT-proBNP concentration above the median (3345 pg / ml) was associated with an increased risk of adverse clinical events (HR = 2.35, 95% , 1.41 to 3.93, P = 0.001). However, the urinary NT-proBNP concentration above the median (73 pg / ml) did not reach statistical significance as a predictor of prognosis of events in the univariate analysis (HR = 1.2, 95%, 0, 79 to 1.96, P = 0.46) CONCLUSIONS 1. Glomerular kidney disfunction is associated with increased plasma and urinary NT-proBNP concentration. However, glomerular filtration rate is not an independent predictor of urinary NT-proBNP. 2a. Plasma NT-proBNP was the main predictor of urinary NT-proBNP concentration. This may be due to increased cardiac production of NT-proBNP as a result of increased cardiovascular stress of patients with concomitant cardiac and renal involvement. 2b. Because alpha-1 microglobulin (renal tubular function parameter) was an independent predictor of urinary NT-proBNP unlike renal glomerular filtration biomarkers, we suggest that the presence of renal tubular dysfunction could be involved in increased urinary NT-proBNP levels observed in patients with renal disfunction. Thus, a decrease in NT-proBNP reabsorption at the proximal tubule would favor an increase urinary NT-proBNP levels. 3. We consider that urinary NT-proBNP should not be used for prognostic purposes in patients with AHF because plasma NT-proBNP levels was independently associated with prognosis of patients with AHF but, instead, urinary NT-proBNP levels have no association with the occurrence of events during follow-up in these patients.
- PublicationOpen AccessEfecto de la melatonina y de HA/β-TCP/C sobre la pulpa dental de molares de rata(2015-01-09) Guerrero Gironés, Julia; Ortiz Ruiz, Antonio José; Alcaina Lorente, Mª Antonia; Facultad de MedicinaOBJETIVOS La melatonina juega un papel esencial en la regulación del crecimiento óseo. El efecto de la melatonina sobre los odontoblastos podría ser similar a su acción sobre los osteoblastos. La hidroxiapatita (HA) y el fosfato beta-tricálcico (β-TCP) son biocerámicas usadas como sustitutos óseos que, unidas a colágeno (C) como soporte, tienen unas cualidades osteoconductoras satisfactorias. El objetivo de nuestro estudio es evaluar la respuesta de la pulpa de molares de rata a la melatonina y a la mezcla HA/β-TCP/C cuando se usan como agentes para la realización de protecciones pulpares directas y comparar sus efectos sobre la pulpa dental con el producido por el MTA. Además, queremos evaluar la acción antioxidante sistémica de la melatonina administrada por vía oral, y su influencia sobre el efecto que el MTA y la melatonina tienen sobre la pulpa dental cuando se usan como agentes para la realización de protecciones pulpares directas en molares de rata. METODOLOGÍA Se realizaron protecciones pulpares directas en los molares superiores de 28 ratas Sprague Dawley. Los grupos de estudio fueron: MTA 30 días, Melatonina 30 días, MTA + Melatonina administrada por vía oral (v.o.) 30 días; Melatonina + Melatonina v.o. 30 días, MTA 60 días, Melatonina 60 días, HA/β-TCP/C 30 días. En los grupos MTA+ Melatonina v.o. 30 días y Melatonina + Melatonina v.o. 30 días, se añadió melatonina en el agua de bebida que los animales bebieron ad líbitum (10 mg / 100 ml). Después del período de estudio, 30 ó 60 días según el grupo, los animales fueron sacrificados y se les extrajo 5 ml de sangre, los riñones y el hígado con el fin de evaluar el estrés oxidativo por medio de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). Los fragmentos de maxilar que contenían los molares de estudio se prepararon para la evaluación histológica. A partir de estas muestras, se determinó el grado de inflamación pulpar, el grado de necrosis pulpar, la presencia de puente dentinario y dentina reparativa en la cámara pulpar, la presencia y la regularidad de la capa odontoblástica y la presencia de fibrosis pulpar. RESULTADOS No se observaron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos en cuanto a grado de inflamación (p=0,024), vitalidad pulpar (p=0,61) y fibrosis (p=0,194). Para la variable puente dentinario y dentina reparativa hubo diferencias significativas (p=0,002): el grupo MTA 30 días se asoció a presencia y el grupo HA/β-TCP/C 30 días se asoció a ausencia de puente dentinario y dentina reparativa. Para la variable capa odontoblástica también hubo diferencias significativas entre los grupos (p=0,002): el grupo MTA 30 días se asoció a la presencia de una capa odontoblástica regular, el grupo MTA + Melatonina v.o. 30 días se asoció a la presencia de capa odontoblástica ya sea regular o irregular, los grupos Melatonina 60 días y HA/β-TCP/C 30 días se asociaron significativamente a la ausencia de una capa odontoblástica regular. En el análisis del estrés oxidativo no se detectaron diferencias significativas entre los distintos grupos: plasma (p=0.799), riñón (P=0.130) e hígado (p=0.724). CONCLUSIONES Los efectos sobre la pulpa dental de la melatonina y HA/β-TCP/C usados como materiales de recubrimiento pulpar son similares a los del MTA cuando valoramos el grado de inflamación, la vitalidad pulpar y la presencia de fibrosis pulpar. El consumo de melatonina por vía oral no añade ningún efecto histológico al producido por el MTA y la melatonina aplicados directamente sobre la pulpa dental. El nivel de estrés oxidativo en plasma, riñón e hígado no se modifican en ninguno de los grupos por el consumo de melatonina en el agua de bebida. ABSTRACT OBJETIVE Melatonin plays an essential role in the regulation of bone growth. The actions that melatonin exert on odontoblasts may be similar to action on osteoblasts. Hydroxyapatite (HA) and beta-tricalcium phosphate (β-TCP) are bioceramics used as bone substitutes, which together with collagen (C) as support, have satisfactory osteoconductive qualities. The aim of this research was to evaluate pulp response to melatonin and to mixture HA/β-TCP/C used for direct pulp capping and to evaluate the antioxidant effect of melatonin administered orally and its influence on dental pulp. METHODS Direct pulp capping was performed on the upper molars of 28 Sprague-Dawley rats. The study groups were: MTA 30 days; Melatonin 30 days; MTA + Melatonin taken orally 30 days; Melatonin + Melatonin taken orally 30 days; MTA 60 days; Melatonin 60 days;.HA/β-TCP/C 30 days. In the groups MTA + Melatonin taken orally 30 days and Melatonin + Melatonin taken orally 30 days, the animals drank water dosed with melatonin ad libitum (10 mg/100 ml). After 30 or 60 days depend of the group, the animals were sacrificed and 5 ml of blood, the kidneys and liver were extracted in order to evaluate oxidative stress by means of thiobarbituric acid reactive substances testing (TBARS), and fragments of the maxilla containing the study molars were prepared for histological evaluation. The degree of pulp inflammation, the degree of pulp necrosis, the presence of reparative dentin and dentin bridging the pulp chamber, the presence and regularity of the odontoblastic layer and the presence of pulp fibrosis were evaluated from these samples. RESULTS No significant differences were found between the study groups for the histological variables degree of pulp inflammation (p=0,024), degree of pulp necrosis (p=0,61) and presence of pulp fibrosis (p=0,194). There were significant differences for the histological variable presence of reparative dentin and dentin bridging the pulp chamber (p=0,002); group MTA 30 days was associated to presence and group HA/β-TCP/C 30 days was associated to ausence of reparative dentin and dentin bridging. There were significant differences for the variable presence and regularity of the odontoblastic layer between groups (p=0,002); group MTA 30 days was associated to regular odontoblastic layer; group MTA+Melatonin taken orally 30 days was significantly associated to odontoblastic layer regular or irregular; groups Melatonin 60 days and HA/β-TCP/C 30 days were associated to ausence of regular odontoblastic layer. In oxidative stress analysis no significant differences were found between the study groups: blood (p=0.799), kidney (P=0.130) and liver (p=0.724). CONCLUSION The effect of melatonin and HA/β-TCP/C on pulp is similar to that of MTA to the degree of pulp inflammation, the degree of pulp necrosis and the present of pulp fibrosis. Oral administration of melatonin did not modify the local effects of MTA or of melatonin on dental pulp or reduce basal level oxidative stress.
- PublicationOpen AccessEstudio de la función de la hormona estimuladora del folículo de lubina: su implicación en la espermatogénesis y sus rutas de señalización intracelular(2014-12-15) Mazón Moya, Mª José; Zanuy Doste, Silvia; Gómez Peris, Ana; Departamento de Biología Celular e HistologíaEl proceso reproductivo en peces, al igual que en el resto de vertebrados, está regulado por una cascada hormonal en la que están implicados el cerebro, la hipófisis y las gónadas, conocido como eje CHG. Dos de las principales hormonas implicadas en el control de la reproducción son las gonadotrofinas FSH (hormona estimuladora del folículo) y LH (hormona luteinizante), ambas producidas en la hipófisis y liberadas tras el estímulo con las hormonas liberadoras de gonadotrofinas (GnRH) y con acción a nivel gonadal. Desde la perspectiva de la producción animal en general, y de la acuicultura en particular, es esencial conocer en la especie a domesticar los mecanismos básicos de control endocrino. Este conocimiento básico es de gran utilidad para poder manipular la reproducción a conveniencia y al mismo tiempo poder desarrollar estrategias terapéuticas para solventar problemas de fertilidad que en ocasiones presentan los stocks de reproductores. Sin embargo, como consecuencia de la limitación en la disponibilidad de herramientas para su estudio, para una gran mayoría de las especies cultivables de peces se desconocen los mecanismos particulares que controlan su reproducción. En esta Tesis se optimiza una alternativa nueva de administración de gonadotrofinas recombinantes, la tecnología conocida como transferencia génica somática. En los capítulos 3 y 4 se inyectaron adultos y juveniles de lubina con construcciones de DNA codificante de las gonadotrofinas de cadena única Lh y Fsh, respectivamente, y se evaluó el incremento de estas hormonas en el torrente sanguíneo. En ambos experimentos las inyecciones de DNA se compararon con la inyección directa de la gonadotrofina recombinante correspondiente. Estos capítulos muestran que las construcciones de DNA se incorporan a las células musculares en el lugar de inyección, y las hormonas codificadas son sintetizadas y liberadas al torrente sanguíneo. Los capítulos 3 y 4 confirman que la transferencia génica somática es una herramienta poderosa para realizar estudios funcionales in vivo con gonadotrofinas, siendo además útil como terapia hormonal en peces, presentándose como alternativa a los tratamientos tradicionales con hCG o GnRH. La funcionalidad de las hormonas recombinantes sintetizadas por las células musculares de lubina tras la incorporación del DNA, se determinó estudiando su efecto en el desarrollo de los testículos. En los capítulos 4 y 5 se evaluó como la acción de la Fsh es esencial para iniciar el proceso de espermatogénesis, promoviendo la proliferación de las espermatogonias, siendo necesaria la acción posterior de la Lh para culminar la espermiación. Los individuos inyectados sólo con el plásmido de Fsh presentaron una espermatogénesis parcial, sin indicios de espermiación, estado que sólo alcanzaron aquellos animales que se inyectaron de manera secuencial con los plásmidos de Fsh y Lh. Estos experimentos también demuestran que la Lh por si sola no es capaz de promover la maduración testicular. Además en los análisis de expresión génica se observó que los tratamientos con Fsh incrementaron la expresión de marcadores de células germinales como piwi, pcna y scp3, mientras que el efecto de la Lh se detectó en enzimas esteroidogénicas como cyp17a1 y cyp17a2. En esta Tesis también se describe cómo una de las acciones más directas de la Fsh es la estimulación de la producción de 11KT. Con el fin de analizar más en detalle la acción específica de la Fsh en la activación de la esteroidogénesis, y de definir mecanismos de regulación conservados entre diferentes especies de peces, se estudió in vitro la acción de la Fsh en cultivo primario de testículo y ovario de lubina y pez cebra. En el capítulo 6 se describe cómo la Fsh emplea principalmente la ruta del AMPc/PKA para transmitir su señal una vez activado su receptor, no siendo ésta la única vía, ya que también es importante la actividad de las MAPK. Haciendo uso de inhibidores y estimuladores de ambas rutas se ha perfilado un escenario en el que la Fsh utiliza de manera independiente las rutas del AMPc/PKA o las MAPK para estimular la transcripción de genes implicados en la esteroidogénesis, como star o cyp19a1a ABSTRACT The reproductive process in fish, as in all vertebrate species, is tightly regulated by a hormonal axis, called BPG, involving the brain, pituitary and gonads. Two major hormones that control reproduction are the gonadotropins FSH (follicle-stimulating hormone) and LH (luteinizing hormone) are both produced at the pituitary level, released to the bloodstream after the stimulus of the GnRH (gonadotropin release hormone), and with action at the gonad level. From a fish farming perspective, it is essential to fully understand the endocrine mechanism underlying reproductive performance. This knowledge is important to manipulate reproductive behaviour and for the development of therapeutic strategies aiming to solve fertility issues frequently present in the broodstocks. However, due to the limited tools available for the vast majority of the cultivable species, the mechanisms controlling their reproduction are not well characterized. This thesis describes an alternative administration of recombinant gonadotropins using the technique of somatic gene transfer. In Chapters 3 and 4, adult and juvenile sea bass were injected with a plasmid DNA encoding Lh and Fsh gonadotropin sequences in a single chain form, and the levels of either GtHs were analysed in the bloodstream. In both experiments the plasma levels of GtHs attained by plasmid DNA injected fish were compared with plasma levels of fish injected with the equivalent recombinant GtH. Both Chapters clearly show that plasmid DNA was efficiently incorporated by the cell muscle, and the encoded hormones were synthetized and released to the bloodstream. These results confirm that somatic gene transfer can be a powerful tool for in vivo functional studies of gonadotropin. In addition, this technique can be used for hormone therapy in fish, and can offer a useful alternative to classic treatments with hCG or GnRH. The functionality of the recombinant hormones synthetized by cell muscles after plasmid DNA injection was evaluated by studying the development of testes. Chapters 4 and 5 describe the crucial role of Fsh in starting the process of spermatogenesis, promoting the proliferation of spermatogonia cells, and its requirements for Lh to reach the spermiation process. Fish receiving only Fsh plasmid injections showed partial spermatogenesis, with no evidence for spermiation. Only the fish injected with Fsh and Lh plasmid sequentially reached this late step of the spermatogenesis process. Fish receiving Lh plasmid alone showed that GtH cannot trigger testis maturation alone. Furthermore, gene expression analysis highlighted the action of Fsh on promoting cell proliferation by increasing the expression of germ cell markers such as piwi, pcna piwi, pcna and scp3. By contrast, the effect of Lh was more obvious in transcript levels of steroidogenic enzymes such as cyp17a1 and cyp17a2. This thesis additionally describes a direct action of Fsh on the stimulation of 11KT production. In order to analyse the specific activity of Fsh on the steroidogenesis process in detail, and to define regulatory mechanisms conserved across fish species, the action of Fsh in vitro was studied using primary gonad tissue culture from sea bass and zebrafish. Chapter 6 describes the use of the signalling pathway cAMP/PKA by Fsh to transduce the signal after the activation of its receptor not clear. Importantly, cAMP/PKA is not the only pathway used by Fsh, the MAPk route is also involved in Fsh signal transduction. The use of cAMP/PKA and MAPk inhibitors and stimulators suggest the possibility that Fsh can use both routes independently to activate the transcription of some steroidogenic genes such as star and cyp19a1a
- PublicationOpen AccessFactores genéticos, clínicos y bioquímicos en pacientes con feocromocitoma(Universidad de Murcia, 2024-10-30) Muñoz Ruiz, María Consuelo; Febrero Sánchez, Beatriz; Rodríguez González, José Manuel; Escuela Internacional de DoctoradoINTRODUCCIÓN El feocromocitoma es un tumor que ha cambiado su forma de presentación en los últimos años, tanto en la forma de presentación clínica como en su componente genético. Por un lado, el aumento de realización de pruebas de imagen y su mayor precisión ha conllevado a un incremento del diagnóstico de feocromocitoma a raíz del incidentaloma suprarrenal, siendo la mayoría asintomáticos. Además, el screening familiar en los casos con componente genético ha contribuido también al aumento de los casos inicialmente asintomáticos. Por otro lado, el incremento de las pruebas genéticas ha hecho que se detecten más casos familiares. Los objetivos de esta tesis son: 1) Describir las características demográficas, clínicas, diagnósticas, y terapéuticas de los pacientes con feocromocitoma, 2) Analizar los pacientes con feocromocitoma sintomático y las variables relacionadas y, 3) Determinar los pacientes con feocromocitoma familiar y las variables relacionadas. MATERIAL Y MÉTODOS Estudio retrospectivo de pacientes con feocromocitoma tratados y en seguimiento en un hospital terciario (Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca) comprendiendo los años 1984 y 2021, inclusive. Se han analizado variables demográficas, de localización, clínicas, de diagnóstico, terapéuticas, histológicas de seguimiento. Análisis estadístico: software SPSS 28.0. Se han realizado análisis de regresión logística univariados y multivariados. Considerando p <0.05 estadísticamente significativo. RESULTADOS Se analizaron un total de 173 pacientes. El 53.18% (n=92) fueron mujeres, con una edad media al diagnóstico de 44.36 ± 15.80 años. El 64.71% (n=88) fueron feocromocitomas familiares. El 32.39% (n=23) son casos índice. La forma de diagnóstico más frecuente fue la clínica (48.55%). Un 32.95% (n=57) fueron asintomáticos. En cuanto al diagnóstico bioquímico, el perfil mixto fue el más frecuente (43.93%), seguido del Resumen adrenérgico; y la tomografía computarizada junto con la MIBG fueron las pruebas de imagen y funcional más utilizadas. El 60.6% (n=100) fueron intervenidos por laparoscopia. El 23.03% presentaron complicaciones intraquirúrgicas, y el 15.76%, postquirúrgicas. El tamaño medio del tumor fue de 4.07 ± 3.08 cm. El porcentaje de feocromocitomas metastásicos fue del 5.20%. Las variables relacionadas con pacientes con feocromocitoma sintomático fueron: sexo masculino (OR=0.33; p=0.023), presentar mutación positiva (OR =0.15; p=0.004), presentar un perfil noradrenérgico (OR=12.73; p=0.02) y la aparición de complicaciones intraquirúrgicas (OR=5.34; p=0.021). Las variables relacionadas con pacientes con feocromocitoma familiar fueron: la edad al diagnóstico (OR=0.93; p=0.003), la bilateralidad (OR=30.22; p<0.001), presentar manifestaciones clínicas relacionadas con la tensión arterial (OR=0.15; p=0.018) y el tamaño (OR=0.65; p=0.015). Las variables relacionadas concretamente con los casos índices fueron: la edad al diagnóstico (OR=0.95; p=0.016) y la bilateralidad (OR=4.58; p=0.018). CONCLUSIONES La forma de presentación de los pacientes con feocromocitoma ha cambiado, aumentando los casos asintomáticos y familiares. El sexo femenino, los casos esporádicos, y el perfil noradrenérgico se relacionan con un feocromocitoma más sintomático. Además, los pacientes sintomáticos presentan más complicaciones intraquirúrgicas. Por otro lado, una menor edad, la bilateralidad, presentar menos manifestaciones relacionadas con la tensión arterial y un menor tamaño, son variables que se relacionan con el feocromocitoma familiar. Los casos índice se relacionan con una menor edad y con la bilateralidad.
- PublicationOpen AccessFuranocumarinas e isoflavonas de interés farmacológico en bitumunaria bituminosa(2016-02-08) Díaz Expósito, Licinio; Río Conesa, Juan Antonio del; Ortuño Tomás, Ana María; Facultad de BiologíaEl propósito de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar y ampliar los conocimientos sobre la distribución, biosíntesis y metabolismo de las furanocumarinas e isoflavonas en B. bituminosa. La importancia y el interés por estos metabolitos secundarios reside en su aplicabilidad en biomedicina, ya que al ser irradiadas con luz UV, establecen uniones covalentes con el ADN y con proteínas, modulando, la regulación génica o la actividad de determinados enzimas. Ha demostrado ser efectivo contra distintas enfermedades autoinmunes y diversos tipos de cáncer. Por otro lado, las isoflavonas, son consideradas moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM´s), pudiendo estar implicadas tanto en el crecimiento como en la muerte celular. Uno de nuestros objetivos, ha sido la de encontrar un material vegetal, con una producción lo suficientemente alta como para establecerse como materia prima para la producción comercial de estos compuestos, y B. bituminosa ha mostrando uno de los mayores niveles de FC´s e isoflavonas de todos los materiales vegetales analizados. Durante el presente trabajo, se ha optimizado un método analítico, rápido, preciso y eficaz, y se han analizado los niveles de FC´s e isoflavonas, de distintas variedades y poblaciones de B. bituminosa, por toda la cuenca mediterránea e Islas Canarias. Seleccionando aquellas, que presentaban una biosíntesis mayoritaria de FC´s lineales y por otro lado, individuos con una biosíntesis mayoritaria de FC´s angulares. Se establecieron plantaciones experimentales, de las cuales surgieron dos clones de B. bituminosa, clon Psoraleno (96% de FC´s lineales) y B. bituminosa, clon Angelicina (75% de FC´s angulares). Se estudió tanto la evolución en la acumulación de FC´s como su distribución en planta, así como la modulación de su ruta biosíntética. Observándose un patrón de distribución característico, donde las FC´s se localizan predominantemente en la parte aérea de la planta, mientras que las isoflavonas, se localizan en la parte radicular, siendo inducidas ambas moléculas, por determinados precursores, como el ácido cinámico o umbeliferona, por metales como el Mg2+ o el Cu2+ y por algunos efectores hormonales como el MeJa. Además se ha identificado, purificado y caracterizado bioquímica y molecularmente una enzima, implicada directamente en el metabolismo de las FC´s, como es una ß-glucosidasa específica de furanocumarinas glicosiladas, (BbFCbG), la cual, pertenece a la familia 1 de las glicosil hidrolasas. Esta enzima, presenta una alta especificidad por las FC´s conjugadas, debido a la sustitución de un residuo de ácido glutámico, en el centro activo, por uno de glutamina. Este hecho ocurre con sustratos que tienen una reactividad lo suficientemente alta como para no necesitar catálisis ácida, y en el caso de las furanocumarinas, la catálisis básica recaería sobre el grupo hidroxilo del grupo carboxilo presente en el anillo lactona de la propia furanocumarina, lo que podría ser la razón de la elevada especificidad de esta enzima por las furanocumarinas. Esta enzima además, está implicada en la respuesta defensiva frente a heridas, mostrando una inducción de su transcripción al realizar heridas en la planta o al tratarla con MeJa. Por último, se llevó a cabo un estudio del metabolismo de FC´s durante el proceso germinativo y se analizó cómo varían los niveles de BbFCbG durante dicha etapa del desarrollo vegetal, mostrando una hidrólisis de FC´s conjugadas en los cotiledones, así como un aumento en la expresión de esta enzima en ese órgano. Además, en la activación de BbFCbG están implicadas fitohormonas como el GA3 y el MeJa y en menor medida la 6-BA. Para el desarrollo de estos objetivos se han utilizado numerosas técnicas de instrumentación científica (HPLC, MS/MS, TOF, RMN), así como técnicas bioquímicas y moleculares, las cuales, nos han permitido avanzar en el conocimiento del metabolismo de estos compuestos. SUMMARY The aim of this PhD Thesis has been deepen and broaden the knowledge about the distribution, biosynthesis and metabolism of furanocoumarins (FC´s) and isoflavones in B. bituminosa. The importance and interest of these secondary metabolites is its aplicability in biomedicine, such to be able to, when they are irradiated with UV light, to establish covalents unions with both DNA and proteins, modulating gene regulation or activity of certain enzymes, which has been demostrated to be effective agains various autoinmune diseases and cancers. Furthermore, isoflavones are considered selective estrogen receptor modulators (SERM´s) and they may be involved in both cell growth and cell death. One of our goals in this report, has been to find a plant material, with a high enough production of these metabolites in order to establish itself as raw material for commercial production of these compunds and so B. bituminosa has been shown one of the highest amounts of FC´s and isoflavones content in the analyzed plant kingdom. In this work, it has been optimized an analytical, fast, accurate and efficient method for quantification of differents FC´s and isoflavones, previously identified in B. bituminosa. In addition, It has done a prospecting, analyzing FC´s and isoflavones levels of several varieties and populations of B. bituminosa throughout the mediterranean basin and Canary Islands, selecting all of them, that met with our requirements: a majority biosynthesis of linear FC´s, or angular FC´s. We have been established two experimental plantations with selected plants, in which, we selected two plants to be candidates, one of them, called Psoralen clone (96% linear FC´s content) and other one, called, Angelicin clone (75% angular FC´s content). It has been studied the evolution in FC´s accumulation, their distribution in plants and the modulation of the biosynthetic pathway. We observed a characteristic pattern of distribution, where FC´s are located predominantly in the aerial parts of the plants while isoflavones are located in the root part of the plant, being both molecules induced by certain precursors, such as cinnamic acid and umbelliferone, by metals, such as Mg2+ or Cu2+ and some hormonal effectors as MeJa. Otherwise, it has been identified, purified and characterized an enzyme directly involved in the metabolism of the FC´s, as specific ß-glucosidase of furanocoumarins (BbFCbG), which belongs to family 1 of glycosyl hidrolases. This enzyme has a high specifity againts conjugate FC´s, due to the sustitution of a glutamic acid residue, located at the active site of the enzyme, by a glutamine one. This fact occurs with substrates that have a reactivity high enough to not require acid catalysis, and with furanocoumarins, base catalysis would be carried out by the hydroxyl group, content in the carboxyl group of lactone ring in FC´s. These could be the reason of the highest specifity of this enzyme on furanocoumarins. This reaction mechanism, is the first time that it is purposed, as well as, the identification and characterization of an furanocoumarin conjugated specific ß-glucosidase. Also, this enzyme is involved in the defense response to wounds, showing an induction of its transcription when made tissue damage or by treatment with MeJa. Finally, we studied about the FC´s metabolism during the germination process and was analyzed the variation of expression levels of BbFCbG during this stage of plant development, showing a FC´s conjugates hydrolysis in cotyledons during development and an increase of the transcription levels of BbFCbG in this organ. Also, in the activation of BbFCbG are implicated some phytohormones as GA3 and MeJa, and to a lesser extent 6-BA. For accomplish these objectives, we have been used numerous scientific instrumentation techniques (HPLC, MS/MS, TOF, RMN), biochemical and molecular techniques, which have allowed us to advance our knowledge of the metabolism of these compounds.
- PublicationOpen AccessInteracciones funcionales entre el receptor de melanocortinas 1, B-arrestinas y mahogunina(2016-05-02) Abrisqueta González, Marta; García-Borrón Martínez, José Carlos; Jiménez-Cervantes Frigols, Celia; Olivares Sánchez, María Concepción; Facultad de MedicinaEl receptor de melanocortinas 1 (MC1R), un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) expresado en los melanocitos epidérmicos, es el principal determinante de las respuestas biológicas cutáneas a la radiación ultravioleta de origen solar. El gen MC1R es un gen de susceptibilidad al cáncer de piel bien establecido. La señalización por MC1R, que transcurre por la cascada del AMPc y la vía de las MAP quinasas ERK1 y ERK2, está estrechamente regulada por mecanismos generales comunes a todos los GPCRs, como los mediados por β-arrestinas (ARRBs), y mecanismos específicos como los dependientes de Mahogunina (MGRN1), una proteína que presenta en su secuencia un dominio “RING finger” característico de las E3-ubiquitina ligasas, así como señales de localización nuclear. Las ARRBs participan en la desensibilización homóloga e internalización de muchos GPCRs, mientras que MGRN1 compite con la proteína G por su unión a MC1R. La mutación mahoganoide, que inactiva el gen murino (Mgrn1), genera ratones de pelaje oscuro con una alta letalidad embrionaria y propensión al desarrollo de encefalopatías de tipo espongiforme. Con estos antecedentes, nos propusimos estudiar: i) el efecto diferencial de las principales isoformas de ARRB sobre la señalización dual del MC1R, ii) las consecuencias de la interacción ARRB-MC1R en las propias ARRBs, iii) la posible participación de MGRN1 como ligasa responsable de la ubiquitinación de ARRBs y iv) posibles dianas de MGRN1 responsables del fenotipo mahoganoide. Para abordar estos objetivos utilizamos melanocitos de ratón normales o mutados en Mgrn1 (obtenidos del ratón mahoganoide), células de melanoma humano y sistemas de expresión heteróloga, en los que se sobreexpresaron o silenciaron genes de interés y variantes de las proteínas objeto de estudio obtenidas por mutagénesis dirigida. La función del MC1R se analizó mediante ensayos de producción de AMPc, de activación de ERK1/2 y de unión de radioligandos para determinar la expresión de MC1R en la membrana plasmática. Los extractos celulares se analizaron por técnicas electroforéticas y transferencia Western. Para la búsqueda de dianas de MGRN1 hicimos uso de micromatrices de expresión de ARNm y PCR cuantitativa. La validación funcional de cambios en la expresión génica de algunos genes candidatos previsiblemente regulados por Mgrn1 se llevó a cabo por ensayos de proliferación y análisis del ciclo celular. Demostramos que tanto ARRB1 como ARRB2 interaccionan competitivamente con MC1R, aunque solo ARRB2 lo desacopla de la vía del AMPc e induce su internalización por un mecanismo independiente de clatrina y adaptina. Ninguna de las dos ARRB tiene efecto sobre la señalización mediada por ERKs. Como consecuencia de esta interacción, las ARRBs sufren poliubiquitinación dependiente de MC1R funcional expresado en la membrana plasmática, de forma independiente de agonista. Esta poliubiquitinación disminuye la funcionalidad de ARRB2, transcurre en su dominio C-terminal, implica a Lys400, y se relaciona con una proteólisis alrededor de la posición 170 que origina un péptido de 31 kDa. MGRN1 participa en la poliubiquitinación de las ARRBs y para ello necesita el dominio RING-finger funcional y la presencia de MC1R, que actúa como andamio molecular facilitando la formación de un complejo ternario ARRB-MC1R-MGRN1. Además, se produce una mono- o diubiquitinación en residuo(s) de lisina del dominio N-terminal de ARRB, asociada a una menor capacidad para interaccionar con MC1R. Por otra parte, Mgrn1 regula postraduccionalmente a tubulina β III (TUBB3), y su carencia en melanocitos mahoganoides altera la estructura de los microtúbulos. Además, Mgrn1 afecta a la expresión de múltiples genes reguladores del ciclo celular. Así, la falta de Mgrn1 provoca una parada del ciclo celular en fase S asociada a una tasa de proliferación significativamente menor. c-Myc y Creb1 podrían ser los principales factores de transcripción regulados por MGRN1 responsables de este efecto. The melanocortin 1 receptor (MC1R), a G protein-coupled receptor (GPCR) expressed in epidermal melanocytes, is the main determinant of the cutaneous biological responses to solar ultraviolet radiation. The MC1R gene is a well characterized skin cancer susceptibility gene. MC1R signaling involves activation of the cAMP and the MAP kinase ERK1 and ERK2 pathways. These processes are tightly regulated by general mechanisms involving the β-arrestins (ARRBs) that act on most if not all GPCRs, as well as by specific mechanisms such as those dependent on Mahogunin (MGRN1), a protein containing the RING finger domain characteristic of E3-ubiquitin ligases and nuclear localization signals. The ARRBs mediate the homologous desensitization and internalization of many GPCRs, and MGRN1 desplaces the Gs protein from MC1R. The mahoganoid mouse mutation, which inactivates the Mgrn1 gene, causes a dark fur phenotype and is associated with high embryonic lethality and neurodegeneration with spongiform-like encephalopathy. With this in mind, our aims were to study: i) the differential effect of the main ARRB isoforms on dual signaling downstream of MC1R, ii) the consequences of the ARRB-MC1R interaction on ARRB structure, iii) the involvement of MGRN1 as an E3-ligase responsible for ARRB ubiquitination and iv) possible targets of MGRN1 accounting for the mahoganoid phenotype. To achieve these goals, we used cultured melanocytes from normal and mahoganoid mutant mice, human melanoma cells and heterologous expression systems. We overexpressed or silenced the genes of interest, as well as variants obtained by site-directed mutagenesis. MC1R function was assessed by cAMP production and ERK activation assays, as well as by radioligand binding experiments to determine MC1R cell surface expression. Cell extracts were analyzed by electrophoretic techniques and Western blotting. To identify MGRN1 targets, we used gene expression microarrays and quantitative PCR. Functional validation of changes in the expression of selected candidate genes likely regulated by Mgrn1 was carried out by cell proliferation assays and cell cycle analysis. We showed that whereas both ARRB1 and ARRB2 bind competitively to MC1R, only ARRB2 uncouples the receptor from the cAMP pathway and triggers its internalization by a mechanism independent on clathrin and adaptin. Conversely, neither ARRB has any effect on ERK-dependent signaling. As a result of the MC1R-ARRB interaction, the ARRBs undergo polyubiquitination in a process strictly dependent on the expression of functional MC1R on the plasma membrane, but independent on MC1R agonists. This polyubiquitination impairs ARRB2 function. It occurs in the C-terminal domain of the protein, it involves Lys400, and it is related with a proteolytic event near residue 170 which generates a 31 kDa polypeptide. In addition, the ARRBs likely undergo a mono- or diubiquitination in lysine residue(s) of the N-terminal domain of the ARRBs, associated with a lower affinity for MC1R. MGRN1 is involved in ARRB polyubiquitination in a manner dependent on a functional RING finger domain and on MC1R, which acts as a scaffold to enable the formation of an ARRB-MC1R-MGRN1 ternary complex. On the other hand, Mgrn1 acts to regulate at the post-translational level tubulin β III (TUBB3), and its downregulation in mahoganoid melanocytes dramatically alters the structure of the microtubules. Moreover, Mgrn1 has a profound effect on the expression on many cell cycle regulatory genes. Accordingly, lack of Mgrn1 impairs cell cycle progression through the S phase and is associated with a significantly lower rate of proliferation. c-Myc and Creb1 appear to be the main Mgrn1-regulated transcription factors responsible for this effect of Mgrn1.