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    Ecological and evolutionary pysiology of aquatic beetles : coping with multiple stressors in inland saline waters
    (Universidad de Murcia, 2017-12-27) Pallarés Párraga, Susana; Velasco García, Josefa; Arribas Blázquez, Paula; Millán Sánchez, Andrés; Facultades, Departamentos, Servicios y Escuelas::Facultades de la UMU::Facultad de Biología
    Las características del hábitat definen los rasgos de las especies que lo ocupan y determinan su evolución. En los ecosistemas acuáticos continentales, la distinta estabilidad de los ambientes lóticos (aguas corrientes) y leníticos (aguas estancas) y el grado de estrés abiótico del hábitat, definido principalmente por la temperatura, salinidad y temporalidad, tienen una influencia muy importante en los rasgos biológicos de los insectos acuáticos. Entre estos ecosistemas, destacan por su singularidad ecológica y biológica los medios salinos. Los coleópteros son uno de los pocos órdenes de insectos que han colonizado con éxito estos ambientes, pero los mecanismos y procesos evolutivos por los que este grupo ha adquirido tolerancia a la salinidad se desconocen. Metodología: Se utilizaron adultos de especies congenéricas de escarabajos acuáticos con distintas preferencias de hábitat (lótico/lenítico y a lo largo del gradiente de salinidad) para explorar experimentalmente: 1) diversos componentes de la capacidad de colonización (tolerancia ambiental) en relación con la inestabilidad y estrés del hábitat y 2) los mecanismos de osmoregulación por los que se ha adquirido tolerancia a la salinidad, sus interacciones con otros factores de estrés y su origen evolutivo. Para ello, se realizaron distintos estudios ecofisiológicos estructurados en cinco capítulos. Resultados: Capítulo 1. Especies con distinta preferencia salina, de dos linajes de escarabajos acuáticos, muestran estrategias de osmoregulación similares. La ocupación de hábitat en el gradiente de salinidad está mediada en parte por la capacidad de osmoregulación máxima en los dos géneros estudiados. Capítulo 2. Especies lóticas de distintos géneros son más sensibles a un estrés agudo térmico y salino que especies congenéricas leníticas, excepto en uno de los géneros estudiados. Dicho patrón se observa tanto en la supervivencia como en respuestas de comportamiento (emersión y vuelo). Capítulo 3. Especies meso e hipersalinas son más resistentes a la desecación que especies congenéricas de agua dulce o hiposalina. A nivel intraespecífico, la variación en las tasas de pérdida de agua entre individuos está positivamente relacionada con el contenido inicial de agua. Capítulo 4. En dos especies meso-hipersalinas de distintos géneros, una exposición a una salinidad subletal disminuye la pérdida de agua durante una desecación posterior, observándose una mayor supervivencia (tolerancia cruzada) en una de las especies. En cambio, una exposición a condiciones subletales de desecación disminuye la supervivencia frente a un estrés salino posterior. Capítulo 5. La reconstrucción ancestral de la resistencia a la desecación y capacidad de hiporegulación en un linaje de escarabajos acuáticos sugiere que una alta resistencia a la desecación y cierta capacidad de hiporegulación son características ancestrales del mismo. Todas las especies con alta capacidad de hiporegulación son resistentes a la desecación, pero no viceversa. Aumentos significativos y acelerados en la capacidad de hiporegulación son paralelos a incrementos moderados en la resistencia a la desecación y están asociados a la colonización de los medios meso e hipersalinos durante periodos de aridificación global. Conclusiones: La especialización en ambientes lóticos y leníticos en escarabajos acuáticos está asociada con diferencias en la tolerancia a estrés térmico o la combinación de estrés térmico y salino entre las especies, siendo las lóticas en general más sensibles. Otros rasgos como la capacidad de osmoregulación y la resistencia a la desecación están estrechamente asociados al estrés del hábitat impuesto por la salinidad y su interacción con otros factores. Los mecanismos de osmoregulación en el medio salino y de control de la pérdida de agua frente a la desecación están fisiológica y evolutivamente relacionados. En algunos linajes de escarabajos acuáticos, la evolución de mecanismos de resistencia a la desecación parece haber proporcionado la base fisiológica para el desarrollo de la capacidad de hiporegulación, permitiendo a algunas especies colonizar los ambientes meso e hipersalinos. SUMMARY Introduction: Habitat characteristics constrain the traits of the species inhabiting them, shaping their evolution. In inland aquatic ecosystems, the contrasting stability between lotic (running waters) and lentic habitats (standing waters) and the degree of abiotic stress (determined mainly by temperature, salinity and temporality), strongly influence the biological traits of aquatic insects. Among these systems, saline waters stand out for their high ecological and biological singularity. Coleopters are one of the few insect orders that has successfully colonised saline waters. However, the mechanisms and evolutionary processes by which salinity tolerance was acquired in this group remain unknown. Methodology: Adults of congeneric species of aquatic beetles with clear habitat preferences (lotic/lentic, and along a salinity gradient) were used to experimentally explore: 1) several colonisation capacity components (physiological tolerance) in relation to habitat’s stability and stress level and 2) the osmoregulatory mechanisms by which salinity tolerance was acquired, their interactions with other stress factors and their evolutionary origin. For this, several ecophysiological studies were conducted, which are arranged in five chapters. Results: Chapter 1. Species with different salinity preferences across two water beetle genera show similar osmoregulatory strategies. Habitat occupation along the salinity gradient is mediated partly by the species’ maximum osmoregulatory capacity in both studied genera. Chapter 2. Lotic species are more sensitive to acute heat and osmotic stress than lentic congeners in distinct beetle genera, except for one of the studied genera. This pattern is found in both survivorship and behavioural responses (emersion and flight). Chapter 3. Meso- and hypersaline species are more desiccation-resistant than congeneric freshwater-hyposaline species across one beetle genus. At the intraspecific level, inter-individual variation in water loss rates positively relates with the initial water content. Chapter 4. In two meso-hypersaline species of distinct genera, exposure to sublethal salinity reduces the water loss rate under subsequent desiccation and results in higher survival (cross-tolerance) in one of the studied species. In contrast, exposure to sublethal desiccation reduces performance under subsequent salinity stress. Chapter 5. The ancestral reconstruction of desiccation resistance and hyporegulation capacity in a lineage of aquatic beetles suggests that a high desiccation resistance and moderate hyporegulation capacity were ancestral traits for that group. All the species with good hyporegulation capacity are also desiccation-resistant, but not vice versa. Significant and accelerated changes in hyporegulation capacity were parallel to weak increases in desiccation resistance across the phylogeny, being associated with the colonisation of meso- and hypersaline waters, generally during global aridification periods. Conclusions: Specialisation in lotic or lentic habitats in aquatic beetles is associated with differences in tolerance to acute heat stress or the heat+salinity stress combination of thermal and salinity stress between species, being lotic ones generally more sensitive. Other traits such as osmoregulatory capacity and desiccation resistance are related mainly with the osmotic stress imposed by salinity and its interaction with other stressors. Mechanisms for osmoregulation in saline media, and those involved in controlling water loss under desiccation conditions, are physiologically and evolutionarily linked. In some water beetle lineages, evolution of desiccation resistance mechanisms could have provided the physiological basis for development of hyporegulation capacity, promoting colonisation of meso- and hypersaline waters by some species.
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    Evolutionary genomics in cicindelids : characterisation and expression analysis of reproductive and immune related genes = Genómica evolutiva en cicindélidos : caracterización y análisis de expresión de genes relacionados con la reproducción y el sistema inmune
    (2016-03-22) Rodríguez García, María Juliana; Galián Albaladejo, José; Machado, Vilmar; Facultad de Biología
    Los cicindélidos o escarabajos tigre son una familia de coleópteros depredadores pertenecientes al suborden Adephaga que cuentan con más de 2500 especies distribuidas por todo el mundo. Son especies importantes en los ecosistemas y comúnmente usadas como bioindicadores que han despertado la curiosidad de científicos y aficionados y han sido frecuentemente estudiados a distintos niveles. Sin embargo, hay poca información sobre los transcriptomas de los cicindélidos, y no se han realizado estudios para identificar y caracterizar los genes que podrían estar involucrados en el proceso evolutivo. El objetivo principal de esta tesis es identificar, caracterizar y analizar en un contexto evolutivo genes relacionados con la reproducción y el sistema inmune en cicindélidos. Para ello se han analizado genotecas de EST de distintos escarabajos tigre (Calomera littoralis, Cephalota litorea y Cicindela campestris). En el primer capítulo se realizan análisis bioinformáticos y de expresión diferencial entre machos y hembras, identificándose cuatro posibles proteínas del fluido seminal (Acp01-Acp04). Se realiza también una búsqueda de homología mediante RT-PCR en otras especies de cicindélidos para inferir el tipo de evolución de cada proteína. AcpC03 únicamente amplificó en C. littoralis y Lophyra flexuosa especies que guardan una estrecha relación filogenética y por tanto se trataría de una proteína de rápida evolución. AcpC04 y Acp01 amplifican en todas las especies de cicindélidos analizadas, por lo que se trata de proteínas conservadas al menos en los escarabajos tigre. En el segundo capítulo se realizan análisis bioinformáticos para caracterizar en Cicindela campestris dos modificadores post traducción, la enzima de conjugación E2 SUMO (Cc-UBC9) y una proteína de fusión ubiquitina-ribosómica (Cc-UBS27). Los análisis de selección realizados tras la amplificación de estos genes en siete especies de cicindélidos revelaron que ambos genes están sometidos a selección purificadora, lo que pondría de manifiesto la importancia de la función de estas proteínas. Los análisis de expresión génica mediante RT-qPCR mostraron los mayores niveles de expresión en gónadas en comparación con el resto de tejidos analizados para ambos genes, lo que indica que juegan un papel activo en la gametogénesis de los cicindélidos. Adicionalmente la mayor expresión de estos genes en testículo inmaduro, en relación al estadio maduro, indica que estos genes están involucrados en mayor medida en las etapas tempranas de la gametogénesis. En el tercer capítulo se realizan análisis bioinformáticos para identificar una defensina en Calomera littoralis (Clit-Def). Los análisis estructurales y bioinformáticos sugirieren que Clit-Def tiene capacidad antimicrobiana y por tanto está involucrada en el sistema inmune. Adicionalmente, los análisis de expresión de estos genes mediante RT-qPCR revelaron que Clit-Def en C. littoralis se sobre expresa en diferentes tejidos, principalmente en abdomen, tras la infección con lipopolisacáridos de Escherichia coli, lo que sugiere que este gen juega un papel importante en la respuesta humoral. El análisis filogenético de la defensina de este trabajo junto con las de otros coleópteros obtenidas de GenBank mostró que las defensinas no se agrupan en clados congruentes con la taxonomía lo que indica que se trata de proteínas de alta diversidad. La descripción de estos genes proporciona información relevante sobre la biología de los cicindélidos, y también sirve de base para entender mejor su proceso de diversificación, lo que conduce a una mayor comprensión de sus relaciones filogenéticas y aporta indicios sobre los procesos de especiación. Summary Cicindelids or tiger beetles are a family of predatory beetles belonging to the suborder Adephaga, which have more than 2500 species worldwide distributed. They are important in ecosystems and are species commonly used as bioindicators that have provoked the curiosity of scientists and amateurs, and therefore they have been deeply studied at different levels. Nevertheless, there is little information on the transcriptomes of tiger beetles, and no studies have been conducted to identify and characterise genes that could be involved in the evolutionary process. The objective of this thesis is to identify, characterise and analyse reproductive and immune related genes in cicindelids from an evolutionary perspective. To achieve this objective EST libraries from different tiger beetles (Calomera littoralis, Cephalota litorea and Cicindela campestris) has been analysed. In the first chapter bioinformatic analyses and differential expression analyses between males and females are performed, identifying four putative seminal fluid proteins (Acp01-Acp04). Homology searches in other tiger beetle species, using RT-PCR, have been performed to infer the evolution of these proteins. AcpC03 only amplified in C. littoralis and Lophyra flexuosa, species that are phylogenetically closely related and thus, it is consider a rapidly evolving protein. Acp01 and AcpC04 amplified in all cicindelid species analysed so they seem most likely to be conserved proteins at least in one group of tiger beetles. In the second chapter, bioinformatic analysis was performed to characterise two post-translation modifiers, the SUMO conjugating enzyme E2 (Cc-UBC9) and a ubiquitin-ribosomal fusion protein (Cc-UBS27) in Cicindela campestris. Selection analyses, performed after amplification of these genes in seven species of tiger beetles, revealed that both genes are under purifying selection what highlights the importance of these proteins. The gene expression analysis by RT-qPCR showed for both genes the highest levels of expression in gonads compared with other tissues analysed, indicating that they play an active role in gametogenesis in cicindelids. Additionally, the higher expression of these genes in immature testis relative to mature stages, indicates that these genes are mostly involved in the early stages of gametogenesis. In the third chapter, bioinformatic analyses are performed to identify a defensin gene in Calomera littoralis (Clit-Def). Structural and bioinformatic analyses suggested that Clit-Def has antimicrobial activity and therefore is involved in the immune system. Additionally, expression analysis of these genes via RT-qPCR, revealed that Clit-Def is overexpressed in C. littoralis, after infection with Escherichia coli lipopolysaccharides, in different tissues and mainly in the abdomen, suggesting that this gene plays a role in the humoral response. Phylogenetic analysis using the defensin characterised in this work (Clit-Def) together with other coleopteran defensins obtained from GenBank, showed that they are not grouped into clades congruent with the taxonomy, indicating that defensins are highly diverse proteins. The description of these genes provides important information on the tiger beetles biology, and also provides a foundation to better understand their diversification process, leading to a better comprehension of their phylogenetic relationships and providing clues on speciation processes.
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    Phylogeography, genomics and biosemiotics of bark beetles (Coleoptera: scolytinae) = Filogeografía, genómica y biosemiótica de escarabajos de corteza (Coleoptera: scolytinae)
    (2016-02-29) Sánchez García, Francisco Javier; Galián Albaladejo, José; Gallego Cambronero, Diego; Machado, Vilmar; Facultad de Biología
    Los escarabajos de corteza son insectos unidos a las plantas leñosas. Estos escarabajos están encuadrados dentro de los curculiónidos en la subfamilia Scolytinae. Esta subfamilia está compuesta solamente por insectos fitófagos. Su ciclo vita es crítico en los ciclos de materia y energia de los bosques templados. Además estos insectos pueden afectar a los intereses ecómicos en las zonas donde se producen fenómenos de plaga, las cuales pueden acabar afectando a miles de kilómetros cuadrados de bosque. El objetivo general de esta tesis es realizar una aproximación al estudio de los escarabajos de corteza desde diferentes perspectivas. Los aspectos estudiados han permitido identificar si existen patrones de nicho diferenciados en las poblaciones de Tomicus destruens de la cuenca mediterránea, analizar las diferencias en la expresión de microRNAs en T. yunnanensis y T. destruens, caracterizar posibles serina proteasas en T. yunnanensis y analizar las redes ecológicas en las que participan los escarabajos de corteza. En el capítulo uno utilizamos linajes jerárquicos obtenidos mediante análisis cladístico anidado (NCA) de los haplotipos de ADN mitocondrial (ADNmt) del escarabajo de corteza Tomicus destruens, para modelar la distribución por máxima entropía, usando variables ambientales y de hospedador a lo largo de toda la cuenca mediterránea. Los modelos ecológicos desarrollados indican que las linajes de ADN mitocondrial orientales minoritarios de T. destruens difieren en su nicho ecológico potencial de acuerdo a su relación con variables climáticas extremas. El objetivo del segundo capítulo es identificar y caracterizar in silico microRNAs de Tomicus yunnanensis y validar su expresión en T. yunnanensis y T. destruens, mediante el uso de herramientas bioinfomáticas y la utilización de métodos moleculares mediante stem-loop pcrs. Siete miRNAs fueron validados en ambas especies por PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR), de los cuales mir-2c-3p y mir-4944-5p mostraron expresión en ambas especies. La expresión de tyu-mir-2c-3p fue mayor en T. destruens que en T. yunnanensis, tanto en machos como en hembras. Sin embargo, se observó la máxima expresión de tyu-mir-4944-5p en las hembras de T. destruens, seguido por los machos de T. yunnanensis y T. destruens. En el tercer cápitulo el objetivo principal de este estudio fue analizar in silico el transcriptoma del escarabajo de corteza T. yunnanensis mediante herramientas bioinformáticas e identificar posibles genes candidatos para la síntesis de serina proteasas. Entre las serina proteasas identificadas, cuatro proteasas semejantes a tripsinas y cinco proteasas semejantes a quimotripsinas fueron anotadas in silico. Estas enzimas fueron clasificadas dentro de la familia SA1 y mostraba todas las características de serina proteasas digestivas. El objetivo del cuarto capítulo es identificar las señales del nicho semiótico que afectan a la comunicación intraespecífica de los escarabajos de corteza y también la comunicación con otros organismos, utilizando el concepto de “eco-field” junto con la Teoría General de Recursos (GTR) con el fin de detectar los procesos de ampliación del nicho semiótico en escarabajos de corteza a lo largo de la matriz del paisaje forestal. Una nueva perspectiva in la ecología del paisaje es la aplicación del concepto Eco-field junto con la Teoría General de Recursos. En este artículo, nosotros describimos la existencia de un eco-field en los escarabajos de corteza como una configuración espacial con una específica portadora de significado para cada interacción de cada organismo-recurso. En esta tesis se han abordado aspectos filogeográficos y genómicos de los escarabajos de corteza para entender mejor sus relaciones evolutivas y su ecología. Además se ha realizado una aproximación biosemiótica para analizar las implicaciones de la comunicación de los escolítidos en las redes ecológicas. Bark beetles (Coleoptera: Curculionidae, Scolytinae) are insects linked to woody plants. This subfamily is exclusively composed of phytophagous species. In temperate forest ecosystems, their life cycle is critical in the matter and energy cycles of forests, but sometimes produce outbreaks episodes that come to disrupt the economic interests. The importance of these insects is that they are the first to arrive and complete their life cycle in susceptible hosts, facilitating the penetration of other wood-eating organisms like other insects (Hymenoptera and other Coleoptera) and especially fungi. Bark beetles affect mainly host trees with very little defence capability, either because they are weak by environmental conditions, injured or affected by fire. The overall objective of this thesis is to make an approach to the study of bark beetles from different perspectives. The study has allow to identify patterns of differentiated niche in populations of Tomicus destruens in the Mediterranean basin, to analyze differences in the expression of microRNAs in T. yunnanensis and T. destruens, to characterize possible serine proteases in T. yunnanensis and to analyze ecological networks where bark beetles participate. The objective of this chapter one was to identify some environmental factors of the ecological niche that affect the distribution of the mitochondrial lineages (mtLs) and the genetic diversity of T. destruens using nested clade analysis (NCA) together with the maximun entropy (MaxEnt) algorithm (NCA-MaxEnt).The ecological models developed indicate that minority eastern mtDNA lineages of T. destruens differ in their potential ecological niche according to their relation to extreme climatic variables. The main objective of the second chapter is to identify and characterize in silico microRNAs from Tomicus yunnanensis and to validate their expression in T. yunnanensis and T. destruens, using bioinformatics tools and molecular approaches with stem-loop pcrs.Seven miRNAs were validated in both species by quantitative real time PCR (RT-qPCR), of which mir-2c-3p and mir-4944-5p showed expression in both species. The expression of tyu-mir-2c-3p was higher in T. destruens than in T. yunnanensis, in both males and females. However, the highest expression of tyu-mir-4944-5p was observed in females of T. destruens, followed by males of T. yunnanensis and T. destruens. The main goal of the third chapter was to analyse in silico the transcriptome of the bark beetle T. yunnanensis by bioinformatic tools, and identify potential candidate genes for the synthesis of serine proteases. We intended to provide information on specific markers (digestion enzymes) to be used in future studies, aiming to develop new control strategies of this insect pest and its congeneric species.Among the serine proteases identified, four trypsin-like proteases and five chymotrypsin-like proteases were annotated in silico. These enzymes were classified into the SA1 family and showed all the characteristics of digestive serine proteases. The objective of this chapter was to identify the signals of the semiotic niche that affect intraspecific communication of bark beetles and with other organisms using the eco-field concept together with the General Theory of Resources (GTR) in order to detect processes of expansion of the semiotic niche in bark beetles along the entire landscape forestry matrix. A new perspective in landscape ecology is the application of the term Eco-Field together with the General Theory of Resources. In this paper, we describe the putative eco-field in bark beetles as a spatial configuration with a specific meaning-carrier for every organism-resource interaction. This thesis has addressed phylogeographic and genomic aspects of bark beetles to better understand their ecology and evolutionary relationships. In addition a biosemiotic approach was performed to analyse the implications of the communication of bark beetles in ecological networks.