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    Análisis del sistema hemostático en neoplasias avanzadas
    (2017-01-11) Morena Barrio, Pilar de la; Corral de la Calle, Javier; Escuela Internacional de Doctorado
    Introducción La relación entre sistema hemostático y cáncer es bidireccional. Los pacientes con cáncer tienen 4-7 veces más riesgo de desarrollar trombosis, especialmente en estadios avanzados de la enfermedad porque los tratamientos, las comorbilidades y las propias células tumorales, especialmente ciertos tipos, provocan diferentes alteraciones en el sistema hemostático que generan un estado de hipercoagulabilidad. Por otra parte, diferentes elementos del sistema hemostático juegan un papel importante en el crecimiento tumoral, progresión y metastatización. Hipótesis y objetivos La hipótesis que generó este trabajo fue que las distintas neoplasias, por el tipo de tumor o por los tratamientos recibidos, podrían provocar una alteración diferencial del sistema hemostático que podría tener relación con el desarrollo de trombosis y con la progresión tumoral. Por ello, el objetivo de nuestro estudio fue evaluar diferentes elementos del sistema hemostático en pacientes con 3 de las 4 neoplasias más frecuentes (cáncer de próstata, colorrectal y de pulmón). Los objetivos específicos fueron: 1. Estudiar si existe una activación diferente del sistema hemostático en distintas neoplasias avanzadas. 2. Analizar la relación entre alteraciones del sistema hemostático y el desarrollo de eventos trombóticos en pacientes con cáncer. 3. Estudiar el efecto de la quimioterapia basada en fluoropirimidinas sobre el sistema hemostático en pacientes con cáncer colorrectal. 4. Estudiar el valor pronóstico de las principales alteraciones del sistema hemostático en pacientes con cáncer. Material y métodos Se incluyeron muestras basales de 157 pacientes consecutivos; 32 con cáncer de próstata resistente a castración; 43 con cáncer colorrectal y 82 con carcinoma de pulmón. Se estudiaron: plaquetas y leucocitos; marcadores de muerte celular (lactato deshidrogenasa –LDH-); hipercoagulabilidad (Dímero D) y de daño endotelial (Factor von Willebrand –FvW-) y tiempos de coagulación (Tiempo de protrombina). Se analizaron la antitrombina y los dos elementos de la ruta de contacto (FXI y FXII) mediante métodos funcionales cromogénicos y/o western blot. Finalmente se estudiaron dos elementos recientemente implicados en trombosis: trastornos de glicosilación y ADN circulante (estudiados mediante electroforesis y HPLC; y por un método de cuantificación fluorescente, respectivamente). En casos excepcionales se realizaron estudios genéticos: secuenciación de genes (SERPINC1 y PMM2) o detección de grandes deleciones mediante MLPA. Resultados y Conclusiones 1. El sistema hemostático se encuentra afectado en pacientes con cáncer. Aunque hay elementos alterados comunes en las distintas neoplasias estudiadas, como son la elevación basal de LDH, DD y FvW, hay otros que varían entre ellas. En cáncer de próstata observamos una tendencia a una mayor activación de FXII que no se acompaña de activación de FXI. En cáncer colorrectal, se observó elevación de FvW y DD, sin activación de la ruta de contacto. En pacientes con CNMP, observamos una mayor incidencia de deficiencia de antitrombina que probablemente sea por consumo como lo sugiere la detección de complejos trombina-antitrombina. 2. La presencia de elevación del FvW en pacientes con cáncer de próstata se asocia con el desarrollo de eventos trombóticos en nuestra serie. No se ha encontrado relación entre el desarrollo de fenómenos trombóticos y otras alteraciones del sistema hemostático. 3. La quimioterapia basada en fluoropirimidinas no provoca alteraciones relevantes del sistema hemostático en pacientes con cáncer colorrectal. 4. Determinadas alteraciones del sistema hemostático, como el aumento de FvW, DD y ADN circulante, se asocian con peor pronóstico en las neoplasias estudiadas. La elevación de FvW se asocia a peor pronóstico en tres de los cuatro tumores estudiados: cáncer de próstata, cáncer colorrectal y CNMP. La elevación de DD se asocia con peor pronóstico en cáncer de próstata. Finalmente, la presencia de concentraciones elevadas de ADN circulante se asocia con peor supervivencia en pacientes con cáncer de próstata y CNMP avanzado. ABSTRACT Introduction There is a strong relationship between the hemostatic system and cancer. Patients with cancer have increased risk (4-7-fold) to develop thrombosis, particularly in advanced stages of the disease, because the treatments, the associated co-morbidities and the features of cancer cells can modify the hemostatic balance, triggering a prothrombotic state. But also the different hemostatic elements play a key role in tumor growth, tumor progression and metastasis. Hypothesis and objectives We propose that the disturbance of the hemostatic system may be different depending of the type of cancer. The type of tumor cell or the treatment used in each tumor may have distinct consequences on the hemostatic balance with potential and different consequences on the risk of thrombosis and the progression of the tumor. Accordingly, the main objective of our study was to evaluate different elements of the haemostatic system in patients with three out of four more prevalent cancer (prostate, colorectal, and lung cancer). The specific objectives were: 1. To study a potential activation of the hemostatic system in different advanced tumors. 2. To analyse the relationship between changes in the hemostatic system and the development of thrombotic events in patients with cancer. 3. To evaluate the effect of chemotherapy based on fluoropirimidines on the hemostatic system in patients with colorectal cancer. 4. To study the prognostic value of the main variations of the hemostatic system identified in patients with cancer. Material and methods Our study included basal samples of 157 consecutive patients with cancer: 32 with prostate cancer resistant to castration; 43 with colorectal cancer; and 82 with lung cancer. These were the parameters analyzed: platelets and leukocites; markers of cell death (Lactato de-hidrogenase –LDH-); hypercoagulability (D Dimer) and vascular damage (von Willebrand Factor –vWF-). Clotting times (prothrombin time and activated partial thromboplastin time) were also evaluated. Additionally, antithrombin and two elements of the contact pathway of coagulation (FXI and FXII) were also evaluated by functional chromogenic methods and/or Western blot. Finally, two elements recently associated with thrombosis: disorders of glycosylation and circulating DNA, were also analyzed in this study by electrophoresis and HPLC and by a fluorogenic method, respectively. Exceptional cases required genetic analysis that included senquencing of genes (SERPINC1 or PMM2) or detection of gross gene defects by MLPA. Results and conclusions 1. The haemostatic system is altered in cancer patients. Several common alterations are observed, including high levels of LDH, D-dimers and von Willebrand Factor (vWF). However, several distinct alterations are observed: in prostate cancer we observe activation of Factor XII; in colo-rectal cancer no activation of the contact route is observed and n non-small cell lung cáncer we observed lower levels of antitrombin factor probably caused by consumption, as these patients also had remarkable levels of thrombin-antithrombin complexes. 2. The presence of higher levels of vWF is associated with the development of thromboembolic events in prostate cancer. We did not observe other associations between thrombosis and alteration of the haemostatic system. 3. Fluoropirimidine-based chemotherapy did not cause relevant disturbances on the hemostatic system in patients with colorectal cancer. 4. Some variations of the hemostatic system such as the increase of vWF, D dimer or circulating DNA, associated with a poor prognosis in cancer. Thus, increased levels of vWF associated with a poor prognosis in three out of four tumors evaluated in this study: prostate, colorectal and non microcytic lung cancer. Rise level of D dimer was also a marker of bad prognosis in prostate cancer. Finally, high values of circulating DNA associated with low survival in patients with prostate and non microcytic lung cancer.
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    Comparación de la adición de bajas dosis de vitamina K al tratamiento con acenocumarol frente al tratamiento tradicional con acenocumarol sobre la estabilidad del efecto anticoagulante y sus complicaciones : influencia de los polimorfismos genéticos en la dosis de acenocumarol
    (2016-02-08) Martínez Penella, Mónica; Trujillo Santos, Antonio Javier; Soria Arcos, Federico; Departamento de Medicina Interna
    El tratamiento de la anticoagulación oral con AVK es complicado debido a que las propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas y su estrecho margen terapéutico, nos llevan a una respuesta variable e impredecible. La variabilidad interindividual al tratamiento con acenocumarol depende de factores no genéticos como la edad, peso, alcohol, tabaquismo, ingesta de vitamina K, interacciones farmacológicas, comorbilidad y factores genéticos siendo las variantes alélicas de los genes CYP2C9 y VKORC1 las más estudiadas en cuanto a la influencia que tienen sobre la respuesta al acenocumarol. Otras variantes alélicas en otros genes tales como Apoliporoteina E (ApoE), α-1 glicoproteina ácida (ORM1-2), Calumenina y Proteina C (PROC) pueden mostrar influencia en la respuesta anticoagulante con acenocumarol. El objetivo de nuestro estudio fue valorar la utilidad de un suplemento de vitamina K en pacientes con fibrilación auricular no valvular y enfermedad tromboembólica venosa, que empezaban tratamiento con acenocumarol, con el fin de optimizar el tiempo de anticoagulación en rango terapéutico (INR 2.0-3.0) tanto en la fase aguda como crónica de la anticoagulación. Además se evaluó la asociación entre los polimorfismos genéticos CYP2C9 (rs1799853, rs1057910), VKORC1 (rs 9923231), ApoE (rs429358, rs7412), ORM1-2 (rs1687390, rs3762055), Calumenina (rs2290228), PROC (rs2069919) tanto con el tiempo como con la dosis necesaria de acenocumarol para alcanzar y mantener el INR en rango terapéutico, permitiéndonos mejorar la eficacia del tratamiento, así como disminuir el número de visitas de control y la aparición de episodios de hemorragia severa consiguiéndose una monitorización más coste-efectiva. Estos objetivos se quisieron confirmar con la realización de un ensayo clínico, en el Hospital General Universitario Santa Lucia, aprobado por el Cómité Ético de Investigación Clínica de dicho hospital y por la Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios (AEMPS), la cual también permitió que se realizara en el Servicio de Farmacia la solución de vitamina K (100μg/ml) y placebo que se les dispensaba a los pacientes participantes en el ensayo tomándose diariamente junto con su dosis de acenocumarol. A todos los pacientes del ensayo se les controló la ingesta de vitamina K en la dieta y se realizó un seguimiento farmacoterapéutico para evitar posibles interacciones y la aparición de efectos adversos. La dosis de inicio de acenocumarol fue 2mg ó ≥3mg y los pacientes que empezaron con una dosis ≥3mg y llevaron solución de vitamina K alcanzaron más rápido el INR terapéutico (2.0-3.0). También se confirmó que los pacientes con un aporte de vitamina K necesitaron más dosis de acenocumarol. Con respecto a los polimorfismos, destacar CYP2C9 (*2 y*3) que alcanzaron en menos tiempo el INR terapéutico, y sobre todo pacientes con el genotipo CA en CYP2C9*3. No se observó asociación entre el TRT y los diferentes polimorfismos estudiados. En cuanto al polimorfismo rs2069919 en PROC destaca el genotipo AA que se asocia con menos mg de acenocumarol semanal necesarios para mantener el INR en rango terapéutico y el genotipo AG con una tendencia a necesitar menos mg de acenocumarol al inicio del tratamiento. Con respecto al estudio de los polimorfismos de los genes Calumenina, ApoE y ORM1-2 nos ofrecen cierta información sobre su relación con el acenocumarol. No se presentó durante el ensayo ningún acontecimiento adverso, ni de hemorragias, ni de sobrecoagulación por lo que no podemos asociar ningún polimorfismo como valor predictivo. Serían necesarios más estudios para clarificar el papel de la vitamina K y la influencia de los polimorfismos en la estabilidad de la anticoagulación con acenocumarol con el fin de mejorar la eficacia y seguridad. Treatment of oral anticoagulation with VKA is complicated because of the pharmacodynamic properties, pharmacokinetics and its narrow therapeutic margin, leading us to a variable and unpredictable response. The interindividual variability in acenocoumarol depends on non-genetic factors such as age, weight, alcohol, smoking, intake of vitamin K, drug interactions, comorbidities and genetic factors being allelic variants of the CYP2C9 and VKORC1 genes the most studied in terms of influence in the response to acenocoumarol. Other allelic variants in other genes such as Apolipoprotein E (ApoE), α -1 -Acid glycoprotein (ORM1-2), Calumenin and Protein C (PROC) can show influence in the anticoagulant response to acenocoumarol. The aim of our study was to assess the usefulness of vitamin K supplement in patients with non -valvular atrial fibrillation and venous thromboembolism, who began treatment with acenocoumarol, in order to optimize the time in therapeutic range of anticoagulation (INR 2.0-3.0) in both acute and chronic anticoagulation. Also the association was evaluated between CYP2C9 genetic polymorphisms ( rs1799853 , rs1057910 ) , VKORC1 (rs 9923231 ) , ApoE ( rs429358 , rs7412) , ORM1-2 ( rs1687390 , rs3762055 ) Calumenin ( rs2290228 ) , PROC ( rs2069919 )with both the time and the necessary dose of acenocoumarol to achieve and maintain the INR within the therapeutic range , allowing us to improve treatment efficacy and reduce the number of monitoring visits and the appearance of episodes of severe bleeding achieving a more cost - effective monitoring. The confirmation of these goals was intended by a clinical trial carried out at the University General Hospital Santa Lucia, approved by the Clinical Research Ethics Committee of the hospital and the Spanish Agency for Medicines and Health Products (AEMPS), which also allowed the production of vitamin K solution (100µg / ml) and placebo in the Pharmacy Service that were served to patients participating in the trial, taken daily along with the dose of acenocoumarol. The intake of vitamin K was controlled in all the patients in the trial and drugs treatments were followed to avoid possible interactions and the occurrence of adverse effects. The staring dose was 2 mg or ≥3mg of acenocoumarol with patients who had started with a dose ≥3mg of vitamin K solution reaching faster therapeutic INR`s (2.0-3.0). It was also confirmed that patients with vitamin K supplements needed more doses of acenocoumarol. Regarding polymorphisms, CYP2C9 (* 2 and * 3) reached the therapeutic INR in less time especially in patients with CA CYP2C9 * 3 genotype. None of the gene variables analyzed was associated with TRT. T As for the rs2069919 polymorphism in PROC it highlights the AA genotype that is associated with fewer weekly mg of acenocoumarol necessary to maintain the INR within the therapeutic range and genotype AG with a tendency to need less mg of acenocoumarol at baseline. Regarding the study of polymorphisms of Calumenin, and ApoE genes ORM1-2 it offers us specific information about the relationship with acenocoumarol. No adverse event was presented during the trial, neither bleeding, or excessive coagulation so we cannot associate any polymorphism as a predictive value. Further studies would be needed to clarify the role of vitamin K and the influence of polymorphisms in the stability of anticoagulation with acenocoumarol in order to improve the efficiency and safety.
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    Estudio experimental de las técnicas de utilización de la hemostasia por aire caliente en las roturas renales
    (Murcia : UNiversidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1987) Agut Giménez, Amalia; Sánchez-Valverde García, Miguel Ángel; Lasaosa Viscasillas, José Manuel; Gómez Sánchez, Miguel Ángel; Facultad de Veterinaria
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    Hemostasia del desarrollo : nuevos mecanismos de regulación de la reactividad plaquetaria en neonatos
    (2017-07-19) Caparrós Pérez, Eva; Martínez Gómez, Constantino; Ferrer Marín, Francisca; Vicente García, Vicente; Facultad de Medicina
    Las alteraciones en la reactividad plaquetaria se han asociado con el desarrollo de procesos trombóticos y hemorrágicos. Los neonatos, especialmente los pretérmino, tienen mayor incidencia de hemorragia intracraneal (HIC) que cualquier otro grupo de edad y, aunque su patogenia es multifactorial, la hiporreactividad de sus plaquetas podría ser un factor contribuyente. Los mecanismos genéticos y moleculares que subyacen a la hiporreactividad de las plaquetas neonatales están pobremente caracterizados, por tanto su estudio tendría una alta relevancia clínica para este grupo de población, pero además también supondría un modelo idóneo donde investigar los mecanismos reguladores de la reactividad plaquetaria, aún poco caracterizados, e identificar nuevas dianas terapéuticas. El objetivo general de esta Tesis era descubrir nuevos mecanismos moleculares responsables de las diferencias funcionales entre las plaquetas de neonatos (PN) y adultos (PA), lo que se abordó a través del estudio de 4 objetivos específicos: (1) estudio diferencial de la expresión génica en PN vs. PA, (2) estudio del perfil de microRNA (miRNA) en PN vs. PA y de su posible papel regulador del transcriptoma plaquetario neonatal, (3) evaluación de las diferencias en adhesión y secreción en PN vs. PA, y (4) evaluación de la expresión y funcionalidad de proteínas G y los reguladores de su señalización (RGS) en PN. Para ello se aislaron plaquetas de sangre de cordón umbilical de neonatos sanos nacidos a término, así como de sangre periférica de un grupo de adultos control sanos. Con RNA procedente de ambos grupos se realizaron dos arrays, uno de expresión génica y otro de miRNA. Las diferencias de expresión en los mRNA y miRNA se validaron en muestras de PN y PA mediante qRT-PCR, realizándose experimentos de transfección para las parejas miRNA:mRNA validadas. A continuación se estudiaron las diferencias de secreción entre PN y PA mediante qRT-PCR y western blot de elementos del complejo SNARE y de la tubulina-β1. Así mismo se realizaron experimentos de cinética de adhesión, estudios morfométricos pre- y post-activación plaquetaria mediante microscopía de fluorescencia y electrónica y evaluación de las poblaciones de exosomas en plasma de neonatos y adultos. Las diferencias entre PN y PA en los niveles de expresión y/o funcionalidad de proteínas G se estudiaron mediante qRT-PCR, western blot y ensayos de activación. Los resultados del array de expresión génica revelaron que existían 201 genes diferencialmente expresados entre PN y PA, 162 sobreexpresados y 39 infraexpresados. Entre los más sobreexpresados en PN se encontraron principalmente: genes que codificaban a proteínas de origen eritroide o asociados con la síntesis y degradación de proteínas. Para el caso de los infraexpresados en PN se observó predominio de los implicados en transporte/metabolismo de calcio, reorganización del citoesqueleto de actina, señalización celular y regulación del ciclo celular. Las rutas más enriquecidas estaban relacionadas con el ribosoma, el proteasoma y el espliceosoma o la proteolisis mediada por ubiquitinación entre otras. Los datos del array de miRNA mostraron un total de 200 miRNA diferentemente expresados, implicados en rutas relacionadas con la biología del desarrollo, la hemostasia y la funcionalidad plaquetaria entre otras. Partiendo del array de expresión génica se seleccionaron 4 genes con relevancia funcional en plaquetas (ADRA2A, GNAZ, RANBP10 y STX11) y para ellos, mediante algoritmos, se seleccionaron 7 miRNA con potencial para regularlos, sin embargo, a pesar de las predicciones in silico los ensayos in vitro no mostraron regulación de ninguno de los 4 mRNA seleccionados por parte de los miRNA estudiados, debido en parte a las limitaciones del estudio in silico. En cuanto al objetivo 3, se encontró, en PN vs. PA, infraexpresión de alguno de los componentes del complejo SNARE (Stx11) y su regulador (Munc18b) lo que podría justificar en parte los defectos en secreción observados en las PN. También observamos una reducción en la adhesión estática y spreading en PN vs. PA, así como diferencias morfológicas en las PN tras la activación y diferencias de tamaño en los exosomas derivados de PN con respecto a los de adulto. Por último, los resultados del objetivo 4 mostraron diferencias de expresión de proteínas G y uno de sus reguladores entre PN y PA: las PN expresaron menos Gαq, Gαz y RGS18 y más Gαs y Gαi2. Además, las PN también mostraron un mayor grado de activación de Gαs. En conclusión, los resultados obtenidos en la presente Tesis identifican, y en algunos casos aclaran, diversos mecanismos moleculares que subyacen a la hiporreactividad de la plaqueta neonatal. Son necesarios estudios futuros para vincular estos mecanismos a procesos patológicos en la población infantil, extrapolarlos a la población adulta y traducirlos en aplicaciones prácticas. SUMMARY Alterations in platelet reactivity have been associated with the development of thrombotic and hemorrhagic processes. Neonates, especially preterm infants, have a higher incidence of intracranial hemorrhage (ICH) than any other group of age. Although ICH pathogenesis is multifactorial, hyporeactivity of the neonatal platelets has been considered a contributing factor. The genetic and molecular mechanisms underlying this hyporeactivity are poorly characterized, and their study may have a high clinical relevance for this population group. In addition comparison between neonatal and adult platelets is also an ideal model to investigate the mechanisms regulating platelet reactivity and to identify new therapeutic targets. The general objective of this Thesis was to discover new molecular mechanisms responsible for functional differences between neonatal platelets (NP) and adult platelets (AP). This was addressed through the study of 4 specific objectives: (1) differential study of NP and AP gene expression, (2) study of microRNAs (miRNAs) in NP vs AP and their potential regulatory role of neonatal gene expression, (3) evaluation of differences in adhesion and secretion in NP vs. AP, and (4) evaluation of the expression and functionality of G proteins and their regulators (RGS) in NP. To accomplish these objectives, blood platelets from umbilical cord of term healthy newborns and peripheral blood from a group of healthy adults were isolated. Two arrays were performed with the RNA of these samples, a gene expression array and a miRNA array. Expression differences in mRNAs and miRNAs were validated in NP and AP samples by qRT-PCR. The effect of miRNAs on selected mRNAs was investigated with transfection experiments in order to find relevant functional miRNA:mRNAs pairs. The secretion differences between NP and AP were studied with qRT-PCR and western blot assays of SNARE complex elements and tubulin-β1. Adhesion kinetics experiments and morphometric studies were performed before and after activation, by fluorescence and electron microscopy, respectively. Neonatal and adult plasma exosome populations were also evaluated. Differences between NP and AP levels in expression and/or functionality of G proteins were studied using qRT-PCR, western blot, and activation assays. The results of the gene expression array revealed that there were 201 genes differentially expressed between NP and AP (162 overexpressed and 39 underexpressed). The most overexpressed genes in NP mainly coded for proteins of erythroid origin or were associated with protein synthesis and degradation processes. In the case of the under-expressed genes in NP, we observed a predominance of those involved in calcium transport/metabolism, actin cytoskeletal reorganization, cell signaling, and cell cycle regulation. The most enriched routes were related to ribosome, proteasome, and spliceosome or ubiquitination-mediated proteolysis among others. The miRNA array data showed a total of 200 differentially expressed miRNAs, involved in pathways related to developmental biology, hemostasis, and platelet functionality among others. From the gene expression array, 4 genes relevant for platelet physiology were selected (ADRA2A, GNAZ, RANBP10 y STX11) and, by means of algorithms, 7 miRNAs with the potential to regulate these genes were selected. However, despite the use of a stringent in silico selection, the in vitro assays did not show any regulation of the 4 mRNAs selected by the studied miRNAs, maybe due to the limitations of the in silico study. Regarding objective 3, an underexpression of some of the components of the SNARE complex (Stx11) and its regulator (Munc18b) was found, which could partially justify the secretion defects observed in NP. We also observed a reduction in the static adhesion and spreading in NP vs. AP, as well as morphological differences in NP after activation and differences in size in plasma NP-derived exosomes as compared to adult. Finally, the results of objective 4 showed differences in G proteins expression and one of their regulators between NP and AP: NP showed lower levels of Gαq, Gαz and RGS18 and higher of Gαs and Gαi2. In addition, NP also showed a greater degree of Gαs activation In conclusion, the results obtained in this Thesis identify, and in some cases clarify, several molecular mechanisms that underlie the hyporeactivity of the NP. Future studies are needed to link these mechanisms to pathological processes in the child population, extrapolate them to the adult population and translate them into practical applications.
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    Plaquetas: características ultraestructurales y su papel en la hemostasia y respuesta inflamatoria
    (Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1996) Bautista, María José; Carrasco, L.; Gómez-Villamandos, J. C.; Martín de las Mulas, J.; Pérez, J.; Méndez, A.; Sierra, M. A.; Facultad de Veterinaria
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    Protocolo para la realización de exodoncias en pacientes sometidos a terapia antiagregante dual
    (2015-06-16) Sánchez Palomino, Paulino; Calvo Guirado, José Luis; Gómez Moreno, Gerardo; Rodríguez Archilla, Alberto; Escuela Internacional de Doctorado
    Objetivos: El propósito de este estudio fue evaluar la eficacia de un protocolo para la realización de exodoncias en pacientes que reciben terapia antiagregante para evitar los procesos trombóticos. Material y métodos: Cuarenta y cuatro pacientes sometidos a extracciones dentales fueron incluidos en el estudio. Las variables evaluadas fueron: fracción de colágeno/epinefrina, fracción adenosin difosfato/colágeno, superficie quirúrgica, medidas post-quirúrgicos, y los efectos adversos. Se aplicó como medida post-quirúrgica a todos los pacientes la sutura alveolar y una gasa impregnadas con un agente antifibrinolítico (ácido tranexámico), que el paciente presiona durante 30 minutos. Se realizó una estadística descriptiva en la que se calcularon y analizaron las variables con la prueba t de Student para comparar pares de variables cuantitativas; Se realizó un análisis de regresión simple utilizando el coeficiente de correlación de Pearson. La significación estadística se estableció en p <0,05. Resultados: fracción de colágeno / epinefrina fue 248,13±69,619 segundos con un rango de 135 a 300 segundos, y el colágeno / ADP fracción fue 113,41±45,498 segundos, ambos valores más altos de los valores normales. Como resultado de las medidas post-quirúrgicas adoptadas los pacientes no han presentado en ningún caso hemorragia postoperatoria, hematoma o infección. Conclusiones: la extracción dental en pacientes en terapia antiagregante dual siempre que apliquemos medidas locales que favorezcan la hemostasia (sutura del alveolo) y aplicación de un agente antifibrinolítico (una gasa impregnadas con ácido tranexámico, que el paciente presiona durante 30 minutos). Abstract Objective: The purpose of this study was to evaluate the efficacy of a protocol for performing dental extraction in patients receiving dual antiplatelet therapy (antiagregant) drugs (clopidogrel and aspirin) to prevent thrombotic processes. Material and methods: Fourty-four patients undergoing dental extractions were included in the study. The variables evaluated were: collagen-epinephrine fraction, collagen- adenosine diphosphate fraction, surgical surface, post-surgical measures, and adverse effects. Alveolar sutures and gauzes impregnated with an antifibrinolytic agent (tranexamic acid), which the patient pressed in place for 30 minutes, were applied to all patients as post-surgical measures. Descriptive statistics were calculated and analyzed with Student’s t-test to compare pairs of quantitative variables; simple regression analysis was performed using Pearson’s correlation coefficient. Statistical significance was set at p<0.05. Results: Collagen/epinephrine fraction was 248,13±69,619 seconds with a range of 135 to 300 seconds, and collagen/ADP fraction was 113,41±45,498 seconds, both values being higher than normal. As a result of the post-surgical measures taken, no patients presented post-operative bleeding, hematoma or infection. Conclusions: Dental extraction was safe for patients receiving dual anti-platelet therapy when using sutures and gauze impregnated with tranexamic acid, which the patient pressed in place for 30 minutes.
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    Regulation of coagulation factors by microRNAs : role in interindividual variability and implications for hemostatic disorders= Regulación de los factores de la coagulación a través de microRNA: papel en la variabilidad interindividual y su implicación en trastornos hemostáticos
    (2016-02-29) Salloum Asfar, Salam; González-Conejero Hilla, Rocío; Martínez Gómez, Constantino; Facultad de Medicina
    En esta tesis, se estudiaron tres aspectos relacionados con el campo de la hemostasia y se presentan en tres capítulos independientes con un nexo común; el papel de los miRNA como nuevos reguladores del sistema hemostático. Objetivos: 1) Evaluar la regulación de FXI por miRNA en hígado humano. 2) Identificar SNP en el 3'UTR de factores de coagulación que desestabilicen la unión de miRNA con consecuencias en los niveles plasmáticos y riesgo de sufrir trombosis. 3) Estudiar el papel indirecto de miRNA sobre la regulación de las proteínas hemostáticas a través de HNF4α. Métodos: Se realizaron microarrays y búsquedas in silico de miRNAs. Líneas celulares humanas, cultivo primario de hepatocitos murinos se emplearon para transfecciones y ensayos de luciferasa. Correlaciones entre los niveles de expresión de miRNAs y mRNAs se realizaron en muestras de hígados. Se incluyeron sujetos de los estudios MEGA y LETS. Para la identificación de variantes en el 3'UTR, se seleccionaron los sujetos con niveles extremos para su secuenciación y genotipado. Resultados: 1. MiR-181a-5p regula la expresión de FXI Predicciones in silico identifican cuatro miRNA como potenciales candidatos a regular la expresión de FXI. Sólo miR-181a-5p redujo los niveles de mRNA y proteína de FXI, y el anti-miR-181-5p aumentó los niveles de mRNA y proteína de FXI en células hepáticas. Los ensayos de luciferasa demostraron una interacción directa entre miR-181-5p y el 3’UTR de F11. En hígados humanos sanos se mostró una correlación inversa y significativa entre los niveles de mRNA de F11 y de miR-181a-5p. 2. Identificación de una variante en el 3’UTR del F11 potencialmente regulada por miRNA En dos estudios caso-control, se secuenciaron los 3'UTR de 9 genes hemostáticos en sujetos con niveles plasmáticos extremos. Se identificaron 26 variantes, 4 de ellas con diferencias significativas entre los grupos de los extremos [F2: rs1799963 (previamente descrita) y F11: rs4253429, rs4253430 y rs1062547]. Los SNP de F11 mostraron un alto desequilibrio de ligamiento con las variantes funcionales descritas rs2289252 y rs2036914. El análisis en controles con el alelo silvestre para estas variantes conocidas de F11 mostró que rs1062547 y rs4253430 se asociaban con un aumento significativo de la actividad FXI. Se evaluaron aquellos SNP que pudieran perturbar la unión de miRNA in silico e in vitro. La predicción in silico reveló que la presencia de estos SNP podrían interferir en la unión de 2 miRNA (rs1062547 con miR-513a-5p y rs4253430 con miR-544). Los ensayos de luciferasa mostraron que sólo miR-544 disminuía significativamente su actividad. Dicha inhibición no se observó cuando se utilizó un vector mutado con rs4253430. 3. MiR-24 y miR-34a regulan la expresión de proteínas hemostáticas a través de HNF4α Se encontraron correlaciones positivas y muy significativas entre los niveles de expresión de HNF4A y dianas hepáticas de la coagulación. Los hígados con niveles extremos de miRNA mostraron asociaciones inversas con los niveles de expresión de factores de coagulación. Estos resultados sugieren que las diferencias en la expresión de mRNA de HNF4A pueden explicar, en parte, las variaciones individuales observadas en la expresión de factores de coagulación en el hígado humano. MiR-24 y miR-34a se unen a varios sitios en HNF4A humano. MiR-24 y miR-34a redujo los niveles diferentes proteínas hemostaticas en HepG2. En tejido hepático sano se observaron correlaciones negativas entre los niveles de HNF4A, miR-24 y miR-34a. Además, miR-24 y miR-34a redujeron los niveles del HNF4α y los niveles de expresión de diferentes proteínas hemostáticas en hepatocitos murinos. Conclusiones: Aproximaciones in silico, in vitro y ex vivo, han mostrado que ciertos miRNA funcionan como reguladores de la expresión de diversos factores hemostáticos. Las consecuencias patológicas de estas regulaciones quedan por ser exploradas. In the present Thesis, I have addressed three points of investigation in the thrombosis field that have been reported as independent Chapters with a common nexus, the role of miRNAs as new regulators of the hemostatic system. Aims: 1) To investigate the potential relevance of miRNAs as new elements that may modulate FXI in human liver. 2) To identify 3’UTR variants in coagulation genes that influence coagulation factor levels and deep vein thrombosis risk through miRNA modulation. 3) To gain a deeper insight into the physiological modulator role of miRNAs in the expression of coagulation factors regulated by HNF4α. Methods: Microarray and in silico search of miRNAs were performed. Human cell lines and Murine hepatocyte primary culture were used for transfections (in vitro validation). Luciferase assays were used. Ex vivo correlations between miRNAs and mRNAs expression levels were performed in liver samples. Study subjects from MEGA and LETS studies were included. For the identification of 3’UTR variants, we selected subjects with extreme levels. Sequencing and genotyping were performed in 3’UTR of hemostatic factors genes. Results: 1. MiR-181a-5p regulates FXI expression in human liver In silico predictions suggest that 4 miRNAs may bind to F11 mRNA. However, only miR-181a-5p inhibits FXI by decreasing levels of both F11 mRNA and protein expression, anti-miR-181-5p increased both mRNA and protein levels of FXI in human. The expression of F11 mRNA in human liver is inversely correlated with the expression of miR-181a-5p, demonstrating for the first time that F11 expression may be regulated by miRNAs. This new regulatory mechanism of F11 expression could partially explain the interindividual variability of plasma FXI found in population. 2. Identification of a variant in the F11 3'UTR potentially regulated by miRNA In two case-control studies, 3’ UTRs of selected coagulation factor genes were sequenced. Four (in F2 and F11) of the 28 variants identified, were clearly more prevalent in low than high levels. F11 SNPs were in partial, inverse linkage (0.4 ≤r2<0.5) with functional variants rs2289252 & rs2036914 previously described. In wildtype carriers of the known variants, rs1062547 and rs4253430 were associated with plasma F11 activity, but none of the variants were associated with venous thrombosis risk. In silico prediction revealed that certain SNPs might disturb the binding sites of miRNAs. In vitro data, confirmed that only miR-544 showed a significant decrease of the luciferase activity in comparison with a scrambled control. This inhibition was not observed when using a mutated vector with rs4253430. 3. MiR-24 and miR-34a regulate several hemostatic proteins expression through HNF4α modulation In human healthy livers we observed significant and positive correlations between expression levels of both HNF4A and several hemostatic proteins. In samples with extreme levels of miR-24 and miR34a, we observed that HNF4A and hemostatic factors transcript levels were inversely correlated. Variations in the expression of these miRNAs could partly explain differences of HNF4A expression levels and therefore levels of several hemostatic factors in healthy subjects. MiR-24 and miR-34a bind to several sites on human HNF4A. In HepG2 cells, miR-24 transfections reduced expression levels of F10, F12, PROC, and PROS1, these latter were also reduced with miR-34a as well asSERPINC1 and PROZ transcript levels. HNF4A transcripts levels were negatively correlated with miR-24 and miR-34a levels in human healthy livers. In murine hepatocytes, miR-24 and miR-34a transfections reduced HNF4α levels and the expression levels of various hemostatic proteins. Conclusions: The present thesis identifies diverse mechanisms implicating miRNAs in the control of hemostasis. Further studies will help in linking these gene-silencing processes with pathologic processes as well as translating them into practical application.