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    Aportaciones a la crioconservación de gametos masculinos en la raza bovina murciano levantina : recongelación de espermatozoides
    (2014-12-19) Almela Veracruz, Laura; Poto Remacha, Ángel; Peinado Ramón, Begoña; Ruiz López, Salvador; Facultad de Veterinaria
    La raza bovina Murciano Levantina (ML) se utilizaba para labores agrícolas por su aptitud de trabajo. Hoy se encuentra en peligro de extinción por pérdida de utilidad ante la aparición de maquinaria agrícola. Los escasos criadores que la mantienen, no se dedican a la producción de ganado bovino, siendo los aspectos del folclore regional los que la hacen acorde con su aptitud de tracción. El Banco de Germoplasma de la raza se inició en el año 2000 y en la actualidad hay 7280 dosis seminales congeladas y almacenadas en N2L, pertenecientes a 13 toros ML, todos ellos muy emparentados. Con estas dosis se atiende tanto a la conservación in vivo, por cesión a los ganaderos y obtención de nuevos reproductores, como a la conservación ex situ in vitro para la futura reconstrucción de la raza en caso necesario; aunque el número de toros es insuficiente, puesto que se requiere semen de 25 toros conservados in vitro. El almacenamiento de dosis seminales es costoso por el aumento continuo de los precios del N2L y actualmente existen métodos para disminuir las necesidades de gametos masculinos; el sexado espermático disminuiría a la mitad estos gastos, aunque posteriormente sería necesaria la recongelación de los gametos. Los objetivos del presente trabajo son conseguir eficacia y eficiencia en el semen recongelado, disminuyendo el número de dosis seminales almacenadas, que serían descongeladas del Banco de Germoplasma, y a las que se les aplicaría un tratamiento similar al requerido por la tecnología de sexado espermático; siendo un objetivo derivado el estudio con técnicas convencionales del semen recongelado y relacionar los parámetros de calidad seminal del semen recongelado con aquellos toros que alcancen mejores valores de fertilidad con semen solamente congelado. Otro objetivo es poner a punto una técnica de recongelación que permita almacenar dosis seminales de forma más eficiente. En este trabajo se han utilizado los datos procesados de dosis seminales de 12 toros de esta raza y los espermatozoides congelados pertenecientes a 6 de esos toros. Los métodos de estudio del eyaculado y de las dosis seminales son los convencionales para la especie bovina. Las técnicas de congelación y recongelación utilizadas son las mismas que para el Banco de Germoplasma. En las experiencias de aplicación de frío, el semen descongelado fue sometido a una recongelación después de haber sufrido un tratamiento (CT), o bien recongelado sin tratamiento (ST). Para conocer el valor de los parámetros estudiados han sido utilizadas técnicas de microscopía óptica y fluorescencia, resistencia en baño de agua termostático, tinciones de E-N, IP, lectinas, azul de toluidina e IA con semen redescongelado a siete novillas de la raza Frisona. En el ganado Murciano Levantino existe variabilidad en los valores promedio de calidad seminal entre los sementales, aunque esto no es debido a la edad. Además, no existen diferencias reseñables en los valores promedio de los parámetros de semen procedente del primer y segundo eyaculado de cada toro. El análisis de los resultados permite conocer el daño en los espermatozoides durante la recongelación, siendo la calidad seminal en el semen descongelado superior a la del redescongelado; con gran variabilidad entre toros. Un semental presentó mejores valores para los parámetros tras la congelación y redescongelación, aunque en algún parámetro no hubo diferencias en ningún toro. Las anomalías espermáticas frecuentemente encontradas fueron las “colas en látigo”, pero ligeramente inferiores en el semen recongelado CT. La inseminación de 7 novillas Frisonas proporcionó un porcentaje de fertilidad del semen recongelado ST del 57’1%, lo que concluye que la recongelación espermática se puede utilizar como técnica de predicción de la fertilidad y ser utilizada para la conservación in vitro. 8. SUMMARY The Murciano Levantina (ML) bovine breed used to be employed for farming purposes because of their work aptitude. Nowadays, it is an endangered breed because it is no longer used for the mentioned purposes due to the arrival of technology and farming equipment. In addition, there are few ML bovine breeders and this is not their main occupation. This breed is mainly used during popular celebrations and festivals for transport. The Germplasm Bank breed has been carried out since 2000 and currently, there are 7280 seminal doses of 13 ML bulls with high consanguinity among them. With these doses it is possible to carry out both in vivo conservation, cession to the breeders and new breeding males; and ex situ in vitro conservation for the future reconstruction of the race -if necessary. Although the number of seminal doses may seem enough for the recovery of the breed in the future, the number of bulls is not sufficient, because the in vitro cryopreservation of spermatozoa belonging to, at least, 25 bulls is necessary. The storage of seminal doses implies more maintenance costs because of the continued increase in prices; currently there are some methods to reduce the male gametes necessities; the sexing sperm could reduce in the middle these expenses, although, afterwards could be necessary the gametes refreezing. The objectives of the present work are to obtain effectiveness and efficiency in refrozen semen, diminishing the number of frozen seminal doses stored at the Germplasm Bank, which would receive a treatment similar to that required by sexing technologies; being a derivative objective to study the usage of conventional technologies of refrozen semen, connecting the refrozen seminal quality parameters with the best fertility parameters in frozen semen. Another goal is the development of a refreezing technique that allows the storage of seminal doses more efficiently. In this work we have used the processed data of seminal doses belonging to 12 bulls of that breed and the frozen spermatozoa of 6 of those bulls. The methods to study the ejaculates and seminal doses are the conventional ones employed in bovine species. The freezing and refreezing techniques used are the same than those used for the Germplasm Bank. In the experiences with the application of cold, the thawed semen was refrozen after undergoing a certain treatment (CT), or it was refrozen without any treatment (ST). In order to know the value of the studied parameters the following methods have been used: the optical and fluorescent microscopy techniques, resistance in thermostatic water bath study, eosine-nigrosine, PI, lectins (PNA) and toluidine blue stainings and artificial insemination using refrozen semen in 7 Frisone breed heifers. In the ML livestock there is variability in the seminal quality average values among the studs, although this is not due to the bulls’ age. Additionally, there are not important differences regarding the average values between the first and the second ejaculation in each bull. Statistical results permit to know the damage in spermatozoa during recryopreservation, and it was observed that the seminal quality is higher in frozen semen than in refrozen semen, with a high variability among bulls. Among the bulls, one of them presented the best results in each parameter studied after cryopreservation and recryopreservation, although there were no differences among the bulls regarding some parameters. The most frequent sperm abnormalities were the “tails in whip”, but they were slightly lower in CT refrozen semen. The artificial insemination of 7 Frisone heifers showed a percentage of fertility with ST refrozen semen of 57’1%. These results conclude that the re-frozen semen can be used as a predictive technique of fertility, and thus, it can be used for the in vitro conservation of the studied bovine breed.
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    Criopreservación espermática en la especie porcina : optimización de la técnica
    (2014-06-04) Martínez Alborcia, María José; Roca Aleu, Jorge; Parrilla Riera, Inmaculada; Facultad de Veterinaria
    La inseminación artificial (IA) es una biotecnología ampliamente utilizada en la industria porcina, jugando un papel fundamental en la mejora de la productividad. Idealmente, los programas de IA en porcino, deberían utilizar espermatozoides congelados-descongelados dadas las ventajas adicionales que poseen en comparación con el semen refrigerado, en particular las relacionadas a la bioseguridad y comercio internacional. Sin embargo, los espermatozoides congelados-descongelados se utilizan con poca frecuencia en los programas de IA porcina comerciales debido a su menor eficiencia con respecto al semen refrigerado, ya que se requieren más espermatozoides por dosis de IA alcanzando por lo general peores resultados de fertilidad. La razón biológica de este hecho está relacionada con la gran sensibilidad de los espermatozoides porcinos a la criopreservación. Además, los espermatozoides que sobreviven a dicho proceso, poseen una vida funcional más corta. El principal objetivo de esta Tesis es el de optimizar el protocolo de criopreservación de espermatozoides de porcino con el fin de mejorar la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación. Para ello, se han desarrollado los siguientes estudios. En el primer estudio, se evaluó el impacto de los espermatozoides no funcionales presentes en los eyaculados de porcino sobre la capacidad de los espermatozoides funcionales para soportar el proceso de criopreservación. Para ello, se congelaron 15 fracciones ricas (FR) de 5 machos fértiles con diferentes proporciones de espermatozoides no funcionales (0- muestra de semen nativa, 25, 50 y 75 %). Tras la descongelación, se evaluaron los espermatozoides mótiles y viables que se recuperaron, así como la funcionalidad espermática en términos de fluidez de membrana de plasmática y producción intracelular de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS) en condiciones de capacitación in vitro. Además, se evaluó la peroxidación lipídica de la membrana plasmática mediante la medición indirecta de la producción de malondialdehído (MDA). Tanto la motilidad (evaluada mediante sistema CASA) como la viabilidad espermática normalizadas (evaluada mediante citometría de flujo y triple tinción de los espermatozoides con Hoechst 33342, H-42; yoduro de propidio, PI, y aglutinina de cacahuete conjugado con fluoresceína, PNA-FITC) fueron menores (p<0’01) cuanta mayor proporción de espermatozoides no funcionales había en las muestras seminales antes de la congelación, independientemente del verraco. Sin embargo, la magnitud del efecto fue diferente (p<0’01) entre los verracos. Las muestras de semen con la mayor subpoblación de espermatozoides no funcionales antes de la congelación mostraron los mayores (p<0’01) niveles de MDA tras la descongelación. En cuanto a la funcionalidad de los espermatozoides supervivientes a la descongelación, la muestra con 75 % de espermatozoides no funcionales antes de la congelación tuvo una generación intracelular de ROS (evaluada con 5-(y-6) clorometil-20,70-dichlorodihydrofluorescein éster acetil diacetato; CM-H2DCFDA) más alta (p<0’01) y un aumento (p<0’01) de la fluidez de la membrana espermática (Merocianina 540, M540) con respecto a la muestra control. El objetivo del segundo estudio fue determinar si los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen antes y durante la congelación influyen en la capacidad de fertilización in vitro (FIV) de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. Usando el mismo diseño experimental que en el estudio anterior, se prepararon y criopreservaron 4 muestras de semen procedentes de 15 FR con las mismas proporciones de espermatozoides no funcionales. Tras la descongelación, las muestras seminales fueron centrifugadas con PorciPureTM. La concentración (evaluada usando un Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) y viabilidad espermática (evaluada del mismo modo que en el estudio anterior) de cada pellet de espermatozoides fueron evaluadas para calcular la cantidad de espermatozoides viables totales en cada muestra de semen tras la centrifugación. La funcionalidad de los espermatozoides, en términos de generación intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear (Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), se evaluó antes y después de la centrifugación con el gradiente de PorciPureTM en condiciones de capacitación in vitro. La capacidad de FIV espermatozoides supervivientes al proceso de criopreservación se evaluó se evaluó de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma) y del desarrollo embrionario. Un total de 1.041 ovocitos madurados in vitro fueron inseminados utilizando un número fijo de espermatozoides viables purificados con PorciPureTM (ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1), independientemente de los diferentes porcentajes de espermatozoides no funcionales de las muestras. El desarrollo embrionario se evaluó a los 2 y 7 días después de la inseminación mediante la tasa de división (porcentaje de ovocitos divididos a 2-4 células/total cigotos putativos cultivados) y la formación de blastocistos (porcentaje de blastocistos/total cigotos putativos cultivados), respectivamente. El número total de células de los blastocistos resultantes se evaluó por tinción de los blastocistos con H-42. Los resultados revelaron que una alta proporción de espermatozoides no funcionales en muestras de semen antes y durante la congelación inducen un aumento (p <0’001) de la generación de intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear en espermatozoides congelados-descongelados. Estos cambios funcionales resultaron en bajas proporciones (p <0’01) de ovocitos penetrados y embriones desarrollados in vitro. En el tercer estudio, se evaluó la eficacia de la selección de espermatozoides usando un gradiente de centrifugación de una sola capa (Single Layer Centrifugation; SLC) antes de la congelación sobre la supervivencia espermática. Para ello, 24 FR recogidas de 24 verracos, se dividieron en 2 grupos en función de sus características seminales iniciales (concentración, morfología, motilidad y viabilidad espermática): estándar (n = 15) y sub-estándar (n = 9). Las muestras seminales de cada FR se dividieron en 2 alícuotas, una permaneció sin tratar (muestras control) y la otra se centrifugó con el gradiente de una sola capa (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 mL de Androcoll-P-Large® (muestras SLC). El rendimiento de espermatozoides totales, motiles (evaluados mediante CASA) y viables (evaluados mediante citometría como se mencionó anteriormente) después de SLC fue mayor (p<0’05) en las muestras estándar que en las sub-estándar. Las muestras de semen fueron criopreservadas. Tras la descongelación, la motilidad y viabilidad espermáticas fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control, independientemente de las características iniciales eyaculado. Además, los espermatozoides descongelados de las muestras SLC fueron más resistentes (p<0’05) a la peroxidación lipídica (Bioxytech MDA - 586 Kit de ensayo) que los de las muestras de control. El tratamiento con SLC también influyó en la funcionalidad de los espermatozoides descongelados bajo condiciones de capacitación in vitro. El porcentaje de espermatozoides viables que mostraron alta fluidez de membrana fue menor (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control. Los espermatozoides descongelados de las muestras SLC generaron menor (p<0’05) cantidad de ROS que los de las muestras control en los eyaculados sub-estándar. El objetivo del cuarto estudio experimental fue el de evaluar la idoneidad y eficacia de SLC, empleando el coloide Androcoll-P-XL®, como un procedimiento de rutina para la selección de los espermatozoides funcionales de los eyaculados de porcino para la criopreservación. Trece FR (una por verraco) se dividieron en tres alícuotas. Dos alícuotas de 15 y 150 mL se centrifugaron (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 y 150 mL (v/v) de Androcoll-P-Large® y Androcoll-P-XL®, respectivamente. La tercera alícuota se mantuvo sin procesa (control). Tras la centrifugación, los porcentajes de espermatozoides morfológicamente normales y con motilidad rápida y progresiva (CASA) fueron mayores (p<0’01) tras en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll -P® utilizado. Sin embargo, el porcentaje de espermatozoides con ADN nuclear fragmentado fue menor (p<0’01) en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll-P® utilizado. Las tasas de recuperación de espermatozoides totales, mótiles, viables y morfológicamente normales oscilaron entre el 20 y 100 %, mientras que los porcentajes de espermatozoides con ADN nuclear intacto oscilaron entre el 60 y 100 %, con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la SLC, las muestras espermáticas fueron criopreservadas. Tras la descongelación, los porcentajes de espermatozoides mótiles, viables y con ADN nuclear intacto, fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en el control con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la descongelación, se inseminaron 679 ovocitos madurados in vitro con un ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1. La SLC también mejoró (p<0’01) la capacidad de FIV de los espermatozoides congelados-descongelados, evaluada de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma). Sin embargo, no hubo ningún efecto de SLC sobre capacidad in vitro de los cigotos putativos para desarrollar a blastocistos. Tras todo lo anteriormente expuesto, podemos concluir que: Los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen de porcino antes de la congelación influyen negativamente en la congelabilidad de los espermatozoides funcionales. Lo cual se evidencia por una reducción en la proporción de espermatozoides funcionales recuperados tras la descongelación y por una menor capacidad fecundante y habilidad para desarrollar embriones in vitro por los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. La selección espermática mediante el gradiente de centrifugación de una sola capa Androcoll-P® utilizado antes de la congelación, mejora la congelabilidad espermática y la capacidad fecundante de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. Artificial insemination (AI) is extensively used by swine producers worldwide, playing a pivotal role in the improvement of herd productivity. Ideally, swine AI-programs should use frozen-thawed (FT) sperm, given its additional advantages compared to liquid-stored semen, particularly those concerning international trade and biosecurity. However, FT-sperm are infrequently used in commercial swine AI programs because of their lower efficiency with respect to liquid-stored semen; more FT-spermatozoa are required per AI dose to achieve typically lower fertility outcomes. The biological reason for the large number of spermatozoa required per AI dose is related to the high cryosensitivity of boar spermatozoa. In addition, the spermatozoa that survive the cryopreservation process exhibit an impaired and shortened functional lifespan. Therefore, this thesis was designed to optimize the boar sperm cryopreservation protocol in order to improve the sperm survival after thawing. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the impact of non-functional spermatozoa on the cryopreservation success of functional spermatozoa was assessed. Fifteen sperm-rich ejaculate fractions (SREF) collected from 5 fertile boars were frozen (following a standard 0.5-mL straw freezing protocol) with different proportions of induced non-functional sperm (0-native semen sample-, 25, 50 and 75% non-functional spermatozoa). After thawing, the recovery of motile and viable spermatozoa was assessed, and the functional of the spermatozoa was evaluated from plasma membrane fluidity and intracellular reactive oxygen species (ROS) generation upon exposure to capacitation conditions. In addition, the lipid peroxidation of the plasma membrane was assessed by the indirect measurement of malondialdehyde (MDA) generation. The normalized (with respect to a native semen sample) sperm motility (assessed by CASA) and viability (cytometrically assessed after staining with Hoechst 33342, H-42; propidium iodide, PI; and fluorescein-conjugated peanut agglutinin, PNA-FITC) decreased (p<0.01) as the proportion of functional spermatozoa in the semen samples before freezing decreased, irrespective of the semen donor. However, the magnitude of the effect differed (p<0.01) among boars. Moreover, semen samples with the largest non-functional sperm subpopulation before freezing showed the highest (p<0.01) levels of MDA after thawing. The thawed viable spermatozoa of semen samples with a high proportion of non-functional spermatozoa before freezing were also functionally different from those of samples with a low proportion of non-functional spermatozoa. These differences consisted of higher (p<0.01) levels of intracellular ROS generation (assessed with 5-(and-6) chloromethyl-20,70-dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester; CM-H2DCFDA) and increased (p<0.01) membrane fluidity (assessed with Merocyanine 540, M540). The objective of the second study was to evaluate the impact of non-functional spermatozoa on the in vitro fertilization (IVF) ability of FT-spermatozoa. Using the same experimental approach as the previous study, 4 sperm semen samples from 15 SREF with the same different proportions of induced non-functional sperm were also prepared and cryopreserved following the protocol indicated above. After thawing, the semen samples were centrifuged with PorciPureTM Bottom Layer. The sperm concentration (measured using a Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) and viability (as indicated in the previous study) of each sperm pellet were assessed to calculate the total viable sperm count in each semen sample. The functionality of the spermatozoa, in terms of intracellular ROS generation and nuclear DNA fragmentation (sperm chromatin dispersion test; Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), was assessed before and after the PorciPureTM centrifugation gradient in sperm samples incubated under capacitating conditions. The IVF ability of cryosurviving spermatozoa was assessed according to oocyte fertilisation (2 pronuclei and a sperm tail inside of the ooplasm) and embryo development. A total of 1,041 in vitro-matured oocytes were inseminated using a fixed number of PorciPureTM-purified viable spermatozoa (viable sperm: oocyte ratio of 300:1), regardless of the differing percentages among the 4 semen samples (native, 25 %, 50 %, and 75 % non-functional spermatozoa). Embryo development was evaluated at 2 and 7 days after insemination by the assessment of the cleavage rate (percentage of oocytes divided to 2–4 cells/total putative zygotes cultivated) and blastocyst formation (percentage of blastocyst/total putative zygotes cultivated), respectively. The total cell number of the resulting blastocysts was evaluated by staining the blastocysts with H-42. The results revealed that high proportions of dead spermatozoa in raw semen samples before and during freezing induce (p<0.001) increased ROS generation and nuclear DNA fragmentation in frozen-thawed spermatozoa. These dysfunctional changes resulted in low ratios (p<0.01) of in vitro penetrated oocytes and healthy developing embryos. The effectiveness of sperm selection using single-layer centrifugation (SLC) prior to freezing on the sperm cryosurvival of boar ejaculates was evaluated in the third study. Twenty-four SREF, collected from 24 boars, were divided into 2 groups according to their initial semen traits: standard (n=15) and substandard (n=9). Semen samples from each SREF were split in 2 aliquots, one remained untreated (control samples) and the other was single-layer centrifuged (500 g for 20 min) using 15 mL of Androcoll-P-Large® (SLC-samples). The yield of total, motile (assessed by CASA) and viable (cytometrically evaluated as mentioned above) sperm after SLC was higher (p<0.05) in standard than substandard semen samples. The semen samples were cryopreserved using a standard 0.5-mL straw freezing protocol. Post-thaw sperm motility and viability were higher (p<0.05) in SLC than in control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Additionally, thawed spermatozoa from SLC samples were more resistant (p<0.05) to lipid peroxidation (BIOXYTECH MDA-586 Assay Kit) than those from control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. The SLC-treatment also influenced the functionality of thawed spermatozoa undergoing an in vitro capacitation process. The percentage of viable sperm showing high membrane fluidity (assessed with M540) was lower (p<0.05) in the SLC than in the control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Thawed viable spermatozoa of SLC samples generated less (p<0.05) reactive oxygen species (assessed with CM-H2DCFDA) than those of control samples in the substandard ejaculates. The objective of the fourth experimental study was to evaluate the suitability and effectiveness of SLC as a routine procedure for selecting boar spermatozoa for cryopreservation. Thirteen sperm rich ejaculate fractions (one per boar) were split into three aliquots. Two aliquots of 15 and 150 mL were SLC-processed (500 g for 20 min) using 15 and 150 mL (v/v) of Androcoll-P-Large® and Androcoll-P-XL®, respectively. The third aliquot remained un-processed as a control. The percentages of spermatozoa that were morphologically normal and showed rapid and progressive motility (assessed by CASA) spermatozoa were higher (p<0.01) and those with fragmented nuclear DNA were lower (p<0.01) after SLC than control semen samples, regardless of the Androcoll-P® used. The recovery rates of total, motile, viable (flow cytometric evaluated after staining with H-42, PI and FITC-PNA) and morphologically normal spermatozoa ranged between 20 and 100% and those with intact nuclear DNA ranged between 60 and 100%, irrespective of the Androcoll-P® used. Thereafter, the semen samples were cryopreserved as mentioned above. Post-thaw percentages of sperm motility, viability and intact nuclear DNA were higher (p<0.05) in SLC-processed than in control semen samples, irrespective of the Androcoll-P® used. SLC-processing also improved (p<0’01) the IVF ability of FT-sperm (679 in vitro matured oocytes inseminated with a viable sperm:oocyte ratio of 300:1 following the same procedure mentioned above), measured as the percentage of penetrated oocytes and the mean number of swollen sperm heads and/or male pronuclei in penetrated oocytes. However, there was no effect of SLC-processing on the in vitro ability of putative zygotes to develop to blastocysts. The results achieved in these four experimental studies have generated the following conclusions: Non-functional spermatozoa present in boar semen samples before freezing negatively influence the cryopreservation of functional spermatozoa by reducing the proportion of recovered surviving spermatozoa after thawing and also by altering the functional and fertilisation ability of the sperm that survive the cryopreservation process. Single Layer Centrifugation prior to freezing improves the boar sperm cryopreservation and post-thaw fertilisation ability of cryosurvival spermatozoa. However, further studies aimed at optimising the yield of SLC procedure are needed.
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    Efecto del fluido oviductal, α-L-fucosidasa y óxido nítrico sobre la interacción de gametos en la especie porcina = Effect of oviductal fluid,α-L-fucosidase and nitric oxide on porcine gamete interaction
    (2015-03-03) Romero Aguirregomezcorta, Jon; Coy Fuster, Pilar; Matas Parra, Carmen; Facultad de Veterinaria
    La especie porcina es considerada el modelo animal idóneo para el estudio y desarrollo de terapias contra enfermedades humanas debido a sus similitudes genéticas, anatómicas y fisiológicas con el hombre. Sin embargo, la eficiencia de la producción in vitro (PIV) de embriones porcinos para utilizarlos con este fin sigue siendo muy baja, pues aun persisten los problemas de la fecundación polispérmica y las condiciones de cultivo subóptimas. Por estos motivos, se pretende profundizar en el conocimiento de los diferentes factores relacionados con el oviducto porcino que pudieran ser utilizados para modular el proceso de la fecundación in vitro (FIV) y contribuir a la mejora de los sistemas de PIV de embriones. La presente tesis aborda tres posibles vías de mejora diferentes en cuanto a complejidad e implicaciones fisiológicas consistentes en la adición al medio de cultivo de tres tipos de compuestos: fluido oviductal (FO), α-L-fucosidasa y óxido nítrico (NO). El objetivo del primer estudio fue determinar las condiciones óptimas de inclusión del FO en los protocolos de FIV. Para ello, se preincubaron ovocitos madurados in vitro con FO pre o postovulatorio y se realizó FIV. Se midieron las concentraciones de E2 y P4 en el FO. Finalmente se comparó la eficiencia de la FIV al utilizar semen fresco o congelado con ovocitos preincubados en FO preovulatorio. La eficiencia de la FIV porcina mejoró con la preincubación en FO preovulatorio. Cuando se utilizó semen congelado su capacidad de penetración aumentó comparando con semen fresco. La concentración de E2 en el FO preovulatorio fue mayor que la determinada en sangre para la misma fase del ciclo estral y la adición de E2 al medio de FIV a la concentración detectada en el oviducto produjo un efecto similar al de la adición de FO. Concluimos que la preincubación de los ovocitos en FO preovulatorio o la adición de E2 pueden considerarse protocolos adecuados para aumentar la eficiencia de la FIV porcina con semen fresco. En el segundo estudio se investigó el papel de la α-L-fucosidasa durante la FIV porcina. Para ello se añadió la enzima al medio de FIV y se observó un incremento en la penetración y en la unión de espermatozoides a la zona pelúcida (ZP). Se realizó inmunofluorescencia indirecta para detectar la α-L-fucosidasa espermática y finalmente se realizaron estudios de capacitación espermática, demostrándose que la α-L-fucosidasa aumenta los niveles de [Ca2+] intracelular y la fosforilación de tirosina. Por lo que concluímos que la α-L-fucosidasa estimula eventos relacionados con la capacitación en espermatozoides porcinos, dando lugar a una mayor capacidad de unión a la ZP y de penetración al ovocito. En el tercer estudio se investigó el papel del NO durante la maduración in vitro (MIV) porcina. Para ello se suplementó el medio de MIV con tres inhibidores distintos de la óxido nítrico sintasa (NOS) y con un donante de NO. Se estudió la expansión de las células del cúmulus y la reanudación de la meiosis, la resistencia de la ZP a la digestión enzimática y parámetros relacionados con la FIV. Los resultados mostraron que los tres inhibidores ejercían un efecto sobre la expansión de las células del cúmulus y que la reanudación de la meiosis solamente se vio detenida al añadir el inhibidor aminoguanidina. Posteriormente, se planteó la posibilidad de que la inhibición de las NOS afectara a la S-nitrosilación de proteínas del ovocito. Para ello se realizó nitrosilación in situ cuantificándose la intensidad de fluorescencia. De este modo, se demostró que la S-nitrosilación de proteínas es una de las vías por la que el NO ejerce su efecto en el ovocito, revelando la importancia del NO en la MIV. The porcine species, owing to their genetic, anatomic, and physiologic similarities with humans, is considered as the ideal animal model for studying and developing novel therapies against human diseases. However, the efficiency of porcine embryo in vitro production (IVP) is nowadays still unacceptably low, because the problem of polyspermic fertilization has still not been adequately worked out and the embryo in vitro culture conditions are still considered to be suboptimal. For these reasons, the present doctoral thesis aims to deepen the understanding of the different factors related to the physiology of the pig oviduct that could be used to modulate the in vitro fertilization (IVF) process and contribute to improve pig embryo IVP systems. Therefore, we investigate three different ways of improvement, in terms of complexity and physiological implications, such as: 1) the oviductal fluid (OF), 2) α-l-fucosidase, 3) nitric oxide (NO). The aim of the first study was to determine the optimal conditions for the OF inclusion in the IVF protocols. For this purpose, in vitro matured oocytes were pre-incubated in OF collected before or after ovulation and subsequently used for IVF. Steroids concentrations in OF were measured and used in IVF experiments. Finally the IVF efficiency was compared between fresh or frozen semen with oocytes preincubated in preovulatory OF. Results showed that pig IVF efficiency improved with preincubation in preovulatory OF. When frozen-thawed semen was used with preovulatory OF incubated oocytes, penetration ability and polyspermy increased. The estradiol (E2) concentration in preovulatory OF was greater than that determined in blood serum at the same phase of the estrous cycle. We conclude that preincubation of oocytes in preovulatory OF or the addition of E2 can be considered suitable tools to increase the efficiency of IVF, only with fresh semen, in the pig. In the second study the role of α-L-fucosidase in pig IVF was investigated. Therefore, the enzyme was added to the IVF medium and a significant increase in sperm binding to the zona pellucida (ZP) and penetration was observed. Thereafter, the sperm-associated α-L-fucosidase was detected by indirect immunofluorescence. In this case, neither the intensity of fluorescence nor the patterns of sperm-associated α-L-fucosidase distribution were affected. Finally, experiments focused on the study of the capacitation events were conducted. The results showed that the addition of exogenous α-L-fucosidase increased the sperm intracellular [Ca 2+] and P-tyrosine phosphorylation, suggesting a role in promoting capacitation and at the same time protecting the sperm cells from premature acrosome reaction. This sequence of events would, in turn, explain the increased ability of this population of treated spermatozoa to bind ZP and penetrate the oocyte. The third study arose to determine the effect of NO during pig oocyte maturation. In vitro maturation (IVM) medium was supplemented with three NOS inhibitors, and a NO donor. The effects on cumulus cells expansion, meiotic resumption, ZP resistance to enzymatic digestion and various parameters related to IVF were studied. The results showed that after IVM, the three NOS inhibitors exerted an inhibitory effect on cumulus cells expansion, while meiotic resumption was suppressed only when the inhibitor aminoguanidine was added. Subsequently, to determine whether the NOS inhibition affect the S-nitrosylation of oocyte proteins, we performed in situ S-nitrosylation and the fluorescence intensity was quantified. Thus, it was shown for the first time that the S-nitrosylation of proteins is one of the ways by which NO exerts its effect on porcine maturation, revealing the importance of NO in both IVM and subsequent fertilization.
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    Estudio sobre la calidad seminal en jóvenes universitarios de la Región de Murcia
    (2015-11-03) Sarabia Cos, Laura; Torres Cantero, Alberto Manuel; Mendiola Olivares, Jaime; Arense Gonzalo, Julián Jesús; Facultad de Medicina
    Diversos estudios muestran una disminución en la concentración espermática en las últimas décadas, aunque en este hecho se han observado diferencias geográficas importantes. El descenso de la concentración espermática se ha atribuido a exposiciones a tóxicos y contaminantes ambientales, estilos de vida o ciertos factores nutricionales pero que, en gran medida, son aún desconocidos, permanecen inexplorados o no han sido suficientemente estudiados. Entre 2010 y 2011 se llevó a cabo un estudio transversal en jóvenes universitarios de la Región de Murcia (n=215) con el propósito de estudiar su calidad seminal. Los participantes proporcionaron una muestra seminal, se les realizó un examen andrológico y cumplimentaron cuestionarios epidemiológicos sobre hábitos de vida, incluido un cuestionario de frecuencia alimentaria. El análisis de los parámetros seminales se realizó siguiendo las recomendaciones de la OMS (2010) y también se analizó la fragmentación del ADN espermático mediante el método de dispersión de la cromatina espermática (SCD). A partir de los datos de este estudio, en la presente tesis doctoral se profundiza en el estudio de la calidad seminal en jóvenes varones, abordando el problema desde distintos aspectos. En el primer trabajo se estudió la asociación entre la ingesta dietaria de nutrientes antioxidantes y la calidad seminal en dichos varones. Los resultados indicaron una asociación positiva entre el consumo de distintos nutrientes antioxidantes (criptoxantina, vitamina C, licopeno y b-caroteno) y el recuento total de espermatozoides móviles. El volumen seminal también aumentó con una mayor ingesta de vitamina C, licopeno y b-caroteno. En conclusión, nuestro estudio sugirió que algunos parámetros espermáticos podrían ser sensibles a la ingesta de nutrientes antioxidantes, y que la recomendación actual de ingesta de vitamina C podría ser insuficiente para alcanzar el máximo beneficio en términos de calidad seminal. En el segundo trabajo, el objetivo fue examinar si la calidad seminal había variado durante la última década entre los jóvenes del sureste español. Para llevar a cabo este trabajo se utilizaron los datos obtenidos en un estudio anterior realizado en Almería entre 2001 y 2002. Los datos del estudio de Almería se incluyeron en un análisis de tendencias junto con los datos relativos a los jóvenes estudiantes murcianos. Se utilizó modelos de regresión lineal múltiple para analizar en la población combinada un efecto de cohorte de nacimiento durante el período de estudio 2001-2011. Nuestros resultados indicaron que el recuento total y la concentración espermática podrían haber disminuido en los jóvenes del Sureste español durante la última década, mostrando una tendencia temporal adversa en dichos parámetros. En el sur de España recientemente ha tenido lugar un aumento de la industrialización, y con ello, un aumento del riesgo de posibles exposiciones potencialmente adversas que podrían afectar a distintos parámetros reproductivos masculinos. En el tercer trabajo se estudió la fragmentación del ADN espermático en los jóvenes varones. Dicha fragmentación podría estar relacionada con procesos de estrés oxidativos y comprometer la calidad seminal. Por una parte, se describieron y analizaron los índices de fragmentación del ADN espermático (SDF) de las muestras tras la eyaculación, lo que se denominó como SDF basal. Y por otro lado, se estudió la dinámica de la fragmentación del ADN espermático, es decir, el incremento de la fragmentación del ADN con el tiempo tras la eyaculación. Para estudiar la dinámica se incubaron las muestras a 37ºC durante 2.5, 17 y 24 horas y se calculó la tasa de fragmentación del ADN espermático (rate SDF; rSDF). Los resultados obtenidos indicaron unos valores medios de SDF basal relativamente altos comparados con otros estudios publicados. La rSDF fue mayor durante las primeras horas tras la eyaculación. Por otra parte, las muestras con SDF basal superior a 30% presentaron una rSDF mayor durante las primeras horas de incubación comparadas con las muestras con niveles basales inferiores a 15%. Summary In the last decades several studies have shown a decrease in human sperm concentrations. In spite of this fact, there have been significant geographical differences. The decline in sperm count has been attributed to exposure to environmental toxins and pollutants, lifestyle or certain nutritional factors which are still largely unknown, unexplored or have been understudied. Between 2010 and 2011 we conducted a cross-sectional study among university students in the Region of Murcia (n = 215) in order to study their sperm quality. Participants provided a semen sample, underwent an andrological examination, and filled out epidemiological questionnaires on lifestyle and a food frequency questionnaire. The seminal analysis was performed following the WHO guidelines (2010) and sperm DNA fragmentation was also analyzed by the sperm chromatin dispersion method (SCD). From all this data, the current thesis explores the semen quality in young males, approaching the problem from different perspectives. In the first study, the association between dietary intake of antioxidant nutrients and semen quality was studied. The results indicated a positive association between the consumption of various antioxidant nutrients (cryptoxanthin, vitamin C, lycopene and b-carotene) and total motile sperm count. The seminal volume also increased with a higher intake of vitamin C, lycopene and b-carotene. In conclusion, our study suggested that some sperm parameters could be sensitive to the intake of antioxidant nutrients, and that the current recommended intake of vitamin C may be insufficient to achieve the maximum benefit in terms of semen quality. In the second study, the aim was to examine whether semen quality has changed among Spanish young men in the last decade. To carry out this study we used data obtained in a previous study in Almeria between 2001 and 2002. This data was added to our current population in order to analyze the sperm quality trend in Southern Spain. Multiple linear regression models were used to analyze the combined effect of population birth cohort during the study´s period 2001-2011. Our results indicated that the total count and sperm concentration may have decline in young Spanish men over the last decade, showing an adverse temporal trend in these parameters. Southern Spain has recently gone through a growing innovation and industrialization in many areas, and with this, an increased risk of potential adverse exposures, which might affect reproductive parameters in men. In the third study, the sperm DNA fragmentation was studied in young men. Such fragmentation could be related to oxidative stress and compromise semen quality. On the one hand, sperm DNA fragmentation (SDF) of the samples after ejaculation was analyzed, which was named as basal SDF. On the other hand, the dynamics of sperm DNA fragmentation, that is the increase of DNA fragmentation after ejaculation time was studied. To study the dynamics, samples were incubated at 37°C for 2.5, 17 and 24 hours and the rate of sperm DNA fragmentation (SDF rate; rSDF) was calculated. The results showed average values of basal SDF relatively high compared with other published studies. The rSDF was higher during the first hours after ejaculation. Besides, the samples with basal SDF higher to 30% showed an elevated rSDF during the first hours of incubation compared with the samples with basal levels lower than 15 %.
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    Influencia del plasma seminal en la criopreservación espermática y en la separación de espermatozoides X e Y en la especie porcina
    (2014-11-03) Vilela Alkmin, Diego; Roca Aleu, Jorge; Parrilla Riera, Inmaculada; Facultad de Veterinaria
    Los avances tecnológicos en la reproducción porcina han ocurrido, en parte, debido a la creciente comprensión de las ventajas de la utilización de verracos con características superiores en programas genéticos. Tecnologías reproductivas como la criopreservación y la separación espermática mediante citometría de flujo, como método para predeterminar el sexo de la progenie, proporcionan una valiosa herramienta para la mejora genética. Sin embargo, estos procedimientos normalmente tienen un impacto perjudicial sobre la calidad espermática, en cierta medida, atribuida a la dilución que se produce durante el procesamiento, y la consiguiente disminución en la concentración del plasma seminal (PS). Por ello, esta Tesis Doctoral propone una serie de experimentos orientados a mejorar el conocimiento sobre la influencia del PS de porcino en la criopreservación espermática, evaluando la influencia de la incubación antes de la congelación de las muestras espermáticas en su propio PS, proveniente bien del eyaculado completo o bien de alguna de sus fracciones/porciones, sobre la calidad y la funcionalidad espermática tras la descongelación y capacidad de separación de espermatozoides X e Y por citometría de flujo, evaluando la relevancia del PS en la variabilidad observada en la eficiencia del proceso de separación y su posterior repercusión en la calidad y funcionalidad de los espermatozoides separados conservados a 15-17 °C. En su conjunto estos estudios demuestran que la incubación de los espermatozoides de porcino en su propio PS influye sobre la capacidad de dichos espermatozoides para soportar la criopreservación y también la separación espermática en poblaciones X e Y mediante citometría flujo. El PS de la fracción post FRE tendría un efecto negativo sobre la congelabilidad espermática, mientras que la incubación de los espermatozoides en presencia de una alta proporción de PS perjudicaría la eficiencia del proceso de separación. Palabras clave: semen, criopreservación, epidídimo, espermatozoide, semen sexado, plasma seminal, período de incubación, semen refrigerado, verraco, porcino. Summary Technological advances in pig reproduction have occurred in part because of the growing understanding of the benefits of using boars with superior characteristics in genetic programs. Reproductive technologies such as sperm cryopreservation and sperm sex-sorting by flow cytometry as a method to predetermine the sex of offspring provide a valuable tool for the genetic improvement. However, these methods usually have a detrimental impact on sperm quality, to some extent, attributed to the dilution that occurs during processing, and the resulting decrease in the concentration of seminal plasma (PS). Thus, the present Doctoral Thesis proposes a series of experiments aimed to improve the knowledge of the putative effects of porcine SP on sperm cryopreservation by evaluating the influence of holding time of ejaculate sperm before freezing surrounded in their own SP, from either entire ejaculate or some ejaculate specific fractions/portions, on post-thawing sperm quality and functionality and on sperm sex-sorting procedure; by evaluating the relevance of ejaculate SP on inter- and intra-boar variability in sperm sortability and on capability of sex-sorted sperm to tolerate liquid storage at 15-17 °C, assessed according to sperm quality and functionality. Taken together these experiments show that holding boar sperm in their own SP negatively influences their ability to withstand cryopreservation, particularly the SP from post-SRF, and flow-based sex-sorting procedure. Keywords: semen, cryopreservation, epididymis, sperm, sex-sorting, seminal plasma, holding time, liquid storage, boar, porcine.
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    Parámetros testiculares y características morfológicas de los espermatozoides epididimarios obtenidos postmorten en el toro de lidia
    (Murcia: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Murcia, 2012) Saavedra, G.D.; Mas, A.; Sanes Vargas, José Manuel; Vallejo, P.; Matas Parra, Carmen; Seva Alcaraz, Juan; Facultad de Veterinaria
    En el presente trabajo se han evaluado determinados parámetros testiculares y características morfológicas de los espermatozoides epididimarios obtenidos postmortem en el toro de lidia, teniendo en cuenta la edad, el peso del animal, la circunferencia escrotal, peso y longitud testicular, y sus variables espermáticas. Se analizaron 12 pares de testículos de toros lidiados en una Plaza de Toros, procedentes de doce astados encaste Domecq de dos ganaderías. Una vez llegado el toro al desolladero de la plaza, se midió la circunferencia escrotal, se extrajeron los testículos y se conservaron a una temperatura de 5ºC, previamente identificados. Posteriormente en laboratorio se realizó el pesaje y medición de cada testículo, se diseccionó la cola del epidídimo para conseguir la muestra. Se midió volumen, concentración espermática, motilidad. Por último se realizaron extensiones con la tinción de eosina nigrosina y se valoraron espermatozoides vivos y muertos, células normales, células anormales y acrosomas normales. La muestra obtenida de cada testículo, fue diluida en una proporción 1:2 con un diluyente comercial (Steridyl®), ambos atemperados a 37ºC, antes de realizar las tinciones y las extensiones. Con el fin de estudiar las características espermáticas y los parámetros testiculares de toros de lidia provenientes de dos ganaderías, se realizó un diseño completamente al azar con un arreglo factorial 2x2 (dos ganaderías y dos testículos). Los resultados muestran que hay diferencias significativas (p<0,05), de peso testicular entre la ganadería 1 de 467,33±17,89 y la ganadería 2 de 500,33±16,23. Para la variable circunferencia escrotal existen diferencias significativas (p<0,01) entre la ganadería 1 de 33,5±0,55 y la ganadería 2 de 36,5±1,52; encontrándose la misma diferencia significativa para el peso del testículo derecho e izquierdo, entre la primera ganadería de 295±4,56 y 293,5±4,41, y la segunda de 323,17±14,61 y 321,12±14,93 respectivamente. Para las demás variables evaluadas, concentracíón espermática, la motilidad individual, vivos y muertos, morfoanomalías y acrosomas normales, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). En general, se encontró que en las variables que hubo diferencias estadísticamente significativas, siempre se presentaba entre ganaderías y no tuvo que ver nada el efecto testículo.
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    Productive output of post-cervical insemination in porcine : study of sperm selection in the female genital tract through backflow analysis = Rendimiento productivo de la inseminación post-cervical en la especie porcina : estudio de la selección espermática en el tracto genital de la hembra a través del análisis del reflujo
    (2015-09-08) Hernández Caravaca, Iván; García Vázquez, Francisco Alberto; Izquierdo Rico, María José; Facultad de Veterinaria
    El objetivo principal de este trabajo fue el estudio y rentabilidad de la aplicación de la inseminación post-cervical en granja así como el estudio de la influencia de distintas poblaciones espermáticas con diferentes características en su selección en el útero de la cerda; para ello se analizaron los espermatozoides que fueron expulsados en el reflujo tras la inseminación y aquellos que llegaron a la unión útero-tubárica. Los resultados se reflejan en la publicación de cuatro artículos. En el artículo I, los resultados mostraron que la aplicación de inseminación post-cervical tiene unos rendimientos reproductivos similares o superiores que la inseminación cervical, siendo los rendimientos mayores cuando se inseminan cerdas con 2-3 o ≥6partos.Al mismo tiempo se realizó un estudio económico detallado de la aplicación de la inseminación post-cervical en granja, siendo éste sustancialmente beneficioso al aplicar dicha técnica en comparación con la inseminación tradicional. Además, se pudo observar que tanto el volumen (%) como el número de espermatozoides (%) en el reflujo eran superiores cuando se utilizaba la inseminación cervical en relación a la post-cervical. Por otro lado, la calidad espermática se encontraba reducida en aquellos espermatozoides recogidos en el reflujo comparados con la dosis seminal inicial. En el artículo II, se evaluó la influencia de diferentes niveles de motilidad espermática en la dosis de inseminación sobre el % de cerdas con reflujo, el volumen (%), concentración espermática (%) y tipo de espermatozoides (%) (basados en sus características mótiles) recolectados en el reflujo a diferentes tiempos tras la inseminación post-cervical. Los resultados mostraron que no había diferencias en el % de cerdas que presentaban reflujo independientemente de la dosis de inseminación recibida (motilidad baja, media o alta). De la misma manera no se observaron diferencias en relación al volumen (%) y número de espermatozoides (%) entre los diferentes grupos experimentales a los distintos tiempos de recogida. Sin embargo, el % de espermatozoides de media o baja motilidad recolectados en el reflujo eran mayores que si presentaban una motilidad alta. Este hecho se observó a partir de los 16 minutos tras la inseminación, indicando un proceso de expulsión de espermatozoides aleatorio en los primeros momentos tras la inseminación (0-15 min) mientras que entre los 16-60 minutos, la eliminación espermática se correspondía a un proceso selectivo descartando en mayor medida espermatozoides con una capacidad mótil disminuida. En el artículo III, se evaluó la diferencia morfométrica entre los espermatozoides recolectados en el reflujo y en los que se encontraron en la unión útero-tubárica con aquellos que conformaban la dosis seminal de inseminación. Los resultados mostraron que el reflujo está formado por poblaciones espermáticas con una determinada dimensión y forma, siendo los de un tamaño de cabeza y longitud del flagelo menor los que tienden a ser encontrados en el reflujo. Además se comprobó que ni el fluido uterino, ni la alteración de acrosomas ni la osmolaridad estaban implicados en los cambios morfométricos. Por otro lado, se observó que el lugar de deposición espermático influía en el tamaño del espermatozoide que se recolectaba en el reflujo. Además, los datos obtenidos muestran que los espermatozoides que alcanzan la unión útero-tubárica presentan la misma longitud del flagelo que aquellos presentes en la dosis inicial de inseminación. En el artículo IV, barajamos la hipótesis de que los espermatozoides con morfoanomalías podían ser descartados o modificados por el ambiente uterino tras la deposición en el tracto genital de la hembra. Los resultados mostraron un mayor % de espermatozoides con morfoanomalías en el reflujo que en la dosis seminal y prácticamente la totalidad de la población espermática que colonizaba la unión útero-tubárica presentaban una morfología normal. Por otro lado, se observó que el fluido uterino no tenía ninguna influencia en cambios morfológicos de los espermatozoides eyaculados, sin embargo, cuando el fluido uterino se incubó con espermatozoides epididimarios se produjo una drástica reducción de las morfoanomalías. En conclusión, la presente tesis doctoral muestra que la inseminación artificial post-cervical es una técnica viable para su uso en las granjas. De hecho las ventajas obtenidas tanto a nivel reproductivo como económico son claras, siendo su implementación y aplicación a nivel de campo unarealidad. Por otro lado, se ha comprobado que los eyaculados son poblaciones heterogéneas con diversas características de motilidad, morfología y morfometría, y que estas particularidades propias de cada espermatozoide, influyen en su interacción con el tracto genital de la hembra una vez que son depositados. La mayor parte de los espermatozoides son eliminados en su trayecto hacia el lugar de fecundación, y esa discriminación parece ser un proceso selectivo o debido a modificaciones de algunas de las características propias del espermatozoide que sufren en su interacción con el útero. The main objective of this work was to study the viability of applying post-cervical insemination on the farm, as well as to the study the influence of different spermatozoa populations - with different characteristics - on the selection that takes place in the sow uterus; for this we analyzed spermatozoa which were expelled in the reflux after insemination and those which did reach the utero-tubal junction. In article I, the results showed that the use of post-cervical insemination produces a very similar or even higher reproductive yield than cervical insemination, the yield being much higher when inseminating sows with 2-3 or ≥6 births. At the same time, a detailed economic study of post-cervical insemination on the farm showed that this method produced substantially greater benefits than traditional insemination. Moreover, we were able to observe that the volume (%) as well as the number of spermatozoa (%) in the reflux was higher when using cervical insemination compared to post-cervical. On the other hand, the sperm quality was lower in those spermatozoa collected from the reflux compared to the initial insemination quality. In article II, we evaluated the influence of different levels of sperm motility in the insemination dose on the percentage of sows with reflux, the volume (%), sperm concentration (%), and type of spermatozoa (%) (based on the motility characteristics) collected from the reflux at different times after post-cervical insemination. The results showed that there were no differences in the % of sows which had reflux, regardless of the insemination dose received (low, medium or high motility). In the same way, there were no observable differences as regards the volume (%) and number of spermatozoa (%) between the different experimental groups at different times of collection. However, the % of spermatozoa of medium or low motility collected in the reflux was higher than those of higher motility. This observation was made 16 minutes after insemination, indicating the expulsion of random spermatozoa in the first moments following insemination (0-15 min), while at 16-60 minutes sperm elimination was a selective process, whereby spermatozoa with a low motility were expelled. In article III, we evaluated the morphometric differences between spermatozoa collected in the reflux and utero-tubal junction and those that formed the initial insemination dose. The results showed that the reflux was formed of sperm populations with a certain size and shape, mainly those with a small head and flagellum. It was also demonstrated that the uterine fluid, acrosome alteration and osmorality were not involved in these morphometric changes. On the other hand, we observed that the sperm deposition place was related with the size of the spermatozoa collected during reflux. Moreover, the data obtained showed that spermatozoa which reached the utero-tubal junction had the same length as those in the initial insemination dose. In article IV, we considered the hypothesis that the spermatozoa with morphoanomalies could be eliminated or modified by the uterine environment after deposition in the female genital tract. The results showed a higher % of spermatozoa with morphoanomalies in the reflux than in the seminal dose, while practically the whole spermatozoa population which colonized the utero-tubal junction had a normal morphology. Moreover, it was seen that the uterine fluid had no effect on the morphological changes that occurred in the ejaculated spermatozoa, although when the uterine fluid was incubated with epididymal spermatozoa, there was a drastic decrease in the number morphoanomalies. In conclusion, this PhD thesis shows that post cervical artificial insemination is a viable technique for use in farms, where the advantages are clear from both reproductive and economic points of view. Indeed, its implementation and application on farms is firmly established. Furthermore, we demonstrate that ejaculations are heterogeneous populations with a diverse motility, morphology and morphometry, and that these particularities - characteristics of each spermatozoon - influence any interaction with the genital tract of the female once deposited. Most spermatozoa are eliminated during their journey to the site of fecundation in what seems to be a selective process of discrimination or due to modifications in some of the characteristics of each individual spermatozoon as it interacts with the uterus.
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    Selección del sexo en el ganado porcino : análisis de factores limitantes y desarrollo de estrategias eficientes
    (2014-11-03) Olmo Llanos, David del; Martínez García, Emilio Arsenio; Parrilla Riera, Inmaculada; Facultad de Veterinaria
    La preselección del sexo de la descendencia mediante el uso espermatozoides portadores del cromosoma X o del Y separados por citometría de flujo es hoy en día una realidad. Sin embargo, mientras el semen separado está disponible comercialmente en bovino, en otras especies domesticas, incluyendo la especie porcina, la técnica está todavía a nivel experimental. La finalidad principal de esta tesis fue desarrollar un protocolo para la aplicación eficiente de los espermatozoides de verraco separados mediante citometría de flujo. Para ello, se han desarrollado los siguientes estudios. En el primer estudio, se evaluó la capacidad de los espermatozoides procedentes de eyaculados de diferentes verracos para resistir el procedimiento de separación espermática. Para ello, eyaculados de verraco fueron fueron sometidos a diferentes tratamientos: conservación en estado líquido, congelación estándar, separación espermática mediante citometría de flujo y separación y congelación. Los parámetros evaludados fueron: motilidad, viabilidad, oxidación lipídica de la membrana plasmática y fragmentación del ADN. El segundo estudio tuvo como objetivo la optimización los protocolos para la criopreservación de los espermatozoides separados de verraco. Para ello fueron evaluados los efectos de la congelación estándar (3% glicerol) sobre las características in vitro de los espermatozoides separados y congelados a una baja concentración espermática. Así como los efectos de diferentes concentraciones de glicerol sobre la calidad espermática de los espermatozoides separados y congelados a bajas concentraciones. El objetivo del tercer estudio fue diseñar un protocolo adecuado para la manipulación de los espermatozoides de verraco durante y después del proceso de separación con el fin de obtener espermatozoides separados con una óptima capacidad fecundante. Para este proposito, diferentes aspectos de la separación espermática fueron evaluados. Se evaluó el efecto de la alta dilución, el medio de recolección usado y la composición del fluido recirculante sobre la calidad (motilidad y viabilidad) y la funcionalidad (capacidad fecundante in vitro) de espermatozoides separados. El objetivo del cuarto estudio fue desarrollar un procedimiento útil de inseminación laparoscópica utilizando un número muy bajo de espermatozoides separados por citomería de flujo que permita obtener óptimos resultados de fertilidad a nivel de granja. Se evaluó el efecto de una inseminación laparoscópica simple (oviductos) y doble (oviductos y cuernos uterinos) con espermatozoides separados, sobre los parámetros reproductivos de las cerdas inseminadas. Tras los resultados de estos estudios, podemos concluir que: Existe una variabilidad individual entre verracos respecto a su capacidad para resistir el proceso de separación espermática por citometría de flujo. Además la respuesta de los espermatozoides de un verraco a una determinada biotecnología espermática no predice la respuesta de los mismos a otros procedimientos. La congelación de espermatozoides a bajas concentraciones en combinación con el uso de concentraciones finales de glicerol de 0.5–1% podría ser un método apropiado para la criopreservación de espermatozoides de verraco separados por citometría de flujo. La adición de EDTA en el fluido envolvente y de yema de huevo en el medio de recogida mejora la capacidad fecundante in vitro de los espermatozoides de verraco separados y ambos agentes deberían ser incluidos como componentes esenciales en los medios utilizados en los procedimientos de separación espermática por citometría de flujo en porcino. El procedimiento de inseminación laparoscópica descrito en el presente estudio es un método efectivo y aplicable en condiciones de granja para la obtención de descendencia de sexo deseado en ganado porcino. El protocolo de doble inseminación laparoscópica, usando entre 3 y 6 millones de espermatozoides separados por cerda permite obtener unos adecuados parámetros reproductivos a nivel de granja, haciendo que la tecnología de separación espermática por citometría de flujo sea potencialmente aplicable en núcleos de selección genética en ganado porcino. Summary: Sex pre-selection of the offspring by using X or Y chromosome bearing spermatozoa sorted by flow cytometry is nowadays a reality. However, while sexed spermatozoa are commercially available for bovine, in other domestic species including the pig the technique is still at experimental level. The main objective of this thesis was to develop a protocol to efficiently apply flow cytometric sex-sorting procedure on boar spermatozoa. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the ability of ejaculated spermatozoa from individual boars to withstand flow cytometric sex-sorting procedure was evaluated. Sperm-rich ejaculate samples were split into three aliquots. The aliquots were (1) diluted and stored, (2) frozen-thawed using standard protocols, or (3) sex-sorted with subsequent liquid storage or frozen-thawed. The sperm quality was evaluated based on total sperm motility, viability, lipid peroxidation and DNA fragmentation. The objective of the second study was to optimize protocols for cryopreservation of sex-sorted boar spermatozoa. We evaluated the effects of a standard boar sperm cryopreservation procedure on the in vitro characteristics of sex-sorted sperm frozen at low sperm concentrations and the effects of different final glycerol concentrations on post-thaw quality. The objective of the third experimental study was to design and adequate protocol for boar sperm handling during and after sperm sex sorting for obtaining sex sorted boar sperm with an optimal in vitro fertilizing ability. For this purpose, different aspects of the sorting procedure were examined. The effects of the high dilution rates, type of collection medium used, and sheath fluid composition on sorted boar sperm quality and function were evaluated. Sperm quality was assessed by motility and viability tests, whereas sperm function was evaluated by an in vitro fertilization assay which determined the penetration and polyspermy rates as well as the mean number of sperm penetrating each oocyte. The objective of the fourth study was to develop a useful procedure for laparoscopic inseminations with sex-sorted spermatozoa that allows obtaining optimal fertility results at a farm level. We evaluated the effects of single (oviducts) and double (oviducts and tips of the uterine horns) laparoscopic insemination with sex-sorted sperm on the reproductive performance of sows. The results achieved in these four studies have generated the following conclusions: There is an individual variability among boars to withstand the sorting procedure by flow cytometry. The response of spermatozoa to a specific semen-processing technique does not predict the response of spermatozoa from the same boar to other semen-processing techniques. Freezing at low sperm concentration in combination with the use of a final glycerol concentrations of 0.5–1% could be a suitable method for the cryopreservation of sex-sorted boar sperm. The addition of EDTA to sheath fluid and EY to collection medium improved the in vitro fertilizing ability of sex-sorted sperm, and both agents should be included as essential media components for flow cytometric sperm sex sorting in swine. The laparoscopic insemination procedure described in the present study is an effective method for obtaining offspring of the desired sex in swine at a farm level. The double laparoscopic insemination procedure, using between 3 and 6 millions of sex-sorted sperm per sow produces adequate results for reproductive parameters, making sperm-sexing technology potentially applicable in elite breeding units.
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    Spermatozoa selection in porcine species : relation with their functionality and in vitro fertilization competence= Selección de los espermatozoides en la especie porcina: relación con su funcionalidad y capacidad de fecundación in vitro
    (2016-01-11) López Úbeda, Rebeca; Matas Parra, Carmen; García Vázquez, Francisco Alberto; Facultad de Veterinaria
    Durante años se ha tratado de simular in vitro el proceso de selección y capacitación espermática que lleva a cabo el tracto genital de la hembra en condiciones fisiológicas, pero los resultados mucho de la selección que ocurre en el oviducto in vivo. El objetivo principal de esta tesis fue: el estudio de las subpoblaciones espermáticas previamente seleccionadas a través de métodos in vitro (por gradientes de Percoll, Capítulo 1; en cultivo de células oviductales, Capítulo 2; y la combinación de ambos sistemas, Capítulo 3), ex vivo (en explantes oviductales, Capítulo 2) e in vivo (en el oviducto de la cerda tras una inseminación artificial, Capítulo 2), y su relación con la funcionalidad y el estado de capacitación, así como su capacidad fecundante. En el Capítulo 1 se analizó la centrifugación mediante gradientes de Percoll como método de selección y capacitación espermática y se evaluó la eficacia en la selección de espermatozoides en función del gradiente utilizado (45/60, 60/75 y 45/90%). En el experimento 1, se analizaron diferentes parámetros espermáticos de las poblaciones obtenidas a través de los 3 grupos experimentales. Los resultados demostraron que al aumentar la diferencia en la densidad del gradiente de Percoll se reduce el número de espermatozoides morfológicamente anormales o con fragmentación del ADN, recuperando principalmente, espermatozoides que han iniciado el proceso de capacitación (95% presentan fosforilación de tirosina en alguna zona). Podemos decir que la separación de espermatozoides mediante gradientes de Percoll se fundamenta en sus diferencias funcionales. En el experimento 2, se emplearon las poblaciones espermáticas en fecundación in vitro para evaluar su capacidad de penetración, y determinar qué gradiente selecciona los espermatozoides más aptos para fecundar y su posible relación con los parámetros estudiados en el experimento 1. Se evaluó el porcentaje de penetración y el número medio de espermatozoides que presentaba cada ovocito. Los resultados mostraron que aquellos espermatozoides obtenidos a partir del gradiente de Percoll más restrictivo (45/90%) dieron lugar a unos mayores niveles de penetración del ovocito. En el Capítulo 2 se estudió el efecto de las células epiteliales del oviducto sobre la capacitación espermática. Se evaluó el estado de capacitación (mediante la distribución de la fosforilación de la tirosina) de los espermatozoides seleccionados mediante células oviductales bajo tres condiciones experimentales: in vitro, ex vivo e in vivo. Los resultados mostraron que existen diferencias entre los espermatozoides unidos o no unidos a las células oviductales, lo que demuestra que este tipo de células seleccionan espermatozoides con bajo grado de fosforilación en tirosina en cualquiera de las condiciones estudiadas. En el Capítulo 3 se estudiaron qué características presentan los espermatozoides para ser seleccionados por las células oviductales y la capacidad de fecundación in vitro de estos espermatozoides doblemente seleccionados [a través de gradientes de Percoll (45/90%) y posteriormente incubados sobre cultivos in vitro de células epiteliales del oviducto]. En el experimento 1 se evaluó la capacidad para fecundar de las dos poblaciones de espermatozoides obtenidas mediante el análisis de diferentes parámetros de fecundación. Los resultados demostraron que los espermatozoides doblemente seleccionados dan mejores resultados de fecundación in vitro, mejorando las tasas de penetración del gameto femenino. En el experimento 2 se analizaron las características funcionales de los espermatozoides. Los resultados indicaron que las células oviductales unen espermatozoides de mayor calidad y realizan su propia selección incluso partiendo de espermatozoides previamente seleccionados. En resumen, los resultados de esta tesis doctoral muestran que las células epiteliales del oviducto son capaces de distinguir aquellos espermatozoides con una capacidad de fecundación superior, lo que en un futuro podría representar un incremento en la eficiencia de los sistemas de reproducción asistida evitando, de este modo, la selección parcialmente subjetiva que existe actualmente en las técnicas convencionales de selección espermática. SUMMARY For many years, attempts have been made to control sperm selection and capacitation in order to simulate under in vitro conditions, but the results are highly variable and are far from in vivo ones. The aim of this thesis was the study of sperm subpopulations that have been previously selected by different methods: in vitro (Percoll gradients in Chapter 1, oviductal cells culture in Chapter 2 and by combining both in Chapter 3), ex vivo (in oviductal explants, Chapter 2) and in vivo (in the oviduct of the sow after insemination, Chapter 2), and their relationship with functionality, sperm capacitation status and fertilizing capacity. In Chapter 1 centrifugation by Percoll gradients was analysed as a sperm selection and capacitation method, and its efficiency for selecting sperm was evaluated. Three different Percoll gradient combinations (45/60, 60/75 and 45/90%) were used. In experiment 1, several parameters related to sperm function were analysed in the different sperm populations obtained through the three experimental techniques. The results of this experiment showed that as the Percoll gradient increased, the number of morphologically abnormal sperm or sperm with DNA fragmentation is reduced, recovering especially those sperm that have begun the process of sperm capacitation (since 95% of spermatozoa present tyrosine phosphorylation in any of the studied areas). So, we can say that the separation of sperm by Percoll gradients is primarily based on their functional differences. In experiment 2, the different sperm populations were used in an in vitro fertilization system to evaluate the penetration rate and checking which Percoll gradient selects the best sperm for fertilization purposes. The penetration rate and the mean number of spermatozoa found in each oocyte were evaluated. The results showed that spermatozoa obtained from the most restrictive Percoll gradient (45/90%) had higher levels of penetration. In Chapter 2 the capacitation status of sperm selected by the oviductal epithelial cells was evaluated (by measuring levels of tyrosine phosphorylation) under three conditions: in vitro, ex vivo and in vivo. The results showed that the phosphorylation pattern changes when sperm are incubated with the epithelial cells of the oviduct, with differences between sperm bound or unbound to the cells. It was concluded that the epithelial cells of the oviduct are able to select spermatozoa with a low level of tyrosine phosphorylation in any of the studied conditions. In Chapter 3 sperm selected by Percoll gradients (45/90%) were incubated with in vitro cultured oviductal epithelial cells. This incubation resulted in two distinct sperm populations: sperm bound to cells and sperm unbound. The study was divided into two experiments. In experiment 1 the ability of the two populations to fertilize was evaluated using different parameters. The results showed that the doubly selected sperm led to better results in the in vitro fertilization systems, significantly improving penetration rates. In experiment 2 the functional characteristics of sperm from the two populations were analysed. The results indicated that the oviductal epithelial cells bind higher quality sperm according to different functional parameters and perform their own sperm selection. In summary, the results of this thesis show that the oviductal epithelial cells are able to distinguish those sperm with a higher fertilization capacity. In the future this could provide an increase in the efficiency of assisted reproduction systems thereby preventing the partially subjective selection that currently exists in conventional sperm selection techniques.