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Acción de validamicina A y los antifúngicos de uso clínico, micafungina y anfotericina B, sobre Candida albicans
(2016-05-31) Guirao Abad, José Pedro; Argüelles Ordóñez, Juan Carlos; Martínez-Esparza Alvargonzález, María Concepción; Facultad de Medicina
Summary Validamycin A (Val. A) has been used successfully in the fight against phytopathogenic fungi in crops. Here, its putative antifungal effect against the human pathogen Candida albicans is examined. Val. A acts as a potent non-competitive inhibitor of the cell wall-linked acid trehalase (Atc1p). The estimated MIC50 for the C. albicans parental strain CAI-4 was 0.5 mg/ml. A homozygous atc1Δ mutant lacking functional Atc1p activity showed greater resistance to the drug. However, the antifungal power of Val. A was limited compared with the lethal action of amphotericin B (AmB). The endogenous content of trehalose rose significantly with both drugs although no synergistic effect was observed between them. It seems therefore that inhibition of the trehalases is not lethal in C. albicans. Catalase activity was not affected by Val. A, so that this antioxidant activity does not play a major part in protecting the cell integrity in the case of treatment with Val. A. The drug did not impair the formation of germ-tubes, confirming that trehalose hydrolysis is not essential for morphogenesis. In addition, C. albicans cells and human macrophages showed a similar sensitivity to the compound. Therefore, Val. A cannot be considered a clinically useful antifungal against C. albicans. On the other hand, recent evidence suggests that the lethal effect induced by some clinical antifungals depends on previously unknown targets. In this study, we also examine the hypothetical role played by the intracellular formation of ROS in the fungicidal action of AmB and micafungin (MF) on C. albicans. The clinical MIC90 for MF and AMB were 0.016 and 0.12 mg/L, respectively (SC5314 strain), although CAI-4 cells showed a similar sensitivity to both drugs in YPD medium. The polyene AMB strongly induced ROS production in parallel with a severe degree of cell killing in both CAI-4 and SC5314 strains, whether grown in PBS or YPD. However, the fungicidal effect of MF was more effective in YPD, when it showed a higher degree of ROS generation and cell toxicity than in PBS. Preincubation with rotenone or thiourea reduced ROS production and caused a marked increase on cell viability, regardless of the antifungal applied. In contrast, AMB promoted higher intracellular synthesis of trehalose, which acts as a specific protector against oxidative stress in C. albicans. In C. albicans, the MAP-kinase Hog1 pathway plays an essential protective role against oxidative stress. The hog1Δ mutant showed a high degree of sensitivity to AmB, but no differences were observed with MF compared to its parental strain, RM-100. These results firmly support the involvement of Hog1 in the resistance of C. albicans to AmB, and point to the induction of an internal oxidative stress in C. albicans through the release of ROS as a contributory factor to the antifungal action of AMB but not MF. The simultaneous measurement of several antioxidant enzymes (catalase, glutathione reductase and superoxide dismutase) showed that these activities were strongly induced in cells treated with AmB and MF, such activation being especially pronounced in the hog1Δ mutant. We also investigated the in vitro correlation between the fungicidal effect of AMB and its hypothetical inhibitory action on hypha formation in C. albicans. The inhibitory effect of AmB on germ-tube formation was due to the high toxicity of AmB, whereas the regulatory elements involved in the dimorphic transition were not involved. Fungicidal concentrations of MF also supressed hypha formation and altered the morphology of C. albicans cells. In addition, MF increased the recognition and activation of macrophages of the innate immune system by increasing the production of the proinflammatory cytokine, TNF-α, and the anti-inflammatory, IL-10, that facilitate removal of the fungal infection. Resumen La validamicina A (Val. A) se ha empleado satisfactoriamente para combatir hongos fitopatógenos que afectan a las cosechas. En esta Memoria hemos analizado su posible acción antifúngica contra Candida albicans. Val. A se comportó como un inhibidor no competitivo de la trehalasa ácida de pared (Atc1p), con una CMI50 de 0,5 mg/ml para la cepa parental CAI-4 de C. albicans. El mutante homocigótico nulo atc1Δ, carente de la actividad Atc1p, mostró una mayor resistencia al efecto de la droga. Sin embargo, el poder antifúngico de la Val. A fue limitado en comparación con anfotericina B (AmB), mucho más tóxica. El contenido intracelular de trehalosa aumentó significativamente al aplicar ambas drogas, aunque no se observó un efecto sinérgico entre ellas, por tanto, parece que la inhibición de las trehalasas no es letal para esta levadura. La actividad catalasa resultó alterada, por lo que no parece jugar un papel crucial en la defensa de la integridad celular tras el tratamiento con Val. A. Del mismo modo, este compuesto no afectó a la formación de tubos germinativos, confirmando que la hidrólisis de trehalosa no es esencial durante la morfogénisis. Además, los macrófagos humanos mostraron una sensibilidad a Val. A similar a la observada en C. albicans, lo que descarta su utilidad clínica. Por otra parte, estudios recientes indican que parte del efecto letal de ciertos antifúngicos clínicos se debe a su acción sobre dianas moleculares secundarias, aún desconocidas. En este estudio, hemos analizado la producción de ROS y su implicación en el efecto fungicida de AmB y micafungina (MF) sobre C. albicans. La CMI90 para MF y AmB fue de 0,016 y 0,12 µg/ml, respectivamente (cepa SC5314), mostrando la cepa CAI-4 un comportamiento similar en medio YPD. AmB indujo una fuerte producción de ROS junto a una elevada letalidad en células CAI-4 y SC5314, en YPD y PBS. Sin embargo, MF fue más letal en YPD y con una mayor producción de ROS que en PBS. No obstante, al preincubar las células con rotenona o tiourea, se redujo el nivel de ROS intracelular y se incrementó la viabilidad con ambas drogas. Además, AmB aumentó la síntesis de trehalosa endógena, que actúa como un protector frente a estrés oxidativo en C. albicans. La ruta de las MAP-Quinasas, Hog1, cumple un papel protector esencial contra estrés oxidativo en C. albicans. El mutante homocigótico nulo, hog1Δ, mostró una elevada sensibilidad a AmB respecto a la cepa parental RM-100, a diferencia de MF, cuya acción fue similar en ambas cepas. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de Hog1 en la resistencia de C. albicans a AmB, y el papel de ROS intracelular como factor implicado en la acción antifúngica de AmB, aunque no de MF. No obstante, los dos antifúngicos provocaron una fuerte inducción de las enzimas antioxidantes: catalasa, glutatión reductasa y superóxido dismutasa, especialmente en el mutante hog1Δ. También se analizó la correlación in vitro entre el efecto fungicida de AmB y su hipotética acción sobre la formación de hifas en C. albicans. El efecto inhibitorio producido por AmB sobre la transición dimórfica fue causado por su elevada toxicidad y no por su acción sobre componentes implicados en la morfogénesis. Por su parte, MF también inhibió la formación de hifas y alteró la morfología de C. albicans. Además, MF incrementó el reconocimiento y la activación de los macrófagos, manifestado mediante el incremento en la producción de la citoquina proinflamatoria TNF-α y la antiinflamatoria IL-10, lo que facilita la eliminación de la infección fúngica.
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Aislamiento y caracterización molecular de crg A, un gen regulador de la caroteorogénesis en el hongo Mucor circinelloides / Eusebio Navarro Ros ; director Santiago Torres Martínez
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Genética y Microbiología,, 1999) Navarro Ros, Eusebio
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Análisis estructural y funcional de los genes crgB y mwc-1a de Mucor circinelloides / Jorge Gómez Mateo; directores, Victoriano Garre Mula y Santiago Torres Martínez.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Genética y Microbiología,, 2005) Gómez Mateo, Jorge
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Análisis genómico-funcional de la regulación de la expresión génica por la luz en el hongo Mucor circinelloides
(2016-02-18) López García, Sergio; Garre Mula, Victoriano; Torres Martínez, Santiago; Facultad de Biología
La luz induce una amplia variedad de respuestas relacionadas con la fisiología celular y el comportamiento de muchos organismos. El conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la regulación de esas respuestas es, sin duda, uno de los grandes retos de la biología molecular. Hongos filamentosos, como Neurospora crassa, han contribuido al conocimiento de algunos de los mecanismos moleculares implicados en las respuestas a la luz. La caracterización de los genes white collar-1 y white collar-2 (wc-1 y wc-2), dos genes claves en todas las respuestas a la luz de este hongo, ha sido crucial en el desarrollo de esos conocimientos. Por otra parte, la biosíntesis de carotenos en hongos, como el propio N. crassa o el cigomiceto Phycomyces blakesleeanus, es una de las respuestas a la luz que más atención ha merecido por parte de un número importante de investigadores. El hongo Mucor circinelloides, otro cigomiceto, responde a la luz azul incrementando notablemente la síntesis de carotenos. La carotenogénesis en M. circinelloides está controlada por crgA, un gen que cifra una proteína RING-finger represora de la carotenogenesis. Este gen está evolutivamente conservado desde hongos hasta humanos y, por tanto, no es un gen exclusivo de la carotenogénesis. De hecho, en el propio M. circinelloides regula también procesos de desarrollo, como la formación de hifas aéreas y producción de esporas asexuales. Este gen está presente en prácticamente todos los eucariotas, pero sólo se ha estudiado en los hongos fundamentalmente en M. circinelloides. El gen crgA regula la carotenogénesis a través del control de la expresión del gen mcwc-1b. En concreto, la proteína CrgA está implicada directa o indirectamente en la adición de una o dos ubiquitinas a la proteína Mcwc-1b, lo que supone su inactivación, pero no su degradación. Esta tesis ha caracterizado en detalle las bases moleculares de dicho mecanismo, que ha includo objetivos específicos como la caracterización de la oligoubiquitilación de Mcwc-1b, la identificación y caracterización de genes regulados por crgA de forma dependiente e independiente de mcwc-1b así como genes exclusivamente regulados por mcwc-1b. Mediante mutagénesis dirigida se ha identificado la lisina de Mcwc-1b que es diana de la ubiquitilación mediada por CrgA. Mediante análisis transcriptómico se ha determinado que la expresión de al menos 350 genes, que representan cerca del 3% de los genes identificados en M. circinelloides, depende de crgA, revelando el importante papel de crgA en la regulación de la expresión génica. La regulación ejercida por crgA es principalmente a través de mcwc-1b, sin embargo, ambos son capaces de regular la expresión de algunos genes de forma independiente. Se ha encontrado un enriquecimiento de genes implicados en el metabolismo de aminoácidos y de metabolitos secundarios regulados por crgA. La regulación de un aspecto tan básico como la síntesis de aminoácidos podría significar que este gen también pueda ejercer esta función en eucariotas superiores. Esta tesis también ha caracterizado a nivel transcriptómico la respuesta a la luz en M. circinelloides. M. circinelloides presenta tres genes homólogos al gen wc-1 (mcwc-1a, mcwc-1b y mcwc-1c). En esta tesis se han planteado el objetivo de caracterizar a nivel molecular las respuestas a la luz de M. circinelloides y la implicación de los tres genes wc-1. El análisis transcriptómico realizado en esta tesis ha identificado 146 genes (1,24 % del genoma) regulados por luz, muchos de ellos a través de mcwc-1a, indicando que es elemento principal de control de las respuestas a la luz. La existencia de genes que se inducen en los mutantes en los tres genes mcwc-1 de M. circinelloides, sugiere que existen otros fotorreceptores que podrán ser caracterizados en futuras investigaciones. Light induces a wide variety of responses related to cell physiology and behavior of many organisms. Knowledge of the molecular mechanisms involved in the regulation of these responses is undoubtedly one of the great challenges of molecular biology. Filamentous fungi, such as Neurospora crassa, have contributed to the knowledge of some of the molecular mechanisms involved in responses to light. The characterization of the white collar-1 and white collar-2 (wc-1 and wc-2), two key genes in all responses in the light of this fungus, has been crucial in the development of such knowledge. Moreover, the carotenoid biosynthesis in fungi such as itself N. crassa or cigomiceto Phycomyces blakesleeanus, is one of the responsess to light that more attention has been received by a large number of researchers. The fungus Mucor circinelloides, another cigomiceto, responds to blue light significantly increasing the synthesis of carotenoids. In M. circinelloides carotenogenesis is controlled by a crgA, gene that codes a RING-finger repressor protein of the carotenogenesis. This gene is evolutionarily conserved from yeast to humans and, therefore, it is not an exclusive gene carotenogenesis. In fact, itself M. circinelloides also regulates development processes such as the formation of aerial hyphae and production of asexual spores. This gene is present in almost all eukaryotes, but has only been studied in fungi mainly in M. circinelloides. The gene crgA regulates carotenogenesis through expression control of mcwc-1b gene. Specifically, CrgA protein is directly or indirectly involved in the addition of one or two ubiquitin to mcwc-1b protein, resulting in its inactivation, but not degradation. This thesis has been characterized in detail the molecular basis of this mechanism, which has included when specific goals as characterization of oligoubiquitilación of mcwc-1b, identification and characterization genes regulated by crgA dependent or independent of mcwc-1b and genes exclusively regulated by mcwc-1b. By mutagenesis has been identified lysine is the target crgA mediated ubiquitylation. By transcriptomic analysis has determined that the expression of at least 350 genes, representing about 3% of the genes identified in M. circinelloides, it depends crgA, revealing the important role of crgA in regulation of gene expression. The regulation is mainly exerted by crgA through mcwc-1b, however, both are capable of regulating the expression of some genes independently. It found an enrichment of genes involved in amino acid metabolism and secondary metabolites regulated by crgA. The regulation of such a basic amino acid synthesis as aspect could mean that this gene can also perform this function in higher eukaryotes. This thesis has characterized response to light of M. circinelloides at the transcriptome level. M. circinelloides presents three genes homologous to gene wc-1 (mcwc-1a, mcwc-b and mcwc-1c). In This thesis has been raised the characterization at the molecular level responses to light in M. circinelloides and the involvement of three genes wc-1. Transcriptome analysis in this thesis has identified 146 genes (1.24% of the genome) regulated by light, many of them through mcwc-1a, indicating that it is the main control element of responses to light. The existence of genes induced by light in mutants mcwc-1aΔ, suggests that other photoreceptors that may be characterized in future research.
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Aportación al conocimiento de los hongos del SE. de España. X. Boletales, Agaricales, Rusulales.
(Murcia : Universidad, Servicio de Publicaciones, 1983) Honrubia García, Mario; Llimona, Xavier
Se citan 156 especies de Agaricales, Boletales y Rusulales del SE de España. Son de resaltar la presencia de Leucoagaricus suhvolvatus (Maltón et Bert.) Bon, Amanita gracilior Bas et Honrubia, Inocybe canescens Favre, /. scabella Cooke, Marasmius carpathicus Kalchbr., Mycena quercus- ilicis Kühner, Oudemansiella hadia (Quél.) Moser, Resupinatus applicatus forma kavinii Pilat. Se incluye un mapa de localidades estudiadas, distinguiendo 3 tipos de localidades según el esfuerzo de muestreo sobre ellas llevado.
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Aportación al conocimiento de los hongos del S.E. de España. IV. Tres citas nuevas para la microflora- española: Pustularia insignis, Tuber borchii, Leucogaster d. floecosus.
(Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1981) Honrubia García, Mario; Llimona, Xavier
Dentro de los resultados de nuestro programa de estudio de los hongos del SE español, presentamos en esta nota tres citas nuevas para el catálogo micológico español: dos ascornicetes, Pustularia insignis Berthet & Riousset (Pecizales) y Tuber bovchii Vittadini (Tuberales), y un basidiomicete, género nuevo para España, Le~tcogaster cf. floccosus Hesse (Melaiiogasterales). Realizamos estudio macro y microscópico de las tres especies. Se incluyen dibujos y fotografías, así como un mapa en el que se indican las Iocdidades donde se han encontrado cada una de las tres especies.
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Aportación al conocimiento de los hongos del SE. de España VI: Esclerodermatales, Licoperdales, Niludariales, Falales, Himenogásterales, Podaxales (Gasteromicetes, Basidiomicetes)
(Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1982) Honrubia García, Mario; Calonge, Francisco de Diego; Demoulin, V.; Moreno, G.; Llimona, Xavier
Resultados de las exploraciones micoIógicas realizadas entre 1977 y 1980 en 55 localidades de .Murcia, Albacete, Almería, Alicante y Jaén, en lo referente a Gasteromicetes, con exclusi6n de Tulostomatales. 167 recolecciones corresponden a 28 especies, en general poco conocidas o nuevas para el SE de España. En conjunto pertenece* a: Scleroderma (3, con S. meridionde), Pisolithus ('11, Astraeus (11, Sphaerobolus stellatus, Geastrum (6, con G. badium, G. minimum y G. pseudostriaturn), Langeman- - nia (l), Lycoperdon (3, con L. lividuh y L. foetidum), Bovista (2, con, 3. aestivalis), Calvatia jl), Crucibulurn (l), Cyathus (2, con C. pygmaeus,- conocido solamente del continente americano), Cdus hirudinosus, Clathrus ( 1 1 , Rhizopogon (2), Montagnea arenaria y Gyrophragmium dunaiii.
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Aportación al conocimiento de los hongos del SE de España II. Mixomicetes de la provincia de Albacete
(Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1981) García, E.; Honrubia García, Mario; Llimona, Xavier; Facultad de Química
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Aportación al conocimiento de los hongos del S. E. de España /Mario Honrubia García.
(Murcia : Universidad,, 1982) Honrubia García, Mario
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Aportación al conocimiento de los hongos del S.E. de España. III. mlxomlcetos de Murcia.
(Murcia : Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1984) Honrubia García, Mario; Gracia, E.; Llimona, Xavier; Facultad de Biología
Los autores incluyen 12 nuevos taxones para la flora de Mixomicetos de la provincia de Murcia y nuevas citas de 26 especies ya estudiadas en anteriores trabajos. Se mencionan también las otras especies inventariadas. En total, el catálogo asciende a 58 especies. Se resumen los caracteres distintivos de cada una de las especies.
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Biodisponibilidad in vitro de residuos de fungicidas en vinos : influencia de su presencia en la capacidad antioxidante y biodisponibilidad de compuestos fenólicos
(2016-05-31) Martínez Orenes, Gracia; Oliva Ortiz, José; Cámara Botía, Miguel Ángel; Facultad de Química
Se ha estudiado la influencia de los residuos de fungicidas (metrafenona, mezcla boscalid+kresoxim-metil) aplicados en campo bajo condiciones de buenas y críticas prácticas agrícolas (BPA y CPA) y añadidos en bodega antes de la vinificación (ciafozamida, fenhexamida y mepanipirim), en la actividad antioxidante, compuestos fenólicos y su biodisponibilidad en vinos Tempranillo y Graciano (DO Rioja), durante las vendimias 2012, 2013 y 2014. En primer lugar se ha validado la metodología analítica para la determinación de los fungicidas en uva y vino, mediante extracción multirresiduos QuEChERS con acetonitrilo y análisis por HPLC-MS/MS (triple cuadrupolo). Alcanzando un límite de cuantificación de 0,01 ppm, una linealidad de respuesta (R2 >0,998) y exactitud (70-110%) y precisión con SD< 20%. En los vinos procedentes de uvas tratadas en campo bajo BPA no se superan los LMR establecidos en uva. En los vinos Tempranillo procedentes de tratamientos CPA, kresoxim-metil y metrafenona superan ligeramente el LMR (1,48 y 0,84 frente a 1 y 0,5 ppm, respectivamente). En los vinos fortificados en bodega con fenhexamida, mepanipirim y ciazofamida no se superan los LMR. La presencia de residuos de fungicidas en los vinos Tempranillo no influye significativamente en su actividad antioxidante. En el caso de Graciano, boscalid+kresoxim-metil y metrafenona, presentan diferencias significativas en su capacidad antioxidante. La presencia de residuos de boscalid+kresoxim-metil, fenhexamida y ciazofamida disminuyen los polifenoles totales (índice Folin-Ciocalteu) en Tempranillo. Mientras que metrafenona lo incrementa ligeramente en Graciano. La fracción fenólica más destacada en Tempranillo y Graciano es la de antocianos (70,45 y 77,50 % respectivamente) seguidos de los derivados hidroxicinámicos (18,31 y 13,64 %) y flavonoles (14,62 y 9,95 %). Los estilbenos en vinos Graciano presentan porcentajes ligeramente superiores que en Tempranillo (6,34 frente al 4,98%). La biodisponibilidad in vitro de los fungicidas en vino Graciano presenta un efecto matriz positivo respecto a Tempranillo. Los porcentajes de diálisis oscilan entre 6,1% para kresoxim-metil en Tempranillo, hasta 36,6% para boscalid en Graciano. Mepanipirim en Tempranillo y boscalid en Graciano presentan la mayor biodisponibilidad. Se comprueba que la clarificación tiene un ligero efecto positivo en su biodisponibilidad. En los vinos procedentes de uvas tratadas bajo CPA, los porcentajes de dialización de boscalid y kresoxim-metil se sitúan entre 21-31%, mientras que metrafenona no presenta dialización. En el caso de ciazofamida añadida al mosto no se produce dialización. Se ha constatado que la presencia de residuos de plaguicidas afecta a la biodisponibilidad tanto de la fracción fenólica como de la actividad antioxidante; no encontrando claras diferencias en la dialización de la fracción fenólica para los dos vinos. Los estilbenos son los compuestos fenólicos que presentan mayor porcentaje de dialización (50%). El contenido en polifenoles totales, después del proceso de digestión in vitro del vino, descendió una media del 10% respecto a su contenido inicial en Tempranillo tratado en campo y algo más de un 18% en el caso de ciazofamida añadida antes de la vinificación. Análogamente ocurre en el caso de Graciano, excepto en los tratados con la mezcla boscalid y kresoxim-metil en los que aumenta la biodisponibilidad de los polifenoles hasta un 25%. La presencia de residuos de los fungicidas estudiados afecta la biodisponibilidad de la actividad antioxidante de vinos Tempranillo; lo que no ocurre en Graciano. Por último, se ha constatado que para todos los plaguicidas estudiados la biodisponibilidad in vitro, en general, no supera el 37 % dializado respecto la concentración inicialmente presente en el vino, lo que indica un claro margen de seguridad desde el punto de vista toxicológico. ABSTRACT This paper studies the influence of fungicide residues (metrafenone, boscalid+kresoxim-methyl mix) applied in the field under good agricultural practice conditions (GAP and CAP) and those added in the winery prior to vinification (cyazofamid, fenhexamid and mepanipyrim) on antioxidant activity, phenolic compounds and their bioavailability in wines made from Tempranillo and Graciano grapes (D.O. Ca. Rioja), during the wine harvests of 2012, 2013 and 2014. First the analytical methodology was validated for the determination of fungicides in grape and wine using the QuEChERS multiresidue extraction method with acetonitrile and HPLC-MS/MS (triple quadrupole) analysis up to a maximum quantification of 0.01 ppm, a response linearity (R2 >0,998) and an accuracy (70-110%) and precision with SD< 20%. In the wines made from grapes treated in the field under GAP, the LMR established for grapes were not surpassed. In the Tempranillo varieties under CPA treatments, kresoxim-metyl and metrafenone slightly exceeded the el LMR (1.48 and 0.84 versus 1 and 0.5 ppm, respectively). In the wines fortified in the winery with fenhexamid, mepanipyrim and cyazofamid, the LMR were not exceeded. The presence of fungicide residues in the Tempranillo wines had no significant effect on their antioxidant activity. In the Graciano wines, boscalid+kresoxim-methyl and metrafenone presented significant differences in their antioxidant capacity. Residues of boscalid+kresoxim-methyl, fenhexamid and cyazofamid reduce the total polyphenols (Folin-Ciocalteu index) in Tempranillo. In contrast, metrafenone slightly increases it in Graciano. The most notable phenolic fraction in Tempranillo and Graciano is the antocianos (70.45 and 77.50 % respectively), followed by the hidroxicinnamic derivatives (18.31 and 13.64 %) and flavonols (14.62 and 9.95 %). The stilbenes in Graciano wines show slightly higher percentages than in Tempranillo (6.34 versus 4.98%). The in vitro bioavailability of the fungicides in Graciano wine shows a positive matrix effect with respect to Tempranillo. Dialysis percentages range from 6.1% for kresoxim-metil in Tempranillo to 36.6% for boscalid in Graciano. Mepanipyrim in Tempranillo and boscalid in Graciano present the greatest bioavailability. It is confirmed that the clarification has a slight positive effect on bioavailability. In wines made from grapes treated under CPA, the dialyzation percentages of boscalid and kresoxim-methyl stood between 21 and 31%, while metrafenone did not present dialyzation. No dialyzation occurred for cyazofamid added to the must. It has been shown that fungicide residues affect the bioavailability of both the phenolic fraction and the antioxidant activity, but no clear differences were found in the dialyzation of the phenolic fraction for either wine. The stilbenes were the phenolic compounds that showed the highest percentage of dialyzation (50%). The total polyphenol content after the in vitro digestion of wine fell on average by 10% with respect to the initial content in Tempranillo treated in the field and by more than 18% in the case of cyazofamid added prior to vinification. The results were similar for Graciano, except in the treatments with the boscalid and kresoxim-methyl mix, where the bioavailability of the polyphenols increased by up to 25%. The presence of the fungicides studied affects the bioavailability of the antioxidant activity of the Tempranillo wines, but not that of the Graciano ones. Finally, it has been shown that, in general, for all the pesticides studied the in vitro bioavailability does not exceed 37% dialyzation with respect to the initial concentration present in the wine, which indicates a clear safety margin in toxicological terms.
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Boletus edulis y cistus ladanifer : caracterización de sus ectomicorrizas, síntesis in vitro y área ptoencial= Boletus edulis and cistus ladanifer: characterization of its ectomycorrhizae, in vitro synthesis, and realised niche
(2014-12-03) Águeda Hernández, Beatriz; Fernández Toirán, Luz Marina; Morte Gómez, María Asunción; Escuela Internacional de Doctorado
El grupo Boletus edulis incluye cuatro especies que poseen gran importancia económica por su valor gastronómico: Boletus aereus, Boletus edulis, Boletus pinophilus y Boletus reticulatus. Las Cistaceae son plantas características de las primeras etapas sucesionales, ecológicamente importantes por su papel como reservorio de inóculo de hongos ectomicorrícicos ante perturbaciones ecológicas. Los carpóforos del grupo Boletus edulis son recolectados en algunas regiones de la España Central, en zonas de matorral en las que se producen fuegos recurrentes y que están dominadas por Cistus ladanifer. Esta asociación abre una nueva vía de desarrollo rural sostenible. Describir sus estructuras, comprobar la viabilidad de la asociación en condiciones de laboratorio y calcular su área potencial son pasos previos que permitirán desarrollar su explotación. Los objetivos específicos son: 1. Realizar la descripción de las ectomicorrizas de Boletus edulis y Cistus ladanifer. 2. Comprobar la capacidad de las especies del grupo Boletus edulis para formar ectomicorrizas con Cistus sp. en condiciones de laboratorio, y realizar sus descripciones. 3. Definir el área potencial en la que la asociación entre Boletus edulis y Cistus ladanifer es capaz de producir carpóforos en la España peninsular. La metodología utilizada es: 1. Las ectomicorrizas naturales de Boletus edulis y Cistus ladanifer han sido descritas en base a los estándares de la especialidad. La identificación del simbionte fúngico fue confirmada mediante la comparación de secuencias de la región ITS del rDNA. 2. Ectomicorrizas de Boletus aereus, Boletus edulis y Boletus reticulatus con Cistus sp. fueron sintetizadas en condicones de laboratorio utilizando tubos de síntesis rellenos con turba-vermiculita esterilizada y solución de nutrientes durante 4-5 meses. Las ectomicorrizas se describieron utilizando los estándares anato-morfológicos. 3. Modelos de distribución de especies basados en variables climáticas con corrección litológica fueron utilizados. Los parámetros utilizados incluyen 19 localizaciones en las que Boletus edulis es capaz de producir carpóforos en asociación con Cistus ladanifer. Los resultados obtenidos son: 1. La ectomicorriza formada entre Boletus edulis y Cistus ladanifer tiene los rasgos típicos de los Boletales: blanquecina, con el manto plectenquimatoso, estructuras en forma de anillo y rizomorfos con hifas diferenciadas. Las células de la superficie de los rizomorfos ampulosas, con terminación clavada; y la disposición de sus hifas, ligeramente retorcidas, son otros carateres adicionales. Ninguna hifa tiene fíbulas. 2. Se sintetizaron in vitro micorrizas de Boletus aereus, Boletus edulis y Boletus reticulatus con Cistus albidus y Cistus ladanifer. No se consiguió la formación de micorrizas de Boletus pinophilus. Las micorrizas formadas son todas muy similares, con los rasgos típicos de los Boletales. 3. El nicho climático de Boletus edulis y Cistus ladanifer es mesotérmico, Mediterráneo y húmedo. Los suelos son fuertemente ácidos, con textura limosa, pobres en materia orgánica y con humus oligotrófico. De acuerdo con la curva de presencia predicha / esperada, el 16,3 % del área potencial, 1.785 km2, son considerados óptimos para la asociación entre Boletus edulis y Cistus ladanifer en la España peninsular. Las conclusiones son: 1. Boletus edulis es capaz de producir ectomicorrizas y carpóforos en asociación con plantas hospedantes no habituales. Esta situación favorece el mantenimiento del reservorio de inóculo en el suelo para etapas de sucesión posteriores y puede ser una estrategia de dispersión para asegurar su variación genética. 2. La micorrización controlada y la instalación de plántulas inoculadas puede ser una forma viable y prometedora para explotar este tipo de simbiosis con beneficios económicos. Para conseguirlo, es necesario realizar más investigación y determinar métodos de inoculación apropiados con cepas compatibles, la persistencia de las ectomicorrizas en campo, y los factores que desencadenan la producción de carpóforos. 3. Aunque algunos modelos regionales para ectomicorrizas han sido desarrollados en los últimos tiempos, el conocimiento de la distribución y la organización de la comunidad se encuentra todavía en sus inicios. ABSTRACT The Boletus edulis species complex includes four species: Boletus aereus, Boletus edulis, Boletus pinophilus, and Boletus reticulatus, that have the great economic importance all around the world for their edibility. Cistaceae are plants belonging to primary succession stages, that are ecologically important because they may act as a reservoir of ectomycorrhizal fungi inoculum after a forest disturbance. Boletus edulis sporocarps are regularly observed in certain regions of Central Spain, which have recurrent fires and are dominated exclusively by Cistus ladanifer. Its productive association opens a new way of sustainable rural development. To describe its structures, to check the viability of the association under laboratory conditions and also its realized niche and climatic suitability are previous steps that will allow us to arise a new way to exploiding it. The particular aims of this work are: 1. To provide a detailed description of the ectomycorrhiza of Boletus edulis on Cistus ladanifer. 2. To test the ability of the Boletus edulis species complex to form ectomycorrhizae with Cistus sp. under controlled conditions as well as provide detailed anatomical descriptions of those ectomycorrhizae. 3. To define the realized niche of the ectomycorrhizal association where Boletus edulis produces sporocarps associated with Cistus ladanifer in peninsular Spain. Methods followed are: 1. Detailed anato-morphological description based on standars and identification of the fungal symbiont by ITS rDNA sequence comparison of wild Boletus edulis ectomycorrhiza on Cistus ladanifer has been performed. 2. Ectomycorrhizae of Boletus aereus, Boletus edulis, and Boletus reticulatus were synthesized under laboratory conditions using synthesis tubes filled with a mixture of sterilized peat-vermiculite and nutrient solution for 4-5 months. The ectomycorrhizae formed were described based on standard characters. 3. Species distribution models based on climatic variables and corrected under lithological criteria were used. Parameters have been obtained from various sources including 19 sites where Boletus edulis sporocarps are sure to fruit in pure Cistus ladanifer scrublands. Reached results are: 1. Boletus edulis and Cistus ladanifer ectomycorrhiza has traits typical of Boletales: whitish with plectenchymatous mantle in plan view forming ring-like structures and rhizomorphs with highly differentiated hyphae. The inflated, smooth cystidia-like clavate end-cells on the surface of the rhizomorphs and their slightly twisted external hyphae are additional characterizing features. Not all hyphae have clamps. 2. Ectomycorrhizae of Boletus aereus, Boletus edulis, and Boletus reticulatus were synthesized in vitro with Cistus albidus and Cistus ladanifer. Nevertheless, no Boletus pinophilus ectomycorrhizae where formed. The formed ectomycorrhizae were very similar, with typical traits of Boletales. 3. The climatic niche of Boletus edulis and Cistus ladanifer could be considered as mesothermal, Mediterranean and humid. Soils are strongly acid, with loam texture, low in organic matter, and in an oligotrophic mull form. According to the presence/expected curve, 16.3 % of the potential area, 1,785 km2, is considered to be optimal for this association in peninsular Spain. Conclusions are: 1. Boletus edulis is able to produce ectomycorrhizae and sporocarps in association with unusual host plants. This situation would favour the maintenance of soil inoculum reservoria for successional stages and this fact may be a dispersion strategy to assure genetic variation. 2. Controlled mycorrhization and outplanting of inoculated seedlings might be a feasible and promising way to exploit this symbiosis providing economic benefits. To accomplish this, further research is needed to determine the appropriate inoculation methods with compatible strains, the persistence of ectomycorrhizae on outplanted, inoculated seedlings, and the factors triggering sporocarps production. 3. Although some regional models around ectomycorrhizae have been developed over the last few years, our understanding of the distribution and community organization of ectomycorrhizal fungal communities is still in its infancy. Códigos de términos TESAURO en que se encuadra la Tesis para la base de datos TESEO. 241406 MICOLOGÍA 241900 SIMBIOSIS 310805 HONGOS 241713 ECOLOGÍA VEGETAL Códigos de clasificación UNESCO. 2417 Biología Vegetal (Botánica). 06 Micología (setas).
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Caracterización de la actividad fosfatasa y estudio de la respuesta a la sequía en la simbiosis micorrícica de Helianthemum Almeriense Pau y Terfezia Claveryi Chatin / directoras, María Asunción Morte Gómez, Manuela Pérez Gilabert.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Biología Vegetal,, 2011) Navarro Ródenas, Alfonso
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Caracterización, micorrización y cultivo en campo de las trufas del desierto / Almudena Gutierrez Abbad ; dirección por Mario Honrubia García y Asunción Morte Gómez.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Biología Vegetal,, 2001) Gutierrez Abbad, Almudena
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Clonación y caracterización molecular del gen de la sintetasa del acetil-coa (facA) del hongo Phycomyces blakeslecanus / Victoriano Garre Mula ; directores Francisco J. Murillo Araujo, Santiago Torres Martínez.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Biología,, 1994) Garre Mula, Victoriano
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Conferencia: 'El desarrollo en hongos y la evolución en nuestra forma de entenderlo en los últimos 100 años'
(2010-02-26) Urbina, Luis
Conferencia: 'El desarrollo en hongos y la evolución en nuestra forma de entenderlo en los últimos 100 años'. Unai Ugalde, Universidad del País Vasco. Facultad de Biología. Campus de Espinardo.
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Contribución al conocimiento de los hongos fitoparásitos de la clase ascomyco'tina en Catalunya
(Murcia : Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1984) Moret i Benaset, Assumpció; Nadal i Puigdefabregas, Martí; Facultad de Biología
En esta comunicación se citan unas 50 especies de hongos de la Clase Ascomycotina de interés fitosanitario que pertenecen a distintos órdenes. Las muestras recolectadas, unas 2.800 proceden en su mayoría de las distintas comarcas catalanas y corresponden mayoritariamente a especies cultivadas, sin embargo también se encuentran entre los patrones especies espontáneas carentes prácticamente de interés agrícola.
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Contribución al conocimiento de los hongos acuáticos en el sureste español
(Universidad de Murcia, 2016) Roldán Garrigós, Antonio
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Cpc2 Regula la respuesta a estrés y el ciclo celular en Schizosaccharomyces pombe / Andrés Nuñéz Hernández; director, José Cansado Vizoso.
(Murcia : Universidad de Murcia. Departamento de Genética y Microbiología,, 2010) Núñez Hernández, Andrés
RACK1 (Receptor for Activated C-Kinase-1) es una proteína de 36 kDa identificada por su capacidad para unirse a PKC activada y miembro de la familia de proteínas con dominios WD40. Este grupo de proteínas están involucradas en la regulación de numerosas funciones biológicas como la transducción de señales, el control del ciclo celular, la organización de la cromatina y la muerte celular programada. Concretamente, la actividad de RACK1 ha sido relacionada con la función y envejecimiento neuronal, el desarrollo embrionario, la adhesión celular, la regulación de las rutas de señalización mediadas por MAP quinasas, la regulación de la traducción, el ciclo celular, cáncer y apoptosis. Además, RACK1 es un componente estructural de la subunidad 40S del ribosoma eucariótico, localizando en una región conservada evolutivamente y próxima al túnel de salida de los ARN mensajeros. Cpc2, el ortólogo de RACK1 en la levadura con fisión Schizosaccharomyces pombe, se asocia in vivo con Pck2, uno de los dos ortólogos a la PKC presentes en la levadura con fisión. Los mutantes carentes del gen cpc2+ manifiestan diversos fenotipos, tales como un retraso en la transición G2/M del ciclo celular que conlleva un incremento en el tamaño en división, la dificultad para bloquear el ciclo celular en la fase G1 durante el ayuno de nitrógeno, distintos defectos en la conjugación y esporulación, y sensibilidad al crecimiento a temperatura elevada. Además, se ha descrito que en ausencia de Cpc2 se reduce de manera selectiva la síntesis de algunas proteínas, sin afectar a la síntesis proteica global. De acuerdo con los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, Cpc2 participa en las funciones asociadas a la ruta de integridad celular como la septación, la morfología y el mantenimiento de la integridad de pared, pero de manera independiente de la actividad de Pmk1 (MAP quinasa efectora de esta ruta). Al mismo tiempo, Cpc2 modula el grado de fosforilación/activación de las MAP quinasas Pmk1 (ruta de integridad celular) y Sty1 (ruta SAPK) de modo que, en su ausencia, se incrementa el nivel de fosforilación de ambas quinasas tanto en crecimiento vegatativo como en respuesta a estrés. Este incremento en el nivel de fosforilación de las MAP quinasas se debe a que Cpc2 regula positivamente la traducción de las fosfatasas de tirosina Pyp1 y Pyp2, encargadas de desfosforilar a Pmk1 y Sty1. Como resultado, la falta de Cpc2 reduce específicamente los niveles de proteína de ambas fosfatasas sin que se vean alterados los niveles de los respectivos ARN mensajeros. Además, Cpc2 es también necesario para una correcta adaptación celular frente al estrés, regulando positivamente la traducción de Atf1. Concretamente, las células carentes de cpc2+ ven reducida su viabilidad frente al peróxido de hidrógeno debido, en parte, a la incapacidad de sintetizar cantidades suficientes de catalasa citoplasmática (Ctt1). También demostramos que Cpc2 regula la transición G2/M del ciclo celular a través de la proteína Wee1. Las células carentes de cpc2+ muestran un incremento de esta quinasa Wee1, que inhibe la entrada en mitosis fosforilando e inhibiendo a la quinasa dependiente de ciclina Cdc2, el regulador clave de la transición G2/M del ciclo celular. Adicionalmente, Cpc2 regula positivamente la traducción de la quinasa Cdr2, uno de los principales reguladores negativos de la actividad de Wee1. Los resultados sugieren que en ausencia de Cpc2 las células de S. pombe presentan mayores niveles de Wee1 y más activos. Finalmente, los residuos conservados de Aspártico-36 y Glutámico-38 en Cpc2 son esenciales para su asociación a la subunidad 40S del ribosoma y su actividad biológica. La sustitución de estos residuos por Arginina y Lisina, respectivamente, impiden su unión al ribosoma, provocando que la proteína se acumule fundamentalmente en la fracción citosólica y las células que expresan esta versión de Cpc2 muestran los mismos fenotipos que el mutante nulo. En conclusión, Cpc2 constituye un elemento clave en la regulación traduccional de la levadura S. pombe afectando a múltiples procesos celulares: ejerciendo una regulación selectiva de la traducción de los ARN mensajeros, Cpc2 modula la actividad de las rutas de MAP quinasas favoreciendo la síntesis de las fosfatasas Pyp1 y Pyp2; regula la expresión de elementos involucrados en la respuesta a estrés como el factor de transcripción Atf1 y la catalasa citoplasmática Ctt1 implicados en la detoxificación del peróxido de hidrógeno, y modula los niveles de proteína de Wee1 y Cdr2, regulando así la progresión del ciclo celular. De acuerdo con nuestros datos, es necesaria la unión de Cpc2 al ribosoma para llevar a cabo todas sus funciones biológicas en este microorganismo modelo.
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Cultivo de hongos saprófitos comestibles
(Universidad de Murcia, 2016) Gea, F. J.