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    Análisis del sistema hemostático en neoplasias avanzadas
    (2017-01-11) Morena Barrio, Pilar de la; Corral de la Calle, Javier; Escuela Internacional de Doctorado
    Introducción La relación entre sistema hemostático y cáncer es bidireccional. Los pacientes con cáncer tienen 4-7 veces más riesgo de desarrollar trombosis, especialmente en estadios avanzados de la enfermedad porque los tratamientos, las comorbilidades y las propias células tumorales, especialmente ciertos tipos, provocan diferentes alteraciones en el sistema hemostático que generan un estado de hipercoagulabilidad. Por otra parte, diferentes elementos del sistema hemostático juegan un papel importante en el crecimiento tumoral, progresión y metastatización. Hipótesis y objetivos La hipótesis que generó este trabajo fue que las distintas neoplasias, por el tipo de tumor o por los tratamientos recibidos, podrían provocar una alteración diferencial del sistema hemostático que podría tener relación con el desarrollo de trombosis y con la progresión tumoral. Por ello, el objetivo de nuestro estudio fue evaluar diferentes elementos del sistema hemostático en pacientes con 3 de las 4 neoplasias más frecuentes (cáncer de próstata, colorrectal y de pulmón). Los objetivos específicos fueron: 1. Estudiar si existe una activación diferente del sistema hemostático en distintas neoplasias avanzadas. 2. Analizar la relación entre alteraciones del sistema hemostático y el desarrollo de eventos trombóticos en pacientes con cáncer. 3. Estudiar el efecto de la quimioterapia basada en fluoropirimidinas sobre el sistema hemostático en pacientes con cáncer colorrectal. 4. Estudiar el valor pronóstico de las principales alteraciones del sistema hemostático en pacientes con cáncer. Material y métodos Se incluyeron muestras basales de 157 pacientes consecutivos; 32 con cáncer de próstata resistente a castración; 43 con cáncer colorrectal y 82 con carcinoma de pulmón. Se estudiaron: plaquetas y leucocitos; marcadores de muerte celular (lactato deshidrogenasa –LDH-); hipercoagulabilidad (Dímero D) y de daño endotelial (Factor von Willebrand –FvW-) y tiempos de coagulación (Tiempo de protrombina). Se analizaron la antitrombina y los dos elementos de la ruta de contacto (FXI y FXII) mediante métodos funcionales cromogénicos y/o western blot. Finalmente se estudiaron dos elementos recientemente implicados en trombosis: trastornos de glicosilación y ADN circulante (estudiados mediante electroforesis y HPLC; y por un método de cuantificación fluorescente, respectivamente). En casos excepcionales se realizaron estudios genéticos: secuenciación de genes (SERPINC1 y PMM2) o detección de grandes deleciones mediante MLPA. Resultados y Conclusiones 1. El sistema hemostático se encuentra afectado en pacientes con cáncer. Aunque hay elementos alterados comunes en las distintas neoplasias estudiadas, como son la elevación basal de LDH, DD y FvW, hay otros que varían entre ellas. En cáncer de próstata observamos una tendencia a una mayor activación de FXII que no se acompaña de activación de FXI. En cáncer colorrectal, se observó elevación de FvW y DD, sin activación de la ruta de contacto. En pacientes con CNMP, observamos una mayor incidencia de deficiencia de antitrombina que probablemente sea por consumo como lo sugiere la detección de complejos trombina-antitrombina. 2. La presencia de elevación del FvW en pacientes con cáncer de próstata se asocia con el desarrollo de eventos trombóticos en nuestra serie. No se ha encontrado relación entre el desarrollo de fenómenos trombóticos y otras alteraciones del sistema hemostático. 3. La quimioterapia basada en fluoropirimidinas no provoca alteraciones relevantes del sistema hemostático en pacientes con cáncer colorrectal. 4. Determinadas alteraciones del sistema hemostático, como el aumento de FvW, DD y ADN circulante, se asocian con peor pronóstico en las neoplasias estudiadas. La elevación de FvW se asocia a peor pronóstico en tres de los cuatro tumores estudiados: cáncer de próstata, cáncer colorrectal y CNMP. La elevación de DD se asocia con peor pronóstico en cáncer de próstata. Finalmente, la presencia de concentraciones elevadas de ADN circulante se asocia con peor supervivencia en pacientes con cáncer de próstata y CNMP avanzado. ABSTRACT Introduction There is a strong relationship between the hemostatic system and cancer. Patients with cancer have increased risk (4-7-fold) to develop thrombosis, particularly in advanced stages of the disease, because the treatments, the associated co-morbidities and the features of cancer cells can modify the hemostatic balance, triggering a prothrombotic state. But also the different hemostatic elements play a key role in tumor growth, tumor progression and metastasis. Hypothesis and objectives We propose that the disturbance of the hemostatic system may be different depending of the type of cancer. The type of tumor cell or the treatment used in each tumor may have distinct consequences on the hemostatic balance with potential and different consequences on the risk of thrombosis and the progression of the tumor. Accordingly, the main objective of our study was to evaluate different elements of the haemostatic system in patients with three out of four more prevalent cancer (prostate, colorectal, and lung cancer). The specific objectives were: 1. To study a potential activation of the hemostatic system in different advanced tumors. 2. To analyse the relationship between changes in the hemostatic system and the development of thrombotic events in patients with cancer. 3. To evaluate the effect of chemotherapy based on fluoropirimidines on the hemostatic system in patients with colorectal cancer. 4. To study the prognostic value of the main variations of the hemostatic system identified in patients with cancer. Material and methods Our study included basal samples of 157 consecutive patients with cancer: 32 with prostate cancer resistant to castration; 43 with colorectal cancer; and 82 with lung cancer. These were the parameters analyzed: platelets and leukocites; markers of cell death (Lactato de-hidrogenase –LDH-); hypercoagulability (D Dimer) and vascular damage (von Willebrand Factor –vWF-). Clotting times (prothrombin time and activated partial thromboplastin time) were also evaluated. Additionally, antithrombin and two elements of the contact pathway of coagulation (FXI and FXII) were also evaluated by functional chromogenic methods and/or Western blot. Finally, two elements recently associated with thrombosis: disorders of glycosylation and circulating DNA, were also analyzed in this study by electrophoresis and HPLC and by a fluorogenic method, respectively. Exceptional cases required genetic analysis that included senquencing of genes (SERPINC1 or PMM2) or detection of gross gene defects by MLPA. Results and conclusions 1. The haemostatic system is altered in cancer patients. Several common alterations are observed, including high levels of LDH, D-dimers and von Willebrand Factor (vWF). However, several distinct alterations are observed: in prostate cancer we observe activation of Factor XII; in colo-rectal cancer no activation of the contact route is observed and n non-small cell lung cáncer we observed lower levels of antitrombin factor probably caused by consumption, as these patients also had remarkable levels of thrombin-antithrombin complexes. 2. The presence of higher levels of vWF is associated with the development of thromboembolic events in prostate cancer. We did not observe other associations between thrombosis and alteration of the haemostatic system. 3. Fluoropirimidine-based chemotherapy did not cause relevant disturbances on the hemostatic system in patients with colorectal cancer. 4. Some variations of the hemostatic system such as the increase of vWF, D dimer or circulating DNA, associated with a poor prognosis in cancer. Thus, increased levels of vWF associated with a poor prognosis in three out of four tumors evaluated in this study: prostate, colorectal and non microcytic lung cancer. Rise level of D dimer was also a marker of bad prognosis in prostate cancer. Finally, high values of circulating DNA associated with low survival in patients with prostate and non microcytic lung cancer.
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    Aspectos clínico-biológicos de la patología molecular del factor XI
    (2016-11-30) Esteban Medina, Julio Agustín; Vicente García, Vicente; Corral de la Calle, Javier; Escuela Internacional de Doctorado
    Introducción Recientes evidencias sustentan la relevancia hemostática del FXI y sugieren nuevos papeles para este factor procoagulante. Su deficiencia, considerada un desorden raro, podría estar subestimada por la escasa clínica hemorrágica y por las limitaciones de los métodos empleados en su diagnóstico. Objetivo El objetivo de este estudio fue caracterizar la deficiencia de FXI en un área de 60.000 habitantes de la Región de Murcia, valorando su incidencia, estudiando la base molecular de la deficiencia en los casos identificados, evaluando los sistemas diagnósticos y analizando sus implicaciones clínicas. Metodología En 20 años (1994-2014) se realizaron 324.764 tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa) en 51.366 pacientes, seleccionando 1.700 que presentaron una ratio prolongada (> 1,3). Estudios de la vía intrínseca en estos casos permitió identificar 44 casos índice no relacionados con deficiencia de FXI (FXI:C< 70%). En 41 casos se realizó un estudio familiar que permitió reclutar un total de 214 casos con deficiencia de FXI. El FXI plasmático se estudió mediante Western-blot. El análisis genético incluyó secuenciación (Sanger y NGS), MLPA y genotipado con sondas taqman. Resultados Identificamos 7 casos con deficiencia de FXI en homocigosis, 3 en heterocigosis compuesta y 204 en heterocigosis. Describimos 4 mutaciones recurrentes: p.Cys56Arg (descrita en población vasco-francesa), p.Cys416Tyr, p.Glu565Lys y p.Pro538Leu identificadas en 23, 7, 6 y 2 casos índices respectivamente. Además, otras 8 mutaciones diferentes se detectaron en 7 casos índices, 4 de ellas no descritas previamente, incluyendo la primera gran inserción descrita a nivel mundial. Dos mutaciones, una de ellas nueva, provocaban deficiencia CRM+ (proteína variante en plasma pero sin actividad funcional). La ratio del TTPa no estaba prolongada en 54/214 casos con deficiencia de FXI (25.2%). La incidencia de sangrado espontáneo fue escasa (13.7%) y el sangrado muy moderado (epistaxis). Únicamente el 5.8% de las 207 intervenciones quirúrgicas y el 4.2% de los 122 partos presentaron complicaciones hemorrágicas, y solo 2 pacientes precisaron transfusiones. La mayor incidencia de hemorragias se produjo en intervenciones que afectaban tejidos con alta actividad fibrinolítica. La tasa de eventos hemorrágicos fue similar independientemente de la administración profiláctica de plasma fresco congelado (PFC) (realizada en 58 ocasiones). Sin embargo, el PFC causó lesión pulmonar aguda asociada transfusión (TRALI) en dos pacientes. Destacamos la ausencia de complicaciones hemorrágicas en 9 pacientes con deficiencia de FXI bajo tratamiento anticoagulante (mayoritariamente por fibrilación auricular) durante un total de 382 meses. Seis casos presentaron infarto agudo de miocardio y 8 ictus isquémico. Sin embargo, solo 2 casos, con motivos locales predisponentes, sufrieron trombosis venosa, a pesar de que 16 pacientes también eran portadores del FV Leiden o Protrombina G20210A. Conclusiones Identificamos una alta prevalencia de deficiencia de FXI con notable variabilidad genética en un área de la Región de Murcia, encontrando 12 mutaciones diferentes, de las cuales 4 no estaban descritas. Estos resultados junto con la elevada incidencia de falsos negativos del TTPa y la escasa clínica hemorrágica de portadores, sugieren que la incidencia de este desorden en población general está subestimada. La deficiencia de FXI no incrementa notablemente el riesgo hemorrágico ni siquiera si se combina con tratamiento anticoagulante oral. La administración de PFC profiláctico no supone beneficio pero puede tener importantes efectos adversos. La deficiencia de FXI, al menos en heterocigosis, no parece proteger de la trombosis arterial, pero podría proteger del desarrollo de trombosis venosa. Estos resultados, compatibles con los modelos animales y ensayos clínicos de silenciamiento de FXI, junto a la potencial alta incidencia de esta deficiencia, apoyan incluir el estudio de este desorden en las pruebas de trombofilia para definir el riesgo trombótico de cada individuo. ABSTRACT Introduction Recent studies show increasing evidences suggesting a relevant hemostatic function for factor XI (FXI) and prove new roles for this procoagulant factor. FXI deficiency, considered as a rare disorder, might be underestimated due to the low bleeding risk of carriers and the limitations of current diagnostic methods. Objective The main objective of this study was to characterize the FXI deficiency in a Region of 60.000 inhabitants from Murcia (South East of Spain). We aim to determine the incidence, to identify the molecular base, as well as to know the clinical consequences of FXI deficiency. Moreover, we want to evaluate the feasibility of current diagnostic methods. Methods During 20 years, (1994-2014) 324.764 activated partial thromboplastin time tests (aPTT) were done in 51.366 patients. 1.700 cases with a prolonged ratio (> 1,3) were selected. Studies of the intrinsic pathway on these cases allowed the identification of 44 unrelated index cases with FXI deficiency (FXI:C< 70%). In 41 cases, a further family study allowed to recruit finally 214 cases with FXI deficiency. Plasma FXI was evaluated by Western-blot. Genetic analysis included sequencing (by Sanger’s method and by Next Generation Sequencing), MLPA and genotyping using Taqman probes. Results We identified 7 cases with FXI deficiency in homozygosis; 3 in compound heterozygosis and 204 in heterozygosis. We described 4 recurrent mutations: p.Cys56Arg (described in French Basques), p.Cys416Tyr, p.Glu565Lys and p.Pro538Leu identified in 23, 7, 6 and 2 index cases, respectively. Other 8 additional and different mutations were detected in 7 index cases, 4 of them not reported previously, including the first gross insertion described worldwide. Two mutations, one new, caused CRM+ deficiency, with variant protein in plasma that has no functional activity. The aPTT ratio was not prolonged in 54 out of 214 cases with FXI deficiency (25.2%). The incidence of spontaneous bleeding was low (13.7%), and mild (epistaxis). Only 5.8% of the 207 surgery interventions, and 4.2% of the 122 deliveries showed bleeding complications, although only 2 required transfusions. Most bleedings were observed when the surgery involved tissues with high fibrinolytic activity. The rate of bleeding events was similar independently of the prophylactic use of fresh frozen plasma (FFP) (used 58 times). However, we point out that FFP caused transfusion associated lung injury (TRALI) in two patients. We also remark the absence of bleeding complications in 9 patients with FXI deficiency who were under oral anticoagulant treatment (mainly by atrial fibrillation) during a period of 382 months. Six cases developed acute myocardial infarction, and 8 ischemic cerebrovascular events. In contrast, only 2 cases, with local risk factors, suffered from venous thrombosis, even though 16 patients with FXI deficiency also carried other prothrombotic polymorphisms (FV Leiden or prothrombin G20210A) Conclusions We identify a high prevalence of FXI deficiency in a population of Murcia, with remarkable genetic variability, finding 12 different mutations, 4 not previously reported in available mutation databases. These results, together with the high incidence of false negatives rendered by aPTT and the low risk of bleeding for carriers strongly support that FXI deficiency may be underestimated in the general population. FXI deficiency does not significantly increase the risk of bleeding, even in combination with oral anticoagulant treatment. The prophylactic administration of FFP in subjects with FXI deficiency does not significant reduce the bleeding complications during surgery, but might increase the risk of severe side effects. FXI deficiency, at least in heterozygosis, does not seem to protect from arterial thrombosis, but could protect against venous thrombosis, even in subjects carrying other prothrombotic genetic risk factors. These results, which are compatible with recent data obtained with animal models and clinical trials, support to include tests for diagnosis of FXI deficiency in thrombophilic patients in order to define the individual risk of thrombosis, aiming to get a personalized medicine.
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    Estudio descriptivo mutacional de pacientes hemofílicos en la Región de Murcia.
    (2013-12-04) García Candel, Faustino; Moraleda Jiménez, José María; Tizzano Ferrari, Eduardo; Majado Martínez, Mª Juliana; Departamento de Medicina Interna
    Introducción: La Hemofilia se caracteriza por una deficiencia de la actividad de Factor VIII de la coagulación (Hemofilia A) o de Factor IX de la coagulación (Hemofilia B). La prevalencia estimada es de alrededor de 1 por 5000 varones nacidos (para Hemofilia A) y de 1 por 30000 varones nacidos (para Hemofilia B). La transmisión es como un rasgo recesivo ligado al cromosoma X (herencia ligada al sexo). La clínica se basa en la aparición de sangrados recurrentes, cuya intensidad y frecuencia están en estrecha relación con la severidad del defecto de la proteína FVIII o FIX. La complicación más temida actualmente en el tratamiento de la enfermedad es la aparición de aloanticuerpos contra el factor VIII/FIX administrado y que aparece más frecuentemente en las formas graves. El gen del FVIII (F8) se encuentra en la porción telomérica distal del brazo largo del cromosoma X, en la banda Xq28. Consta de 26 exones que se extienden a lo largo de unas 186.000 pares de bases. Las alteraciones genéticas en el gen del FVIII (F8) se pueden clasificar en: grandes reaordenamientos. Inserciones o deleciones, y sustituciones simples. La alteración recurrente más importante clínicamente es un reordenamiento que afecta al intrón 22 (inversión del intrón 22), afectando aproximadamente al 45% de todas las formas graves de Hemofilia A. El gen del FIX (F9) se encuentra localizado en la región telomérica del brazo largo del cromosoma X, en la banda Xq27, tiene un tamaño cercano a las 34 Kb y consta de 8 exones y 7 intrones. Las mutaciones en el gen F9 se pueden clasificar en: mutaciones puntuales, mutaciones hotspots, mutaciones que truncan la proteína y mutaciones que afectan a la región promotora. El grupo más frecuente de alteraciones es el de las mutaciones puntuales. El estudio de las portadoras de Hemofilia constituye una parte fundamental en el manejo de esta patología, tanto para hacer un adecuado asesoramiento genético como para prevenir posibles eventos hemorrágicos en esta población. Para el diagnóstico molecular de la Hemofilia existen dos tipos de metodologías: Técnicas indirectas y la secuenciación nucleotídica directa. Objetivo: El objetivo principal es estudiar las mutaciones que afectan a los pacientes hemofílicos de la Región de Murcia. Material y Método: Estudiamos a 73 pacientes de un total de 80 censados, con una mediana de edad de 26 años (rango 3-76 años). De las 53 familias no relacionadas censadas, estudiamos a 46. La dosificación de los factores VIII y IX se realizó en el laboratorio de Hemostasia del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca, que cuenta con la acreditación de la norma 15189 por ENAC. Los afectados fueron distribuidos por familias no relacionadas, detectándose en cada una de ellas a las portadoras posibles y obligadas mediante la relación del árbol genealógico. El estudio genético se llevó a cabo tanto a los afectados como a las portadoras. Para Hemofilia A se estudió en primer lugar la presencia o ausencia de inversión del intrón 22 y del intrón 1 mediante PCR inversa. En los casos negativos se realizó secuenciación directa del gen F8. Para Hemofilia B se realizó secuenciación directa del gen F9 mediante PCR. Resultados: En nuestra región existen 80 pacientes hemofílicos vivos distribuidos en 53 familias. 65 (81,2%) tienen Hemofilia A y 15 (18,5%) Hemofilia B, con una mediana de edad de 28 años (1 mes-76 años). Existen 28 afectados con Hemofilia A grave, 7 con Hemofilia A moderada, 30 con Hemofilia A leve, 8 con Hemofilia B grave, 1 con Hemofilia B moderada y 6 con Hemofilia B leve. De los 73 pacientes estudiados (distribuidos en 46 familias) hemos encontrado la mutación causante de la enfermedad en todos ellos y se ha confirmado el estado de portadora mediante estudio genético en 102 casos de los 149 miembros femeninos de las distintas familias. El grupo de portadoras más numeroso corresponde al de edades entre 16 y 45 años. De las mutaciones encontradas en la población estudiada, las más frecuentes son las de tipo missense, seguidas por la inversión del intrón 22. Se han encontrado 11 mutaciones no descritas en los registros internacionales, correspondiendo la mayor parte a mutaciones de tipo missense. Existe una incidencia de casos sin antecedentes familiares del 52,2%, con predominio en los casos de HAG (28,3%). No se ha encontrado la alteración genética en la madre en 4 casos. Conclusiones: Se ha podido determinar la alteración genética causante de la Hemofilia en todos los pacientes estudiados, siendo el tipo de mutación más frecuente la missense. Existe un porcentaje importante de casos esporádicos, la mayoría con Hemofilia A grave, en los que se ha determinado los casos de portadoras y poder realizar un adecuado asesoramiento genético. La incidencia de inhibidores ha sido del 11%, algunos casos asociados a mutaciones no descritas en registros internacionales. Por otra parte, el algoritmo de estudio genético diseñado para este trabajo ha resultado efectivo. Introduction: Hemophilia is characterized by a deficiency in the activity of coagulation factor VIII (Hemophilia A) or coagulation Factor IX (Hemophilia B). The estimated prevalence is about 1 per 5000 male births (Hemophilia A) and 1 in 30,000 male births (for hemophilia B). The transmission as a recessive X-linked (sex-linked inheritance). The clinic is based on the occurrence of recurrent bleeding and the intensity and frequency are closely related to the severity of the defect protein. The most feared complication in the treatment of the disease is the occurrence of alloantibodies against factor VIII / FIX administered and most frequently occurring in severe forms. The F8 gene is in the distal portion of the long arm of chromosome X in the Xq28 band. Consists of 26 exons spanning along some 186,000 base pairs. Genetic alterations in the F8 gene can be classified as: Gross gene rearrangements. Insertions or deletions, and simple substitutions. The most important mutation is the recurrent rearrangement involving the intron 22 (intron 22 inversion), affecting approximately 45% of all severe forms of hemophilia A. The F9 gene is located at the telomeric region of the long arm of the X chromosome, on Xq27 band and has a size close to 34 kb and consists of 8 exons and 7 introns. Mutations in this gene can be classified into: point mutations, hotspots mutations, protein truncating mutations and promoter region mutations. The most common group of disorders is the point mutations. The study of carriers of Hemophilia is an essential part in the management of this condition, both for adequate genetic counseling and to prevent possible bleeding events in this population. For molecular diagnosis of haemophilia two types of methodologies: Indirect techniques and direct nucleotide sequencing Objective: The main objective is to study mutations affecting hemophiliacs patients in the Region of Murcia. Material and Methods: We studied 73 patients with a total of 80 census, with a median age of 26 years (range 3-76 years). Of the 53 unrelated families surveyed, we studied 46. The dosage of factor VIII and IX was held at the Hemostasis Laboratory University Hospital Virgen de la Arrixaca, with the accreditation of the standard 15189 by ENAC. These patients were distributed in unrelated families, detected in each of the carriers by performing the pedigree. The genetic study was conducted both affected and carriers. In Hemophilia A is first examined the presence or absence of intron 22 inversion and intron 1 inversion by inverse PCR. In negative cases direct sequencing was performed of F8 gene. Hemophilia B Direct sequencing was performed by PCR of F9 gene. Results: In our region there are 80 living hemophiliacs distributed in 53 families. 65 (81.2%) have Hemophilia A and 15 (18.5%) Hemophilia B, with a median age of 28 years (1 month-76 years). There are 28 affected with severe Hemophilia A, Hemophilia 7 with moderate, 30 with mild hemophilia A, 8 with severe haemophilia B, one with moderate Hemophilia B and 6 with mild Hemophilia B. Of the 73 patients studied (distributed in 46 families) have found the mutation in all of them and confirmed the carrier status by genetic study in 102 cases of the 149 female members of the different families. The largest carrier group corresponds to ages 16 and 45. Of the mutations found in the study population, the most common are missense, followed by the inversion of intron 22. We have found 11 mutations not described in the international records, being missense mutationts the most frequent. There is an incidence of cases with no family history of 52.2%, predominantly in severe Hemophilia A (28.3%). In four mother no genetic alteration was found. Conclusions: It was possible to determine the genetic alteration responsible for Hemophilia in all patients studied, being the most common type of the missense mutation. There is a significant percentage of sporadic cases, most with severe hemophilia A. In this cases, the carrier diagnosis is essential for an adequate genetic counseling. The incidence of inhibitors was 11%, some cases associated with mutations not described in international registrations. Moreover, genetic analysis algorithm designed for this work has been effective.