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Análisis de la expresión y función del inhibidor de antizimas 2 (AZIN2) en ratones transgénicos : estudio de nuevos ortólogos y parálogos de AZIN2
(2016-11-29) Lambertos Escudero, Ana; Peñafiel García, Rafael; Facultad de Medicina
BACKGROUND AND AIMS Polyamines are ubiquitous organic cations that play multiple essential roles in mammalian physiology. Ornithine decarboxylase (ODC) is the rate limiting enzyme in polyamine biosynthesis and it is regulated by antizymes, a family of small proteins whose synthesis is stimulated by high polyamine levels. AZs bind to ODC inhibiting its enzymatic activity and target it for degradation by the 26S proteasome. AZs are themselves regulated by another ODC-related family named antizyme inhibitors (AZINs), consisting of two members: AZIN1 and AZIN2. These proteins lack enzymatic activity but they bind to AZs with higher affinity than ODC, counteracting the effects of antizymes on ODC. AZIN1 is a ubiquitous protein that participates in the regulation of polyamine metabolism and cell growth and its disruption in mice causes death soon after birth. AZIN2 is mainly expressed in brain and testis, followed by other secretory tissues and cells. Although the physiological role of AZIN2 is mostly unknown, some data suggests that it is involved in cell growth, vesicular trafficking, secretion and spermiogenesis. In order to study the expression pattern of AZIN2 and its physiological role in mouse, AZIN2 KO mice were generated by the insertion of a beta geo cassette, resulting in a fused protein formed by the N-terminus extreme of AZIN2 and the reporter enzyme β-galactosidase. On the other hand, advances in genome sequencing revealed the existence of many orthologous of Azin2, and a new paralogue of Azin2 in mouse, named Gm853, whose study by transient transfected cells is a main aim of the present work. RESULTS AND CONCLUSIONS 1. Expression of the reporter gene lacZ in tissues of mice lacking Azin2. AZIN2 KO generated mice provide qualitative and quantitative information about the expression and function of AZIN2. Hystochemical and biochemical analysis of the reporter β-galactosidase activity in different tissues of AZIN2 KO mice confirmed significant expression of AZIN2 in epidydymis, adrenal glands, pancreas, heart, lung and eyes, in addition to testis and brain, pointing to secretory regions. However, none of the KO tissues examined showed significantly variation in polyamine content. Finally, the microarray analysis of gene differential expression between WT and KO mice did not show common changes, except the marked reduction of Azin2 expression. 2. The role of AZIN2 in male reproductive system. Hystological sections from testis and epididymis of AZIN2 KO and WT mice showed that AZIN2 was mainly expressed in haploid cells but also in Leydig cells, suggesting that AZIN2 is required not only for the synthesis but also for the function of mature sperm cells. Besides, the sperm motility test revealed that most AZIN2 KO sperm cells were not able to move across the test medium. However, this deficiency in motor skills did not have major consequences in male fertility, as AZIN2 KO mice demonstrated to be as fertile as their WT counterparts. Finally, the deprivation of AZIN2 in male reproductive system was also associated to decreased biosynthesis and secretion of testosterone. 3. Expression and function of AZIN2 in other secretory cells and tissues. Phenotypic analysis of AZIN2 KO mice. The role of AZIN2 in murine physiology was analysed in other secretory cells and tissues apart from testis by comparing the gain or the loss of functions in AZIN2 KO mice. In brain, AZIN2 prevails in the cerebellum and hippocampus areas and its disruption in these areas correlates with a deficient motor function in mice. The expression of AZIN2 in adrenal glands and pancreas was restricted to the adrenal medulla and to Langerhans islets, respectively. In other tissues such as heart, eyes, lung and kidney, the expression of AZIN2 was also restricted to specific types of cells. In pancreas, the absence of AZIN2 generates a slight hyperglycemia associated to impaired synthesis and secretion of insulin from β cells. 4. Structural and functional properties of Xenopus Azin2. Studies about ODC in Xenopus reveal the existence of two homologous proteins named XODC1 and XODC2, with different spatial and temporary patterns of expression. XODC2 appears on gene databases as XAZIN2, thus, it is considered an orthologous of mAZIN2 and hAZIN2. Unlike mAZIN2, the orthologous of AZIN2 in Xenopus laevis (xlAZIN2) is degraded by AZ1 and possesses decarboxylase activity of ornithine and lysine, showing higher affinity for lysine than for ornithine. The comparative analysis of xlAZIN2 with mODC and mAZIN2 revealed additional similarities with mODC, based on the cytosolic subcellular localization and the ability to form aggregates such as homotetramers. Similarly to mODC, xlAZIN2 stimulates agmatine uptake, decreases that of putrescine and spermidine and presents a short half-life, lower than 30 minutes. 5. Study of mouse Gm853, a new paralogue of Odc and Azin2. Comparative analysis of protein sequences from ODC paralogues revealed GM853 as a new homologue protein of ODC and AZINs in mouse, presenting all conserved residues for enzymatic activity. Experiments with transfected cells demonstrated that GM853 is not an antizyme inhibitor as it does not prevent the interaction between ODC and AZ1. Otherwise, it is a very stable protein mainly located in the cytosol and it is able to form homodimers and homotetramers but no heterodimers with other paralogues. Besides, GM853 presents enzymatic activity, being the first decarboxylase for L-Leucine described in mammals. The expression of GM853 in mice is restricted to renal tissue with higher representation in male kidneys, related to increased levels of testosterone. The product of Leucine decarboxylation is the isopenthylamine and it is rapidly excreted with urine. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS Las poliaminas son cationes orgánicos presentes en todas las células con funciones esenciales en la fisiología de todos los mamíferos. Ornitina descarboxilasa (ODC) es la enzima limitante en la biosíntesis de poliaminas y está regulada por los antizimas (AZs), una familia de pequeñas proteínas cuya síntesis es estimulada por las propias poliaminas. Los AZs se unen a ODC inhibiendo su actividad enzimática y la conducen al proteasoma 26S para su degradación. Los AZs son a su vez regulados por otra familia de proteínas relacionadas con ODC, denominadas inhibidores de antizimas (AZINs), formada por dos miembros: AZIN1 y AZIN2. Estas proteínas carecen de actividad enzimática pero se unen a los AZs con más afinidad que ODC, contrarrestando los efectos de los antizimas sobre ODC. AZIN1 es una proteína ubicua que participa en la regulación del metabolismo de poliaminas y el crecimiento celular y su abatimiento en ratones causa la muerte poco después de nacer. AZIN2 se expresa fundamentalmente en cerebro y testículos, además de otros tejidos y células secretoras. Aunque el papel fisiológico de AZIN2 no se conoce con certeza, algunos experimentos sugieren que está implicado en el crecimiento celular, el tráfico vesicular, secreción y espermatogénesis. Con el fin de estudiar el patrón de expresión de AZIN2 y su implicación fisiológica en ratón, se generaron ratones KO de AZIN2 mediante la inserción de un cassette beta geo, que dio lugar a una proteína recombinante formada por el extremo N-terminal de AZIN2 y la enzima reportera β-galactosidasa. Por otro lado, los avances en el ámbito de la secuenciación de genomas, han revelado la existencia de un gran número de ortólogos de Azin2, así como un nuevo parálogo de Azin2 en ratón, denominado Gm853, cuyo estudio mediante células transfectadas también es objeto de esta tesis doctoral. RESULTADOS Y CONCLUSIONES 1. Expresión del gen reportero lacZ en tejidos de ratones con abatimiento de Azin2. El modelo de ratón transgénico con abatimiento del gen Azin2 generado, permitía el estudio de la expresión y posible función de la proteína AZIN2. El análisis histoquímico y bioquímico de la actividad β-galactosidasa en tejidos de ratones KO de AZIN2 confirmó la expresión de AZIN2 en epidídimo, glándula adrenal, páncreas, corazón, pulmón y ojos, aparte de testículo y cerebro, apuntando a células secretoras. Sin embargo, en ninguno de los tejidos estudiados en ratones deficientes en AZIN2 se observó reducción significativa de los niveles tisulares de poliaminas. Finalmente, el estudio comparativo de la expresión de genes entre ratones WT y KO mediante microarrays, no mostró cambios comunes en todos ellos salvo la marcada reducción de la expresión de Azin2. 2. The role of AZIN2 in male reproductive system. El análisis histoquímico de secciones de testículos y epidídimos WT y KO de AZIN2 mostró que AZIN2 se expresa fundamentalmente en células haploides, pero también en las células de Leydig, sugiriendo su participación no solo enla síntesis sino también en la maduración de los espermatozoides. Además, el test de movilidad espermática mostró que la mayoría de los espermatozoides KO de AZIN2 no eran capaces de desplazarse en el medio de ensayo. Sin embargo, esta deficiencia en la motilidad no tuvo consecuencias en la fertilidad de los ratones machos, demostrando ser tan fértiles como los WT. Finalmente, el abatimiento de AZIN2 en el aparato reproductor masculino se asoció a una disminución en la biosíntesis y la secreción de testosterona. 3. Expresión y función de AZIN2 en otros tejidos y células secretoras. Análisis fenotípico de los ratones KO de AZIN2. El papel de AZIN2 en la fisiología murina en otros tejidos que expresan AZIN2 se analizó comparando los cambios sobre la función en ratones KO de AZIN. En el cerebro de ratón, AZIN2 predomina en el cerebelo y en el hipocampo y su disrrupción en estas áreas está relacionada con un una función motora deficiente. La expression de AZIN2 en la glándula adrenal y el páncreas se limitó a la médula adrenal y a los islotes de Langerhans, respectivamente. En otros tejidos como corazón, ojos, pulmón y riñón, la expression de AZIN2 se concentró en tipos de células específicas. En páncreas, la ausencia de AZIN2 genera una ligera hiperglucemia porque afecta a la síntesis y secreción de insulina por las células β. 4. Propiedades estructurales y funcionales de Azin2 de Xenopus. El estudio de ODC en Xenopus reveló la existencia de dos proteínas homólogas denominadas XODC1 y XODC2, con diferente patró de expresión espacial y temporal. XODC2 aparece en las bancos de genes como XAZIN2, siendo considerado un ortólogo de mAZIN2 y hAZIN2. Al contrario que AZIN2 de ratón, su ortólogo en Xenopus (xlAZIN2) es degradado por AZ1 y presenta actividad descarboxilasa de ornitina y lisina, con una afinidad superior por lisina que por ornitina. El análisis comparativo de xlAZIN2 con mODC y mAZIN2 mostró una mayor semejanza con mODC, basándose en su localización subcelular citosólica y en la capacidad de ambas proteínas para formar oligómeros. Además, al igual que mODC, xlAZIN2 presenta una vida media muy corta (inferior a 30 minutos) y estimula la captación de agmatina en detrimento de la de putrescina y espermidina. 5. Estudio de Gm853, un nuevo parálogo de Odc y Azin2 en ratón. El análisis comparativo de la secuencia proteica de los distintos parálogos de ODC reveló la existencia de GM853, una nueva proteína homóloga de ODC y AZINs en ratón, que conserva todos los residuos relacionados con la actividad catalítica. Estudios con células transfectadas demostraron que GM853 no es un inhibidor de antizimas, ya que no evita la interacción entre ODC y AZ1. En cambio, es una proteína estable localizada fundamentalmente en el citosol y es capaz de formar homodímeros y homotetrámeros pero no heterodímeros con otros parálogos. GM853 presenta actividad enzimática, siendo la primera proteína descrita en mamíferos con actividad descarboxilasa de leucina. En ratón, GM853 se encuentra en el riñón y su expresión depende de los niveles de testosterona, predominando en el riñón de ratones machos. El producto de la descarboxilación de la leucina es la isopentilamina, una amina que es rápidamente eliminada a través de la orina.
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Aspectos biológicos del organismo infantil de los 6 a los 12 años. Repercusiones sobre la actividad física
(Universidad de Zaragoza, Asociación Universitaria de Formación del Profesorado (AUFOP), 1992) Balague, Natalia
Existen diferencias entre la respuesta fisiológica al esfuerzo de la población infantil respecto a la población adulta que es necesario recoger en las programaciones de los docentes. El artículo revisa cuales son las diferencias más destacables y sugiere pautas de intervención basadas en los conocimientos actuales sobre el tema.
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Cadmium affects the regeneration of the leafy vegetable Talinum portulacifolium stem cuttings in nutrient solution
(Universidad de Murcia. Servicio de publicaciones, 2020) Muthukumar, Thangavelu; Dinesh-Babu, Selvam
Investigamos el efecto de varias concentraciones (0,0-5,0 ppm) de cadmio (Cd) en la capacidad de regeneración; las características morfológicas y la acumulación de Cd en los esquejes de tallo de la verdura de hoja Talinum portulacifolium cultivada en cultivo hidropónico. El Cd retrasó la brotación de los esquejes en un 7%, la callosidad en un 8% y el enraizamiento en un 38%. Las diferentes concentraciones de Cd afectaron significativamente a los pesos fresco y seco de las partes de la planta, excepto las raíces. La acumulación de Cd fue mayor en los tallos que en las hojas (2,22 vs 0,57 ppm). El índice de tolerancia calculado osciló entre el 59% y el 88%. Basándose en las observaciones, se concluyó que el Cd interfiere con la regeneración de los esquejes de tallo de T. portulacifolium e implica preocupación sobre el consumo y el uso terapéutico de esta hortaliza de hoja que crece en suelos contaminados.
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Características del crecimiento y de la calidad de la canal de corderos de raza manchega / Herminia Vergara Pérez ; directores Laureano Gallego Martínez ; José Luis Sotillo Ramos.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Veterinaria, Departamento de Producción Animal,, 1994) Vergara Pérez, Herminia
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Contribución al conocimiento de la biología del alga parda alimentaria Himanthalia elongata (Fucales, Phaeophyta) en las costas de Galicia
(Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 2004) Lagos, Verónica; Cremades, Javier; Sin departamento asociado; Facultad de Biología
Himanthalia elongata es un alga parda bienal y dioica muy frecuente en las costas gallegas, donde se usa tradicionalmente como abono y, más recientemente, como alga alimentaria debido a sus notables ca- racterísticas organolépticas y nutricionales. Dado el creciente grado de explotación de las poblaciones naturales, necesariamente tendrán que establecerse criterios para su explotación sostenible en función de su biología, hasta ahora poco conocida, en nuestras costas. En el presente trabajo se exponen los resultados obtenidos hasta el momento en los estudios realizados sobre el crecimiento, reproducción y reclu- tamiento de esta especie en la localidad de Barizo (Malpica, La Coru- ña) y se indican las principales pautas a seguir para una explotación sostenible de este recurso.
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Crecimiento y desarrollo del alumno. Patologías y tratamiento escolar
(2011-06-21) Baena Extremera, Antonio; Actividad Física y del Deporte; Facultad de Ciencias del Deporte; Departamento de Actividad Física y del Deporte
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Distribución de la aia-oxidasa y peroxidasa en hipocótilos etiolados de lupinus albus, L. Relación con el crecimiento
(Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1990) Sánchez Bravo, José; Nuñez, C.; Facultad de Biología
Se ha estudiado la actividad AIA-oxidasa y peroxidasa en extractos correspondientes a zonas con distinta localización en los hipocótilos etiolados de altramuz (Lupinus albus, L). En plantas de 9 días, con crecimiento activo, las actividades enzimáticas por g de peso fresco muestran una distribución decreciente desde el ápice, mientras que las actividades específicas presentan una distribución de campana, paralela a la del crecimiento. A los 15 días se aprecia una tendencia hacia una distribución uniforme de ambas actividades, como consecuencia de un descenso en las zonas apicales y un aumento en las basales. Las actividades por g de peso fresco se distribuyen de forma paralela al crecimiento, mientras que la distribución de las actividades específicas presenta oscilaciones, localizándose los valores más altos en la zona apical (con crecimiento ) y en la basal. Teniendo en cuenta estudios previos, se discute el papel de AIA-oxidasa en el control de los niveles de AIA durante el crecimiento de los hipocótilos de altramuz.
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Edad y crecimiento de Gobio lozanoi Doadrio & Madeira, 2004 (Cypriniformes: Cyprinidae) en sectores fluviales de la cuenca del río Segura (SE península ibérica)
(Murcia: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Murcia, 2013) Amat Trigo, Fátima; Oliva Paterna, Francisco José; Verdiell Cubedo, David; Ruiz Navarro, Ana; Torralva Forero, María del Mar; Zoología y Antropología Física
El trabajo estudia la estructura de edad, longitud retrocalculada y tasa de crecimiento en poblaciones de Gobio lozanoi a lo largo de los principales ejes fluviales de la cuenca del río Segura (ríos Segura y Mundo). Se analizaron estos parámetros con individuos capturados en otoño de 2009 y en 19 localidades, así como su relación con variables ambientales (altitud, estado ecológico y conductividad). Las poblaciones reflejaron seis clases de edad (0+ a 5+) con escasas diferencias entre sexos y dominancia de edades intermedias (2+ y 3+). La estructura de edades mostró variaciones significativas en el gradiente con tendencia a presentar menor número de clases en localidades a menor altitud. La tasa de crecimiento se relacionó negativamente con la longevidad y mostró diferencias entre sectores fluviales. La tasa de crecimiento en la fase de transición a la madurez mostró tendencia a disminuir con el gradiente, pero también conforme decrece el estado ecológico y aumenta la conductividad.
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Estructura, expresión y aspectos funcionales del inhibidor de antizimas 2 (AZIN2)
(2013-12-13) Ramos Molina, Bruno; Peñafiel García, Rafael; López Contreras, Andrés Joaquín; Facultad de Medicina
Las poliaminas son pequeñas moléculas con carga positiva esenciales para los procesos de crecimiento, proliferación, diferenciación y apoptosis celular. En mamíferos, los niveles intracelulares de poliaminas están altamente regulados a través de distintos mecanismos, como su biosíntesis, degradación y transporte a través de la membrana plasmática. La regulación post-traduccional de ornitina descarboxilasa (ODC), enzima clave de la ruta biosintética, está principalmente mediada por la acción de una familia de proteínas denominadas antizimas (AZs), cuya síntesis se estimula cuando los niveles de poliaminas son elevados. Las AZs se unen y inhiben ODC, e inducen su degradación proteasomal sin ubiquitinación. Además, las AZs inhiben la captación de poliaminas extracelulares, probablemente por interaccionar con el transportador de poliaminas. Además de las AZs, la actividad ODC está también indirectamente regulada por una familia de proteínas denominadas inhibidores de antizimas (AZINs). Estas proteínas, homólogas a ODC pero sin actividad enzimática, también interaccionan con las AZs, incluso de manera más eficiente que ODC, contrarrestando los efectos de las AZs sobre ODC. En mamíferos, la familia de los AZINs está compuesta por dos miembros: AZIN1 y AZIN2. Mientras que AZIN1 es una proteína de expresión ubicua que regula los niveles intracelulares de poliaminas y el crecimiento celular, AZIN2 se expresa mayoritariamente en testículo y cerebro, y su función fisiológica es menos conocida. El presente trabajo se ha centrado en el estudio de la expresión del gen Azin2 en tejidos de ratón, así como en profundizar en el conocimiento de diferentes aspectos funcionales y estructurales de AZIN2, proteína caracterizada por primera vez en nuestro laboratorio, comparando los mismos con los de sus proteínas homólogas ODC y AZIN1. Los objetivos del trabajo planteados, relacionados con la expresión, estructura, y función de AZIN2, fueron los siguientes: 1) Estudio de la expresión de AZIN2 y proteínas homólogas, así como la de las AZs en diferentes tejidos de ratón adulto mediante RT-PCR a tiempo real; 2) expresión de AZIN2 en testículo de rata y en testículos de ratones con alteraciones en la espermatogénesis; 3) influencia de AZIN2 y proteínas relacionadas con el metabolismo de poliaminas sobre el transporte de agmatina e influencia sobre el mismo de compuestos amino-guanidinios; 4) predicción de la estructura tridimensional de AZIN2 mediante modelado comparativo por homología, y estudio de la estructura cuaternaria de AZIN2 en células de mamífero; 5) análisis de la zona de unión a AZs (AZBE) en AZIN2 y sus parálogos, e influencia de los residuos conservados en las propiedades de las proteínas; 6) estudio de la vida media de AZIN2 y sus parálogos en células de mamífero, y de su posible mecanismo de degradación. En general, la metodología utilizada para la realización de este trabajo puede describirse como una combinación de técnicas de bioquímicas y de biología molecular, análisis de expresión génica mediante RT-PCR a tiempo real y aproximaciones computacionales. Además, se utilizaron tanto líneas celulares, principalmente para los experimentos de transfección, como animales de laboratorio. En particular, se realizaron tratamientos específicos para la destrucción de células germinales haploides del testículo. Las conclusiones obtenidas del trabajo experimental son las siguientes: 1. El análisis mediante RT-PCR a tiempo real mostró que, además de cerebro y testículo, AZIN2 se expresa de manera significativa en otros tejidos de ratón adulto como epidídimo, glándula adrenal, páncreas, corazón y pulmón, mientras que su expresión en diversas líneas celulares humanas de origen tumoral fue prácticamente indetectable. 2. Diversos modelos experimentales corroboran que en el testículo murino la gran mayoría del ARNm de AZIN2 se encuentra localizado en las células germinales haploides, descartando una expresión significativa en otros tipos celulares testiculares como las células intersticiales. 3. El patrón de expresión postnatal de AZIN2 y AZ3 en el testículo de rata es similar al encontrado en ratón, sugiriendo que estas proteínas también podrían estar participando en el proceso de espermiogénesis en esta especie. 4. La sobreexpresión de ODC o AZIN2 estimula la entrada de agmatina a las células COS7, mientras que las AZs la inhiben. En condiciones basales, dicho transporte, a concentraciones próximas a las fisiológicas, parece tener lugar a través del transportador general de poliaminas. 5. La estructura tridimensional de AZIN2, deducida mediante modelado comparativo, es similar a la descrita para sus parálogos ODC y AZIN1 en lo referente a los dominios barril / y hoja plegada , aunque difiere en regiones menos conservadas como ciertos bucles y las regiones N- y C-terminal. 6. A diferencia de ODC, AZIN2 es incapaz de formar homodímeros o a heterodimerizar con monómeros de ODC, aunque comparte con esta proteína la capacidad para interaccionar con las tres antizimas conocidas. 7. El análisis comparativo de la secuencia de la región AZBE en los diferentes ortólogos de AZIN2 y los de sus parálogos AZIN1 y ODC reveló la existencia de cinco residuos conservados (K116, A124, E139, L140 y K142 en la secuencia de AZIN2 de ratón). 8. Mientras que las mutaciones simples de cada uno de estos residuos en AZIN2 apenas afectaron la interacción de esta proteína con las AZs, las mutaciones dobles o triples de algunos de ellos anularon la capacidad de AZIN2 para interaccionar con las AZs, de manera independiente de la repercusión de dichas mutaciones sobre la carga eléctrica neta del elemento AZBE. 9. Los residuos conservados en la secuencia AZBE de ODC parecen ser muy importantes para la función de la enzima, ya que todas las mutaciones simples de los mismos, con la excepción de A123, disminuyeron notablemente la actividad catalítica de la enzima. 10. Los residuos E138 y L139 son críticos para la funcionalidad de ODC, ya que su sustitución por alaninas disminuye grandemente la homodimerización de la proteína, produciendo además la del segundo un gran aumento en su estabilidad por anular su interacción con AZ1. 11. En células transfectadas, AZIN2 es una proteína más lábil que ODC, mostrando una vida media de aproximadamente 90 minutos, y que a diferencia con ODC se estabiliza grandemente al interaccionar con las antizimas. 12. A diferencia con lo observado para ODC y AZIN1, la inhibición de la maquinaria proteasomal con lactacistina o MG132 produce una marcada disminución de la proteína AZIN2, sugiriendo que su degradación pudiera estar mediada por una vía alternativa a la del proteasoma 26S. Polyamines are small cationic molecules essential for cell growth, proliferation, differentiation and apoptosis. In mammals, the intracellular polyamine levels are tightly controlled by the regulation of different processes including their biosynthesis, degradation and transport across the plasma membrane. Post-translational regulation of ornithine decarboxylase (ODC), the key biosynthetic enzyme, is mainly mediated by the action of a family of small proteins named antizymes (AZs), whose synthesis is stimulated by high polyamine levels. AZs bind and inhibit ODC and target it to proteasomal degradation. Furthermore, AZs inhibit extracellular polyamine uptake presumably by interacting with the polyamine transport system. In addition to AZs, the ODC activity is also indirectly regulated by a family of proteins named antizyme inhibitors (AZINs). These proteins, closely related to ODC but without enzymatic activity, also interact with antizymes, even more efficiently than ODC, counteracting the effects of antizymes on ODC. In mammals, the AZIN family is formed by two members: AZIN1 and AZIN2. Whereas AZIN1 is a ubiquitous protein that regulates intracellular polyamine levels and cell growth, AZIN2 is mainly expressed in testis and brain and its physiological role is mostly unknown. In this work we have focused on the study of the expression of the Azin2 gene in mouse tissues and the determination of different functional and structural aspects of AZIN2, protein first characterized in our laboratory, comparing the results with those of the homologous proteins ODC and AZIN1. The specific aims of this work were: 1) To determine the expression pattern of AZIN2 and homologous proteins, as well as those of AZs, in different adult mouse tissues by real-time RT-PCR; 2) to elucidate the AZIN2 expression in rat normal testes and in mouse testes with impaired spermatogenesis; 3) to analyse the effect of AZIN2 and proteins related to the polyamine metabolism and the influence of aminoguanidine compounds on agmatine transport; 4) to predict the tridimensional structure of AZIN2 by comparative modeling and to determine whether AZIN2 is able to form homodimers or heterodimers with ODC in mammalian cells; 5) to analyse the AZBE region of AZIN2 and its paralogs and the effect of conserved residues in the functionality of these proteins; 6) to study the half-life and the mechanism of degradation of AZIN2 and its paralogs in mammalian cells. In general the experimental methodology involved methods of molecular biology and biochemistry, gene expression analyses using real-time RT-PCR and computational approaches. In addition, we used several mammalian cell lines, mainly for transient transfection experiments, and laboratory animals. In particular, we performed specific treatments for the selective destruction of haploid germ cells in mouse testis. The conclusions obtained from our experiments were as follows: 1. Real-time RT-PCR analysis showed that, in addition to brain and testis, AZIN2 is expressed significantly in other adult mouse tissues such as epididymis, adrenal glands, pancreas, heart and lung, whereas its expression in several human cancer cell lines is almost undetectable. 2. In mouse testis, most AZIN2 mRNA is located in haploid germ cells, without significant expression in other testicular cells such as the interstitial cells. 3. The postnatal expression patterns of AZIN2 and AZ3 genes in rat testis are similar to those found in mice, indicating a evolutionary conserved expression pattern and suggesting that in the rat both proteins might be also participating in the spermiogenesis. 4. Agmatine uptake in COS7 cells is stimulated by AZIN2, ODC or SSAT overexpression, and inhibited by the presence of AZs. In basal conditions, agmatine uptake occurs through the polyamine transporter when the concentration of agmatine is close to the physiological values. 5. The tertiary structure of AZIN2, predicted by comparative modeling, is similar to those of its paralogs ODC and AZIN1 in the domains TIM / barrel and sheet, but it differs considerably in less conserved regions such as some loops and the N- and C-terminal regions. 6. Unlike ODC, AZIN2 is unable to form homodimers or heterodimers with ODC, but it is able to interact with the three AZ isoforms. 7. The comparative analysis of the AZBE sequences from multiple AZIN1, AZIN2 and ODC ortologs revealed the existence of five conserved residues (K116, A124, E139, L140 and K142 in mouse AZIN2). 8. In AZIN2, the double and triple substitutions of some of the conserved residues, but not single substitutions, drastically affected its interaction with AZs, independently from the effect of the substitutions on the net electric charge of the AZBE region. 9. In the case of ODC, the conserved residues play an important role in the function of the enzyme, since all single substitutions, with the exception of A123, significantly diminished ODC catalytic activity. 10. The residues E138 and L139 are critical for ODC functionality, since their substitution by alanines clearly reduced the formation of homodimers, causing the change L139A a potential increase of the protein stability by decreasing its interaction with AZ1. 11. In transfected cells, AZIN2 is more labile than ODC, having a half-life of approximately 90 minutes and being considerably stabilized by the interaction with AZs. 12. Unlike ODC and AZIN1, AZIN2 protein levels decreased after treatment with proteasome inhibitors, suggesting that its degradation might be mediated by an alternative route to proteasome 26S.
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Start-up conditions and the performance of women -and men- controlled businesses in manufacturing industries
(2010) Driga, Otilia; Prior, Diego
Recent research into the economic performance of women-controlled firms suggests that their underperformance may not be the result of differences in the managerial ability of women as compared to men, and that it may in fact be a consequence of differing levels of start-up resources. Using accounting data, we examine the effects that selected start-up conditions have had on the observed economic performance of a sample of 4450 Spanish manufacturing firms. The results, which indicate significant differences in the initial conditions and show lower levels of assets and employee numbers in women-controlled firms, have implications for the economic performance of such firms
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La talla de los europeos, 1700-2000: ciclos, crecimiento y desigualdad
(2012) Martínez Carrión, José Miguel; Economía Aplicada
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The effect of domestic effluent on growth and haematological parameters of Clarias gariepinus (Burchell, 1822) (Pisces; Clariidae)
(Universidad de Murcia. Servicio de publicaciones, 2020) Adekilekun Kolawole, Asiata; Ataitiya, Reuben; Olawale Junaid, Quazim; Kolawole Mustapha, Abdur Rahman

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