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Actinobacillus pleuropneumoniae : estudio de la inmunidad maternal mediante ensayos inmunoenzimáticos frente a las toxinas RTX (Apx I, II, III y IV) y la proteína de membrana OmpA
(Universidad de Murcia, 2024-11-12) Espigares Espigares, David; Ramis Vidal, Guillermo; Pallarés Martínez, Francisco J.; Escuela Internacional de Doctorado
En este trabajo se ha realizado un estudio de la evolución desde el nacimiento hasta la 10ª semana de vida de los anticuerpos maternales frente a las toxinas RTX (ApxI, II, III y IV) y frente a la proteína OmpA de Actinobacillus pleuropneumoniae. Para este fin se han empleado pruebas de ensayo inmunoenzimático (ELISA) frente a las toxinas Apx I, II, III, y IV y la proteína OmpA en 42 lechones procedentes de 7 cerdas de una granja comercial positiva a la bacteria. Se tomaron muestras de suero sanguíneo de las cerdas a las 24 horas post parto y de los lechones a las 24 horas, y posteriormente cada 7 días, hasta la 10ª semana de vida, para determinar la dinámica y duración de estos anticuerpos. Otro de los objetivos del presente trabajo fue evitar que los lechones fuesen colonizados por la bacteria, y de este asegurar que los anticuerpos detectados se debiesen exclusivamente a los transmitidos por su madre. A este fin, se llevó a cabo un protocolo consistente en el tratamiento antibiótico de todas las cerdas el día del parto, así como a los 11 días de lactación. Por otro lado, los lechones seleccionados fueron tratados con otro antibiótico cada 14 días desde la segunda hasta la decimosexta semana de edad. Se comprobó con muestras de suero tomadas a las 18ª semana de edad. Por otro lado, se evaluó el comportamiento de estas pruebas serológicas frente a las toxinas ApxI-IV y la proteína OmpA en animales negativos a A. pleuropneumoniae, analizando la posible presencia de anticuerpos debido a otros patógenos con producción de toxinas ApxI-III u otras toxinas RTX antigénicamente relacionadas, o con proteínas de membrana que pudiesen presentar reacción serológica cruzada con las pruebas empleadas. Una vez analizados los resultados, se observó que en todos los casos el nivel de anticuerpos de la madre condiciona el nivel de anticuerpos de los lechones a las 24 horas. La vida media de estos anticuerpos puede ser muy diferente en función del antígeno de que se trate, encontrando vidas medias inferiores a las 2-3 semanas en el caso de los anticuerpos frente a las toxinas ApxI, ApxIII y la proteína OmpA, así como vidas medias más elevadas en el resto, superando en el caso de la ApxII las 5 semanas y en el caso de la ApxIV las 8 semanas, llegando a encontrarse con estas dos últimas un considerable número de animales con anticuerpos maternales a la 10ª semana de vida. Además, la cantidad de anticuerpos maternales no es homogénea en todos los lechones a las 24 horas de vida. Esta heterogeneidad está influida por el nivel de anticuerpos de la cerda. Se ha observado un elevado número de animales en la granja negativa con anticuerpos frente a la toxina ApxII. Este hecho indica que aquellos antígenos que pueden estar presentes en otras bacterias, como las toxinas ApxI-III, podrían lugar a la aparición de reacciones serológicas cruzadas con las pruebas ELISA frente a las mismas, presentando por tanto estas pruebas una baja especificidad para la detección de infecciones por A. pleuropneumoniae. En animales negativos, la concordancia observada entre las pruebas para detección de anticuerpos frente a la toxina ApxIV y frente a la proteína OmpA es muy elevada, así como la concordancia de la prueba de detección de anticuerpos frente a la toxina ApxII respecto al resto de pruebas es muy baja. La mejor estrategia para evaluar la situación de una granja respecto a A. pleuropneumoniae es la combinación de varias pruebas serológicas frente a distintos antígenos. Finalmente, con el protocolo profiláctico establecido no se detectó seroconversión de los animales con ninguna de las pruebas realizadas al menos hasta la semana 18ª, pudiendo establecer el éxito de este para evitar el contagio de los animales hasta aproximadamente la semana 14ª de edad.
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Análisis de las pérdidas por exudación en cerdos alimentados con un suplemento de selenio orgánico y vitaminas E y C en dietas engordes
(Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1997) Muñoz Luna, Antonio; Garrido Fernández, María Dolores; Granados Fuentes, María Victoria; Facultad de Veterinaria
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Análisis del estado actual del ciclo del cerdo en España
(Murcia : Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1992) Rouco Yáñez, Antonio; Ruiz Abad, L.; Calahorra, Francisco J.; Facultad de Veterinaria
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Análisis estructural de la producción porcina en México / Francisco Ernesto Martínez Castañeda; [director, Antonio Rouco Yañez].
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Producción Animal,, 2005) Martínez Castañeda, Francisco Ernesto
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Antioxidantes del plasma seminal : potenciales biomarcadores de fertilidad en verracos incluidos en programas de inseminación artificial
(Universidad de Murcia, 2018-02-07) Barranco Cascales, Isabel; Roca Aleu, Jorge; Rodríguez Martínez, Heriberto; Facultad de Veterinaria
La Tesis Doctoral, presentada por compendio de publicaciones y estructurada en 5 artículos científicos, tuvo como principal objetivo determinar componentes del plasma seminal (PS) de porcino con propiedades antioxidantes y evaluar su valor predictivo para la calidad y funcionalidad espermática y la fertilidad de verracos incluidos en programas de inseminación artificial (IA). Concretamente, se evaluó la capacidad antioxidante total (TAC, artículo1), las enzimas paraoxonasa tipo 1 (PON-1, artículo 2 y 3) y glutatión peroxidasa 5 (GPX5, artículo 4), y la melatonina (MLT, artículo 5). Para llevar a cabo los estudios se utilizaron 821 eyaculados, procesados de forma entera o fraccionada, procedentes de 440 verracos y un total de 16.942 cerdas fueron inseminadas. Las muestras de PS fueron obtenidas inmediatamente después de la recogida de los eyaculados, mediante una doble centrifugación a 1.500 xg durante 10 min y almacenadas a -80 ºC hasta el momento de su análisis. La TAC y la actividad de PON-1 fueron determinadas usando un analizador automatizado, evaluando la decoloración del 2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) y midiendo la hidrólisis del p-nitrofenil acetato a p-nitrofenol, respectivamente. La concentración de PON-1, GPX5 y MLT fueron determinadas usando ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante y usando un lector de placas. La motilidad espermática fue evaluada mediante un sistema de análisis espermático computarizado. La viabilidad espermática y los parámetros de funcionalidad espermática (producción intracelular de peróxido de hidrógeno, producción mitocondrial del anión superóxido [O2-], producción total de O2- y peroxidación lipídica), fueron evaluados mediante técnicas de citometría de flujo. El análisis inmunohistoquímico y el western blot (WB) se realizaron en muestras de tejidos de órganos genitales del verraco (testículo, epidídimo y glándulas sexuales accesorias [próstata, glándulas bulbouretrales y vesículas seminales], usando un anticuerpo policlonal primario contra GPX5. Los registros de fertilidad de los verracos fueron evaluados en términos de tasa de parto (número de cerdas que paren respecto al número de cerdas inseminadas), tamaño de camada (número total medio de lechones nacidos por camada) e índice de fertilidad (número de lechones nacidos por cada 100 cerdas inseminadas). Los resultados demostraron que la TAC, la actividad PON-1 y la concentración de la GPX5 y MLT, variaba entre verracos, entre eyaculados dentro del verraco y entre las fracciones del eyaculado. La TAC mostró una relación positiva con parámetros de calidad y funcionalidad espermática de muestras seminales conservadas en estado líquido (15-17 ºC) y congeladas-descongeladas. A su vez, la actividad de PON-1 y la concentración de GPX5 y MLT, estuvieron positivamente relacionadas con parámetros de calidad y/o funcionalidad espermática de muestras seminales conservadas en estado líquido (15-17 ºC). El WB y estudio inmunohistoquímico revelaron la presencia de la GPX5 en todos los órganos genitales. Finalmente, la TAC, la actividad de PON-1 y la concentración de GPX5 mostraron una relación positiva con la fertilidad, pudiendo su determinación en PS ser utilizada como un biomarcador de fertilidad.The PhD Thesis, presented as a compendium of publications and structured by 5 scientific papers, aimed to determine components with antioxidant properties in porcine seminal plasma (SP) and to evaluate its predictive value for sperm quality and functionality and for the fertility of boars used in artificial insemination (AI)-programs. Specifically, the SP-total antioxidant capacity (TAC, paper 1), the enzymes paraoxonase type 1 (PON-1, papers 2 and 3) and glutathione peroxidase 5 (GPX5, paper 4), as well as melatonin (MLT, paper 5) presence/activity in SP were studied. To achieve the objective 821 ejaculates, processed as entire ejaculate or fractions from 440 boars were used and a total of 16,942 sows were inseminated alongside. SP-samples were harvested immediately after ejaculation, through double centrifugation at 1,500 xg for 10 min, and were stored at -80 °C until analyses. The TAC and PON-1 activity were determined using an automated analyzer, assessing 2, 2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) decolorization and measuring the hydrolysis of p-nitrophenyl acetate to p-nitrophenol, respectively. The PON-1, GPX5 and MLT concentrations were determined using enzyme-linked immunosorbent assays using a micro-plate reader. Sperm motility was evaluated using a computer-assisted sperm analyzer. Sperm viability and sperm functionality parameters (intracellular production of hydrogen peroxide, mitochondrial production of superoxide anion [O2-], total production of O2- and lipid peroxidation) were evaluated by flow cytometric techniques. Western blot [WB] and immunohistochemistry of samples from testis, epididymis and accessory sex glands (prostate, bulbourethral glands and seminal vesicles) using a primary polyclonal antibody antibody against GPX5. Fertility outcomes of boars were evaluated as farrowing rates (number of farrowing sows respect to the number of inseminated sows), litter size (total number of piglets born per litter) and fertility index (number of piglets born per 100 sows inseminated). The results showed that TAC, PON-1 activity and GPX5 and MLT concentrations, differed among boars, ejaculates within boar and among ejaculate portions within an ejaculate. The TAC showed a positive relationship with sperm quality and functionality parameters of liquid-stored (15-17 ºC) and frozen-thawed semen. Likewise, PON-1 activity or GPX5 and MLT concentrations were positively related to sperm quality and/or functionality parameters of liquid-stored semen samples (15-17 ºC). The WB and immunohistochemical analysis revealed the presence of GPX5 in all genital organs. Finally, TAC, PON-1 activity and GPX5 concentration were positively related with fertility, determining that their measurements in SP, isolated or combined, could be used as fertility biomarkers.
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Aproximación fisiológica para la optimización del sistema de producción de embriones in vitro en la especie porcina
(Universidad de Murcia, 2019-09-19) García Martínez, Soledad; Coy Fuster, Pilar; Romar Andrés, Raquel; Bernabò, Nicola; Escuela Internacional de Doctorado
El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es la aproximación de las condiciones de IVF y EC a las registradas en el tracto reproductor de la cerda para la mejora de la producción in vitro de embriones en la especie porcina. Con este fin, se realizaron cuatro experimentos. Los dos primeros consistieron en la modificación de los medios de cultivo utilizados durante la IVF y el EC mediante la adición de proteínas específicas o fluidos naturales presentes en el oviducto y el útero de la cerda. Los dos últimos experimentos consistieron en obtener in vivo los valores de referencia para parámetros físico-químicos como el oxígeno y temperatura del interior de los órganos reproductores de la cerda, y transferirlos a las condiciones in vitro. En el primer experimento, ovocitos porcinos madurados in vitro fueron incubados en un medio con heparina, ezrin, HSP-70-1A o HSP-90α a excepción del grupo control. Estos mismos grupos fueron utilizados durante la IVF. Los resultados mostraron que heparina y cada una de las proteínas por sí mismas eran capaces de endurecer la zona pelúcida de los ovocitos porcinos, es decir, aumentar los tiempos de digestión para la zona pelúcida. La combinación de heparina con cada una de las proteínas aumentó esos tiempos, excepto para HSP-90α donde disminuyó. Aunque prometedores, ya que el efecto de heparina y cada una de las proteínas añadidas al medio de IVF redujeron las tasas de polispermia, los resultados también mostraron bajas tasas de penetración cuando estas moléculas fueron añadidas a los medios, de manera que no se consiguió la mejora de la técnica de IVF con este enfoque. En el segundo experimento se compararon dos métodos de selección espermática. Uno de los métodos más utilizados para la especie porcina, centrifugación a través de un gradiente de densidad, se comparó con un nuevo procedimiento que hizo que los espermatozoides nadaran en un tubo que contenía un medio de cultivo con o sin fluido oviductal porcino (POF) con la intención de imitar los cambios sufridos por los espermatozoides en su ascenso por el tracto reproductor femenino. Por otro lado, se compararon dos sistemas de producción de embriones. Un nuevo sistema de cultivo, donde se añadió de forma secuencial POF al medio de IVF, y POF y fluido uterino porcino (PUF) a los medios de EC, frente a un sistema de producción de embriones donde no se añadió estos fluidos a los medios. Los resultados indicaron que la utilización de swim-up como método de selección espermática para la producción de embriones porcinos alcanzó el 40 % de rendimiento, indicando una mejora con respecto a los mejores resultados previos registrados en cerdos (30 -35 %). Además, ese valor incrementó un 5 % cuando los fluidos reproductivos fueron añadidos a los distintos medios de cultivo, superando incluso el valor de rendimiento dado para la especie bovina. Igualmente, la adición de los fluidos a los medios mejoró la calidad de los embriones obtenidos, alcanzando un número medio de células similar al de embriones obtenidos in vivo. En el tercer y cuarto experimento se realizaron una serie de mediciones de oxígeno y temperatura en el tracto reproductivo de cerdas adultas y cerdas pre-púberes, en distintas fases del ciclo estral, usando técnicas de cirugía y sondas mínimamente invasivas. A continuación, los valores obtenidos se transfirieron a las técnicas de IVF y EC, con el propósito de mejorar la producción de embriones porcinos in vitro. El tercer experimento reveló por primera vez la cantidad de oxígeno dentro de los órganos reproductivos de la cerda adulta (7 %), siendo este valor mayor (10 %) para cerdas pre-púberes tratadas con hormonas. Se observaron dos perfiles para las medidas de oxígeno: perfil plano, donde la variación de oxígeno fue mínima respecto al promedio, y un perfil ondulado que presentó pequeñas variaciones (±2) respecto al promedio. El perfil ondulado fue asociado al útero. El uso de condiciones de hipoxia (7 % oxígeno) durante la IVF seguido del EC mejoró la producción de embriones porcinos y la calidad de los blastocistos obtenidos. En el cuarto experimento se demostró la existencia de un gradiente de temperatura entre oviducto (37.0 ºC) y útero (38.7 ºC) por primera vez. La transferencia de ese gradiente durante las técnicas de IVF y EC mejoró la producción de embriones in vitro en la especie porcina a través de la reducción de los ratios de polispermia. El uso de una temperatura elevada (39.5 ºC) durante la IVF ejerció el efecto contrario al uso de una temperatura baja (37.0 ºC), ya que aumentó los ratios de polispermia y se pudo intuir una mayor fragmentación de los embriones producidos a esa temperatura. La obtención de la temperatura de transición para espermatozoides capacitados de verraco (37.0 ºC), así como la incubación de esos espermatozoides a distintas temperaturas (37.0 ºC, 38.5 ºC y 39.5 ºC) determinó un papel relevante de ésta en la remodelación de los lípidos de la membrana plasmática del espermatozoide y su implicación en la IVF. The objectives of this PhD Thesis are approaching the IVF and CE conditions to those recorded in the sow's reproductive tract for the improvement of the in vitro production of porcine embryos. To this end, four experiments have been carried out. The first two consisted of the modifications in the culture media used during IVF and CE by adding either specific proteins or natural fluids present in the oviduct and uterus of sows. The last two experiments consisted of obtaining in vivo, inside the reproductive organs of the female pig, the reference values for physical-chemical parameters such as oxygen and temperature, and transfer them to in vitro conditions. In the first experiment, porcine oocytes matured in vitro were incubated in a medium with heparin, ezrin, HSP-70-1A or HSP-90α. These same groups were used during IVF since heparin or proteins were added to the IVF medium with the oocytes and spermatozoa. In the control groups, gametes were incubated in a medium without heparin nor proteins. The results showed that heparin and each of the tested proteins hardened the ZP of the porcine oocytes, by increasing its resistance to enzymatic digestion. The combination of heparin with each of the proteins increased such hardening effect, except for HSP-90α, where the the ZP´s resistance was reduced. While promising, since the effect of heparin and each of the proteins added into the IVF medium drafted the polyspermy rates, IVF outcome was not improved because of the reduction in the penetration rates. In the second experiment, two sperm selection methods were compared. One of the widely used procedures in swine, the density gradient centrifugation, was compared with a new procedure, which made the sperm swam up in a tube containing culture media with or without porcine oviductal fluid (POF). On the other hand, two IVEP systems were compared. A new system containing POF and porcine uterine fluid (PUF) within the culture media during IVF and EC was compared with a system where those biofluids were not added to the culture media. The results indicated that the use of swim-up as sperm selection procedure for the production of porcine embryos reached a 40% yield, indicating an improvement with regard to the best results obtained in pigs up to date (30-35%). Furthermore, that value increased in a 5% when the reproductive fluids were added to the different culture media, even surpassing the value of the yield given for the bovine species. Likewise, the addition of the fluids to the media improved the quality of the porcine in vitro embryos produced, which achieved a mean number of cells similar to porcine embryos collected in vivo. In the third and fourth experiments, a series of measurements of oxygen and temperature were made in the reproductive tract of sows and gilts at different phases of the estrous cycle, using minimally invasive surgery techniques and new probes. The values obtained were then transferred to IVF and CE procedures, with the purpose of improving the production of porcine embryos in vitro. The third experiment revealed the amount of oxygen within the reproductive organs of sow (7%), being higher in gilts treated with hormones (10%). Two profiles for oxygen measurements were observed: a flat profile, where the oxygen variations were minimal with respect to the average, and a wavy profile, which showed small variations (± 2) with respect to the average. The wavy profile was associated with the uterus. The use of hypoxia conditions (7% oxygen) during IVF followed by EC improved porcine IVEP outcome and the quality of the porcine blastocysts obtained. In the fourth experiment was demonstrated the existence of a temperature gradient between the oviduct (37.0 ºC) and uterus (38.7 ºC) for the first time. Transferring this gradient during IVF and CE improved the production of in vitro embryos in the porcine species through the reduction of the polyspermy rates. In addition, the use of a high temperature (39.5 ºC) during IVF exerted the opposite effect to the use of a low temperature (37.0 ºC), since its use increased the polyspermy rates, and a greater fragmentation of the embryos obtained at high temperature was observed. On the other hand, obtaining the transition temperature for capacitated boar sperm (37.0 ºC), as well as the incubation of these spermatozoa at different temperatures (37.0 ºC, 38.5 ºC and 39.5 ºC), indicated an important role of temperature in the remodelling of the lipids contained in the sperm membrane and its implication in IVF.
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Avances en criopreservación y transferencia no quirúrgica de embriones porcinos = Advances in cryopreservation and non-surgical transfer of porcine embryos / Jesús Gomis Almendro.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Veterinaria,, 2013) Gomis Almendro, Jesús
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Avances en criopreservación y transferencia no quirúrgica de embriones porcinos = Advances in cryopreservation and non-surgical transfer of porcine embryos.
(2013-10-04) Gomis Almendro, Jesús; Martínez García, Emilio Arsenio; Cuello Medina, Cristina; Facultad de Veterinaria
La industria porcina tiene un considerable interés en el uso de la transferencia de embriones, incluyendo la criopreservación de los mismos. Sin embargo, la utilización comercial de la transferencia de embriones en esta especie ha sido muy limitada debido principalmente a la necesidad de utilizar procedimientos quirúrgicos para la obtención y transferencia de los embriones, y a las dificultades encontradas para la criopreservación de dichos embriones mediante los protocolos tradicionales. Últimamente, se han abierto nuevas expectativas para la utilización comercial de esta tecnología gracias al desarrollo de un procedimiento para transferir embriones por vía no quirúrgica y al desarrollo de la vitrificación como método alternativo a los procedimientos tradicionales de criopreservación. El objetivo de esta tesis es mejorar la transferencia vía no quirúrgica de embriones vitrificados-calentados y, desarrollar un protocolo de vitrificación eficiente para los estadios tempranos de desarrollo de embriones porcinos obtenidos, pudiendo aumentar su viabilidad post-calentamiento. Palabras claves: Transferencia de embriones; porcino; Vitrificación; Blastocistos; MEM vitaminas; Forskolin; Delipidación; Desarrollo embrionario; Criopreservación; Cigoto; Embriones de 2 células; Embriones de 4 células; In vivo; Cerdo. Summary The swine industry has a considerable interest for the use of embryo transfer and cryopreservation since these technologies may allow the transport and storage of valuable genetic material with minimal health risks and cost. However, the commercial application of embryo transfer in pig has been traditionally limited due to the need of surgical transfer procedures and the difficulties for long-term storage of pig embryos by using traditional cryopreservation methods. However, new perspectives for embryo transfer and embryo cryopreservation have occurred with the development of a new device, for non-surgical embryo transfer and with the development of vitrification as an alternative to traditional cryopreservation methods. This thesis was designed to improve the non-surgical deep intrauterine embryo transfer procedure with vitrified embryos and develop an efficient and practical vitrification protocol for porcine embryos at very early developmental stages. Keywords: Embryo transfer; Porcine; embryos; Vitrification; Blastocysts; MEM vitamins; Forskolin; Delipidation; Embryo development; Cryopreservation; zygote; 2-Cell embryos; 4-Cell embryos; In vivo; Pig
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Avances en el conocimiento de la cromogranina A y otros biomarcadores salivares de estrés en cerdos= Advances in the knowledge of chromogranin A and other salivary biomarkers of stress in pigs
(2014-12-01) Escribano Tortosa, Damián; Cerón Madrigal, José Joaquín; Gutiérrez Montes, Ana María; Martínez Subiela, Silvia; Facultad de Veterinaria
Esta tesis doctoral, por compendio de artículos, ha sido diseñada con el fin de producir avances en la medición de biomarcadores de estrés y para desarrollar y validar un panel de biomarcadores salivares para evaluar los diferentes sistemas fisiológicos (simpático-adrenomedular (SAM), hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA), hipotálamo-pituitario-gonadal (HPG) y sistema inmune) que participan en el mecanismo de estrés. Para ello, los objetivos de esta tesis son los siguientes: desarrollar y validar un ensayo inmunofluorométrico a tiempo resuelto (TR-IFMA) para las mediciones de cromogranina A (CgA) salivar porcina, utilizando un anticuerpo específico de la especie, y evaluar su comportamiento como posible biomarcador del sistema SAM en un modelo de estrés agudo. Además, estudiar si las concentraciones de CgA salivar exhiben un patrón circadiano durante el día, y evaluar su estabilidad bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Por otra parte, validar inmunoensayos disponibles comercialmente para la cuantificación de cortisol (biomarcador del sistema HPA), testosterona (biomarcador del sistema HPG) e IgA (biomarcador del sistema inmune) en la saliva de los cerdos. Evaluar la respuesta de un panel de varios biomarcadores salivares tanto del sistema inmune como del sistema neuroendocrino a la administración repetida de Escherichia coli lipopolisacárido (LPS) y, por último, investigar la respuesta de todo este grupo de biomarcadores salivares después de aplicar un modelo de estrés psicosocial en cerdos basado en el aislamiento y el reagrupamiento. En cuanto a la metodología empleada, los anticuerpos policlonales específicos producidos para el desarrollo del TR-IFMA fueron obtenidos mediante la inmunización con un péptido recombinante de proteína CgA porcina. La precisión, exactitud y sensibilidad analítica del TR-IFMA desarrollado y de los inmunoensayos comerciales empleados fueron evaluadas mediante los coeficientes de variación intra- e interensayo, la linealidad bajo dilución y el porcentaje de recuperación, el límite de detección y los límites de cuantificación. Para estudiar la respuesta de los biomarcadores salivares frente al estrés se emplearon modelos en los que los animales fueron inmovilizados con un acial o transportados a matadero. Tomando muestras de saliva antes y después de aplicar dichos estímulos estresantes. Por otro lado, en el caso de la administración de LPS, los cerdos que fueron utilizados recibieron tres dosis de LPS en intervalos de 48 h. Las muestras de saliva fueron tomadas antes de la administración de LPS y 3 h después de cada una de las administraciones. Por otra parte, en el modelo de aislamiento y reagrupamiento todos los animales se adaptaron a la vida en grupo durante 5 días, después de lo cual, un grupo de cerdos fueron sometidos al procedimiento de aislamiento, donde los animales permanecieron sin contacto físico con otros cerdos durante 5 días. Después, los cerdos del ensayo se reagruparon de nuevo durante 3 días, regresando a las condiciones iniciales. Los cerdos controles permanecieron en las mismas condiciones durante todo el estudio. Las muestras de saliva se tomaron diariamente, a la misma hora, y un muestreo adicional fue realizado a los 30 min tras los procedimientos de aislamiento y reagrupado. En general, nosotros podemos concluir de este trabajo que: el TR-IFMA desarrollado permite la cuantificación de CgA en muestras de saliva porcina de una forma precisa, exacta y sensible y su concentración aumenta significativamente después de una situación de estrés agudo. Además, no ha sido detectado un patrón circadiano para la CgA salivar y este biomarcador fue bastante estable, siendo posible su almacenamiento hasta un año a -20ºC o -80ºC. Por otra parte, los inmunoensayos comerciales validados para las concentraciones de cortisol, testosterona e IgA pueden ser utilizados para su uso en muestras de saliva de cerdos con una buena precisión, sensibilidad y exactitud. En cuanto a la administración de LPS, una sola administración en cerdos produce incrementos de IgA salivar y cortisol. Sin embargo, administraciones repetidas solo producen incrementos en IgA mientras que el cortisol retorna a valores basales. No se observaron variaciones en las concentraciones de CgA ni con una sola administración ni con administraciones repetidas. Finalmente, el uso de un panel de biomarcadores salivares podría ser esencial en la investigación de estrés, ya que estos reaccionan de manera diferente a diversos tipos de factores estresantes. En el caso del aislamiento, CgA e IgA parecen ser marcadores más sensibles que el cortisol y la testosterona, mientras que después del proceso de reagrupado, el cortisol, la testosterona y la CgA parecen ser marcadores más sensibles que la IgA. Abstract This PhD thesis, for compendium of articles, was designed in order to produce advances in the measurement of salivary biomarkers of stress and to develop and validate a panel of salivary biomarkers to evaluate the different physiological systems (sympatho-adrenomedullary (SAM), hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA), hypothalamus-pituitary-gonadal (HPG) and immune system) that are taking part in stress mechanism. To this end, the objectives of this thesis are: to develop and validate a time-resolved immunofluorometric assay (TR-IFMA) for porcine salivary chromogranin A (CgA) measurements, using a species-specific antibody, and evaluate its behaviour as a potential biomarkers of SAM system in an acute stress model. In addition, to study if salivary CgA concentrations exhibit any circadian pattern during the daytime, and to evaluate its stability under different storage conditions. Moreover, validate commercially available immunoassays for cortisol (HPA system biomarker), testosterone (HPG system biomarker) and IgA (immune biomarker) quantification on the saliva of pigs. To evaluate the response of a panel of several salivary biomarkers both of immune system as well as of the neuroendocrine system to repeated administration of Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) and, finally, to investigate the responses of this group of salivary biomarkers after applying a psychosocial stressor model in pigs based on isolation and regrouping. Regarding the methodology, polyclonal antibodies specific for the development of TR-IFMA were produced in rabbits immunized with a recombinant protein peptide of CgA porcine. Precision, accuracy and analytical sensitivity of the TR-IFMA developed and of the commercial immunoassays used were evaluated by the coefficients of variation intra- and inter-assay, linearity under dilution and the percentage of recovery, limits of detection and limits of quantitation. To study the stress response of salivary biomarkers, models in which the animals were immobilized with a nose-snare or transported to slaughterhouse were used. Saliva samples were taken before and after of applying these stressful stimuli. On the other hand, in the case of LPS administrations, the pigs were selected to receive three doses of LPS at 48 h intervals. Saliva samples were taken prior to any LPS administration and at time points corresponding to 3 h after each injection. Moreover, in the model of isolation and regrouping all animals were adapted to group living for 5 days, after which time, pigs in one group were subjected to the isolation procedure, where each animal had not physical contact with other pigs during 5 days. After, test pigs were regrouped again during 3 days returning to the initial conditions. Control pigs were remained in the same housing condition during the entire experimental period. Saliva samples were taken daily, at the same time, and one sampling was carried out at 30 min after of isolation and regrouping events. In overall, we can conclude of this work that: the TR-IFMA developed allows the quantification of CgA in porcine saliva samples in a precise, accurate and sensitive way and its concentrations increase after an acute stress situation. In addition, no circadian pattern has been detected for salivary CgA and this biomarker was fairly stable being able to be stored till 1 year at -20ºC or -80ºC. Moreover, the commercial immunoassays validated for cortisol, testosterone and IgA concentrations can be suitable for its use in saliva samples of pigs with a good precision, sensitivity and accuracy. In relation to LPS administrations, a single administration in pigs produces increases of salivary IgA and cortisol. However, repeated administrations only produced increases in IgA whereas cortisol returned to baseline values. No variation in CgA concentrations were observed neither in single nor in repeated LPS administration. Finally, the use of a panel of salivary biomarkers would be essential in stress research, since these react differently to various types of stressors. In the case of isolation, CgA and IgA appear to be more sensitive markers than cortisol and testosterone, whereas after the process of regrouped, cortisol, testosterone and CgA seem to be more sensitive markers than IgA.
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Bienestar del lechón en la fase de lactación
(2014-02-17) Cumbe Nacipucha, Patricia Katiusca; Otal Salaverri, Julio; Hevia Méndez, María Luisa; Facultad de Veterinaria
Resumen Esta tesis presenta un estudio del comportamiento de los lechones adoptados y las estrategias que se podrían aplicar para disminuir las emociones negativas derivadas de la práctica de la adopción. En este sentido, se realizó en una primera experiencia un análisis detallado del efecto de la edad en el comportamiento de los lechones adoptados de uno, cuatro y siete días de edad durante tres períodos de observación de dos horas de duración. En general, se observó que los lechones adoptados de mayores edades tienen dificultades para adaptarse a la camada y a la cerda adoptiva. Sobre todo los lechones de siete días de edad presentan agresiones en la ubre aun durante el tercer periodo con mayores lesiones en la zona de la cabeza. Además, las conductas observadas en los adoptados como el caminar, las vocalizaciones y el intento de escape fueron buenos indicadores del estado emocional de los lechones y el juego del estado de bienestar. Los resultados de este estudio sugieren que las primeras horas de adopción son las más criticas para el lechón, afectado tanto emocional como físicamente, siendo los lechones de siete días de edad los que presentan peor capacidad de adaptación. Este estudio posteriormente fue utilizado como control en las siguientes experiencias. En la segunda experiencia se analizó el efecto del enriquecimiento ambiental con objetos y el enriquecimiento sensorial acústico en los lechones de uno y cuatro días de edad en un solo período de observación de dos horas de duración inmediatamente después de la adopción. En general, se observó que los lechones de cuatro días de edad permanecieron aislados menos tiempo y los agresores disminuyeron considerable con pocas agresiones de menor duración, mientras que estas agresiones no existieron en los lechones de 1 día. En ambas edades el intento de mamar entre amamantamientos ocurrió menos veces y el juego fue frecuente y duradero. Por tanto, el uso del enriquecimiento ambiental beneficiaría el comportamiento de los lechones en adopción acelerando el proceso de adaptación. En la tercera experiencia se estudió el efecto del momento del día en que se efectúan las adopciones en los lechones de uno y cuatro días de edad en un periodo de observación de dos horas de duración. Las adopciones fueron realizadas en horas de la tarde y posteriormente comparadas con las adopciones de la primera experiencia realizadas en horas de la mañana. En términos generales, los lechones de cuatro días de edad presentaron un comportamiento de aislamiento disminuido, un descanso prolongado con la camada receptora, y menor frecuencia y tiempo de mamar entre periodos de amamantamiento. Además, las agresiones en ambas edades duraron poco tiempo y las agresiones entre adoptados y residentes decrecieron, asimismo, en los lechones de cuatro días de edad el porcentaje de lechones agresores disminuyó. Mientras que el juego fue muy frecuente y prolongado en los lechones de un día de edad. Por lo cual, pensamos que realizar las adopciones en horas de la tarde puede ayudar a disminuir el estado de frustración de los lechones adoptados. En la cuarta experiencia se consideró el efecto de la situación espacial de la madre biológica en el comportamiento de los lechones adoptados. Los lechones adoptados manifestaron un comportamiento de aislamiento disminuido, tardaron en mamar entre amamantamientos, el intento de escape y las vocalizaciones disminuyeron. Las agresiones en los lechones de un día no existieron y duraron poco tiempo en los de cuatro días de edad. En base a estos resultados sugerimos que realizar las adopciones en un ambiente aislado de los estímulos familiares podría ayudar a disminuir las emociones negativas en los lechones. ABSTRACT This thesis presents a study on the behavior of adopted piglets and the strategies that could be applied to reduce the negative emotions caused by the practice of adoption. In the first study a detailed analysis on the behavior of adopted pigs from the ages of one, four and seven days, during three distinct stages of observation which was two hours in duration distributed over a twenty-four period. In general, it was observed that adopted pigs of older ages had difficulties adapting to their litter and to their adoptive sow, especially pigs of seven days of age, which resulted repeated attempts to escape and a marked “wandering-squealing syndrome during the first period and aggression during sucking towards other members of the litter this resulted in major injuries to the zone of the head and continue into the third period. The results of this study suggests that the first hours of adoption were the most critical for adopted piglets which were affected both emotionally and physically. we observed that piglets of seven days of age had the worst difficulty in adapting. This study was later used in a controlled experiment in later studies. In the second study we analyzed the effect of environmental enrichment on two distinct age groups one and four days, in only one period of observation of two hours immediately after adoption. In general, we observed that the piglets of four days of age kept themselves isolated lesser time and that the aggressive piglets behaviour diminished considerably, with fewer aggressions and for shorter durations. However this type of aggression did not exist in the piglets of one day. In both ages, the sucking attempt between nursing happened for a lesser number of times and play was frequent and longer. Therefore, the use of environmental enrichment could benefit the behavior of piglets in adoption, accelerating the process of adjustment. In the third study we aimed to establish whether the time of the day adoptions took place affected the piglets of one and four days of age, in period of observation of just two hours. The adoptions that took place in the evening and were subsequently compared to adoptions that were carried out in the first study in the morning. Overall piglets of four days of age presented behavior of reduced self isolation, prolonged rest with their litter receptora and less frequent sucking times and for shorter times between periods of nursing. On the other hand, aggression in both ages lasted for a short time and aggression directed towards the receptor litter decreased. , the percentage of piglet aggressors from the four days group decreased, whereas the play behaviour of the one day piglets was very frequent and prolonged. The investigation demostrated adoptions conducted in the evening helped reduce frustration in adopted piglets. In the last study we considered the effect of the spatial location of the biological mother in the behavior of the adopted piglets. We observed decreased self isolation, latency sucking between nursings, simultaneously attempts to escape and vocalizations declined. The aggression in the piglets of one day did not exist, whereas in those of four days lasted a short time. On the basis of these results we suggest that adoptions should be carried out in isolation from the birth family stimuli which helps in decreasing negative emotions in the piglets.
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Biodisponibilidad, metabolismo y actividad cardioprotectora del resveratrol de la dieta en el cerdo: estudios metabólicos y moleculares / María Azorín Ortuño; directores, Carlos Espín de Gea, María Teresa García Conesa, María del Mar Larrosa Pérez.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento Biología Celular e Histología,, 2011) Azorín Ortuño, María
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Calidad de la grasa obtenida a partir de cerdos magros
(Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de publicaciones, 2000) Bañón, S.; Granados Fuentes, María Victoria; Cayuela, J. M.; Gil, M. D.; Costa, E.; Garrido Fernández, María Dolores; Facultad de Veterinaria
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Cambios vasculares en la trompa uterina asociados a los ciclos estral y reproductivo de la cerda
(2016-12-20) Gutiérrez Trujillo, Hugo Andrés; Latorre Reviriego, Rafael Manuel; López Albors, Octavio Miguel; Escuela Internacional de Doctorado
En las investigaciones previas sobre la vascularización de la trompa uterina de la especie porcina apenas se ha caracterizado detalladamente el aporte arterial y venoso a sus diferentes porciones, a lo que se suma la inexistencia de trabajos donde se analicen posibles cambios en función del estado reproductivo de la cerda. La demostración de tales cambios permitiría una mejor comprensión de aspectos funcionales de la trompa uterina de la cerda hasta ahora poco definidos. Entre ellos, la caracterización del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) al regular los procesos de angiogénesis asociada al ciclo sexual podría ser relevante para valorar la relación entre el aporte sanguíneo a la trompa uterina, su capacidad secretora de fluido y la motilidad. En el capítulo 1 se ha descrito el patrón de distribución arterial y venoso, así como posibles variaciones asociadas al estado reproductivo de las hembras (prepúber, nulípara, multípara y gestante). Se utilizaron técnicas de inyección, corrosión y disección en tractos reproductores obtenidos del matadero. De forma general, se observó que el infundíbulo y la ampolla proximal reciben ramas arteriales procedentes principalmente de la rama tubárica de la arteria ovárica. La sangre venosa de esta zona desembocó en la vena ovárica mediante una rama tubárica proximal. En relación a la parte distal de la trompa uterina destacó una importante red de anastomosis en el mesosalpinx formada principalmente a partir de la rama tubárica de la arteria uterina, excepto en hembras gestantes donde la rama predominante fue la rama uterina de la arteria ovárica. El retorno venoso de esta parte se concretó en una rama tubárica distal, que excepto en cerdas gestantes terminó en la vena ovárica. En conclusión, fue posible reconocer un patrón arteriovenoso general en la trompa uterina porcina, así como identificar variaciones, principalmente arteriales, relacionadas con el estado reproductivo de las hembras. El capítulo 2 tuvo como objetivo la caracterización de la vascularización regional de la trompa uterina de la cerda para determinar si el número de arteriolas terminales que suplen al istmo y la ampolla están influenciadas por la madurez reproductiva y el estado del ciclo estral. El número total de arteriolas terminales apenas se modificó entre cerdas prepúberes y maduras, así como entre las diferentes etapas reproductivas. Por el contrario, tanto en cerdas prepúberes como maduras hubo mayor densidad de arteriolas en el istmo que en la ampolla. Se concluyó que el patrón arterial terminal que suple el oviducto porcino está establecido desde antes de iniciarse la pubertad y apenas se modifica durante la edad reproductiva de la cerda. En el capítulo 3 se ha caracterizado la inmunolocalización de VEGFA y sus receptores Flt-1 y KDR en la trompa uterina de cerdas adultas en fase folicular temprana (FTem), folicular tardía (Ftar), luteal temprana (LTem) y luteal tardía (LTar). Tanto VEFGA como Flt-1 y KDR presentaron una presencia continua en el tejido tubárico a lo largo del ciclo estral, aunque con cambios significativos en el nivel de expresión según la región de la trompa, la fase del ciclo estral y la túnica histológica. VEGFA mostró una mayor presencia global en la ampolla que en el istmo. Las fases Ltem y Ltar determinaron una disminución progresiva de la presencia de VEGFA y Flt-1 en el istmo, mientras que KDR aumentó justo antes de la ovulación. El sistema VEGF mostró máxima presencia en el epitelio, tanto en las células secretoras como ciliadas. Nuestros resultados son compatibles con una participación del sistema VEGF en la regulación de la secreción de fluido oviductal y de la motilidad. Of the previous works focused on the vascularization of the porcine oviduct very few have thoroughly described its arterial and venous supply, while no previous literature has investigated potential vascular changes with regards to different reproductive stages. This topic is of great interest to better understand still poorly understood functional characteristics of the porcine oviduct such as the secretion of fluid and the motility. The characterization of the expression of the vascular endothelial growth factor (VEGF), which is involved in the regulation of the angiogenesis described in the female reproductive organs, might be relevant to understand those oviductal characteristics. In chapter 1 the arterial and venous patterns of the uterine tube were thoroughly evaluated in vascular casts from pre-pubertal, nulliparous multiparous and pregnant reproductive apparatus obtained from local slaughterhouses. A tubal branch arising from the ovarian artery supplied both the infundibulum and proximal ampulla. Their venous blood was drained by a proximal tubal branch that terminated in the ovarian vein. A conspicuous net of anastomosis of the mesosalpinx supplied the distal part of the uterine tube. The main artery supplying that net was the tubal branch of the uterine artery, except in pregnant sows where it was the uterine branch of the ovarian artery. The blood from the distal part of the oviduct was drained by a distal tubal branch which ended in the ovarian vein, except in pregnant sows that ended in the uterine vein. Summing up, the arterial and venous patterns of the different portions of the porcine oviduct as well as some variations associated to the reproductive status were characterized. In chapter 2 the terminal vascularization supplying the uterine tube was quantified so as to evaluate potential changes due to the reproductive maturity of the females or the phase of the estrous cycle. The total number of terminal arterioles (NTA) hardly changed in pre-pubertal and mature sows, as well as along the estrous cycle. Contrastingly, the density of arterioles was always higher in the isthmus than in the ampulla. It was concluded that the pattern of terminal arterioles supplying the oviduct is established earlier than the puberty and hardly changes throughout the reproductive life. In chapter 3 the immunohistochemical expression of VEGFA and its receptors Flt-1 and KDR was characterized in oviducts from sows at different phases of the estrous cycle. The three components of the VEGF system showed a continuous presence in the oviduct tissue, although significant changes depending on the oviduct portion, the estrous cycle and the histological layer were observed. VEGFA showed maximum presence in the ampulla. During the postovulatory luteal phases of the cycle VEGFA and Flt-1 decreased significantly in the isthmus, while KDR peaked just before ovulation. The VEGF system was mainly located in both the secretory and ciliated cells of the oviduct epithelium. Our results were consistent with a participation of VEFG in the regulation of the secretion of oviductal fluid and the motility.
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Caracterización de las glicosidasas en el espermatozoide y su papel en la fecundación, con especial énfasis en la especie porcina
(Universidad de Murcia, 2012-02-07) Ondiz Sánchez, Aitor Domeka de; Ruiz López, Salvador; Avilés Sánchez, Manuel; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Fisiología
En las especies bovina y porcina se ha comunicado la presencia de glicosidasas ligadas a los espermatozoides (Hayashi et al., 2004). Otros autores han propuesto diferentes glicosidasas espermáticas que interactúan con carbohidratos específicos en la ZP en otras especies animales incluyendo al hombre (Tulsiani et al., 1989, 1990; Avilés et al., 1996; Song et al., 2000; Venditti et al., 2007, 2010).En el presente trabajo se llevó a cabo un estudio de las principales glicosidasas espermáticas para establecer su ubicación en el espermatozoide, el origen de su síntesis, la expresión génica y mediante FIV porcina valorar el papel de aquellas glicosidasas con mayor actividad enzimática (AE) en el reconocimiento de gametos, fecundación y desarrollo embrionario temprano. In bovine and porcine species, the presence of sperm bound glycosidases has been reported (Hayashi et al., 2004). Others studies have proposed different sperm glycosidases that interact with specific ZP carbohydrates in other species, including men (Tulsiani et al., 1989, 1990; Avilés et al., 1996; Song et al., 2000; Venditti et al., 2007, 2010). In the present work, the major sperm glycosidases were studied to establish their localization in the spermatozoon, the origin of their synthesis, their gene expression and through porcine IVF; we sought to define the role of the glycosidases with greater activity during gamete interaction, fertilization and early embryo development.
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Caracterización genética de la raza chato murciano
(2012-09-17) Herrero Medrano, Juan Manuel.; Ramis Vidal, Manuel Guillermo; Muñoz Luna, Antonio; Crooijman, Richard; Facultad de Veterinaria
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Clamidiosis porcina: estudio preliminar en la Región de Murcia
(Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1996) Buendía Marín, Antonio Julián; Salinas Lorente, Jesús; Cano, L. D.; Cuello Gijón, Francisco; Buendía Marín, Antonio Julián; Facultad de Veterinaria
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Criopreservación espermática en la especie porcina : optimización de la técnica
(2014-06-04) Martínez Alborcia, María José; Roca Aleu, Jorge; Parrilla Riera, Inmaculada; Facultad de Veterinaria
La inseminación artificial (IA) es una biotecnología ampliamente utilizada en la industria porcina, jugando un papel fundamental en la mejora de la productividad. Idealmente, los programas de IA en porcino, deberían utilizar espermatozoides congelados-descongelados dadas las ventajas adicionales que poseen en comparación con el semen refrigerado, en particular las relacionadas a la bioseguridad y comercio internacional. Sin embargo, los espermatozoides congelados-descongelados se utilizan con poca frecuencia en los programas de IA porcina comerciales debido a su menor eficiencia con respecto al semen refrigerado, ya que se requieren más espermatozoides por dosis de IA alcanzando por lo general peores resultados de fertilidad. La razón biológica de este hecho está relacionada con la gran sensibilidad de los espermatozoides porcinos a la criopreservación. Además, los espermatozoides que sobreviven a dicho proceso, poseen una vida funcional más corta. El principal objetivo de esta Tesis es el de optimizar el protocolo de criopreservación de espermatozoides de porcino con el fin de mejorar la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación. Para ello, se han desarrollado los siguientes estudios. En el primer estudio, se evaluó el impacto de los espermatozoides no funcionales presentes en los eyaculados de porcino sobre la capacidad de los espermatozoides funcionales para soportar el proceso de criopreservación. Para ello, se congelaron 15 fracciones ricas (FR) de 5 machos fértiles con diferentes proporciones de espermatozoides no funcionales (0- muestra de semen nativa, 25, 50 y 75 %). Tras la descongelación, se evaluaron los espermatozoides mótiles y viables que se recuperaron, así como la funcionalidad espermática en términos de fluidez de membrana de plasmática y producción intracelular de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS) en condiciones de capacitación in vitro. Además, se evaluó la peroxidación lipídica de la membrana plasmática mediante la medición indirecta de la producción de malondialdehído (MDA). Tanto la motilidad (evaluada mediante sistema CASA) como la viabilidad espermática normalizadas (evaluada mediante citometría de flujo y triple tinción de los espermatozoides con Hoechst 33342, H-42; yoduro de propidio, PI, y aglutinina de cacahuete conjugado con fluoresceína, PNA-FITC) fueron menores (p<0’01) cuanta mayor proporción de espermatozoides no funcionales había en las muestras seminales antes de la congelación, independientemente del verraco. Sin embargo, la magnitud del efecto fue diferente (p<0’01) entre los verracos. Las muestras de semen con la mayor subpoblación de espermatozoides no funcionales antes de la congelación mostraron los mayores (p<0’01) niveles de MDA tras la descongelación. En cuanto a la funcionalidad de los espermatozoides supervivientes a la descongelación, la muestra con 75 % de espermatozoides no funcionales antes de la congelación tuvo una generación intracelular de ROS (evaluada con 5-(y-6) clorometil-20,70-dichlorodihydrofluorescein éster acetil diacetato; CM-H2DCFDA) más alta (p<0’01) y un aumento (p<0’01) de la fluidez de la membrana espermática (Merocianina 540, M540) con respecto a la muestra control. El objetivo del segundo estudio fue determinar si los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen antes y durante la congelación influyen en la capacidad de fertilización in vitro (FIV) de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. Usando el mismo diseño experimental que en el estudio anterior, se prepararon y criopreservaron 4 muestras de semen procedentes de 15 FR con las mismas proporciones de espermatozoides no funcionales. Tras la descongelación, las muestras seminales fueron centrifugadas con PorciPureTM. La concentración (evaluada usando un Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) y viabilidad espermática (evaluada del mismo modo que en el estudio anterior) de cada pellet de espermatozoides fueron evaluadas para calcular la cantidad de espermatozoides viables totales en cada muestra de semen tras la centrifugación. La funcionalidad de los espermatozoides, en términos de generación intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear (Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), se evaluó antes y después de la centrifugación con el gradiente de PorciPureTM en condiciones de capacitación in vitro. La capacidad de FIV espermatozoides supervivientes al proceso de criopreservación se evaluó se evaluó de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma) y del desarrollo embrionario. Un total de 1.041 ovocitos madurados in vitro fueron inseminados utilizando un número fijo de espermatozoides viables purificados con PorciPureTM (ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1), independientemente de los diferentes porcentajes de espermatozoides no funcionales de las muestras. El desarrollo embrionario se evaluó a los 2 y 7 días después de la inseminación mediante la tasa de división (porcentaje de ovocitos divididos a 2-4 células/total cigotos putativos cultivados) y la formación de blastocistos (porcentaje de blastocistos/total cigotos putativos cultivados), respectivamente. El número total de células de los blastocistos resultantes se evaluó por tinción de los blastocistos con H-42. Los resultados revelaron que una alta proporción de espermatozoides no funcionales en muestras de semen antes y durante la congelación inducen un aumento (p <0’001) de la generación de intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear en espermatozoides congelados-descongelados. Estos cambios funcionales resultaron en bajas proporciones (p <0’01) de ovocitos penetrados y embriones desarrollados in vitro. En el tercer estudio, se evaluó la eficacia de la selección de espermatozoides usando un gradiente de centrifugación de una sola capa (Single Layer Centrifugation; SLC) antes de la congelación sobre la supervivencia espermática. Para ello, 24 FR recogidas de 24 verracos, se dividieron en 2 grupos en función de sus características seminales iniciales (concentración, morfología, motilidad y viabilidad espermática): estándar (n = 15) y sub-estándar (n = 9). Las muestras seminales de cada FR se dividieron en 2 alícuotas, una permaneció sin tratar (muestras control) y la otra se centrifugó con el gradiente de una sola capa (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 mL de Androcoll-P-Large® (muestras SLC). El rendimiento de espermatozoides totales, motiles (evaluados mediante CASA) y viables (evaluados mediante citometría como se mencionó anteriormente) después de SLC fue mayor (p<0’05) en las muestras estándar que en las sub-estándar. Las muestras de semen fueron criopreservadas. Tras la descongelación, la motilidad y viabilidad espermáticas fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control, independientemente de las características iniciales eyaculado. Además, los espermatozoides descongelados de las muestras SLC fueron más resistentes (p<0’05) a la peroxidación lipídica (Bioxytech MDA - 586 Kit de ensayo) que los de las muestras de control. El tratamiento con SLC también influyó en la funcionalidad de los espermatozoides descongelados bajo condiciones de capacitación in vitro. El porcentaje de espermatozoides viables que mostraron alta fluidez de membrana fue menor (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control. Los espermatozoides descongelados de las muestras SLC generaron menor (p<0’05) cantidad de ROS que los de las muestras control en los eyaculados sub-estándar. El objetivo del cuarto estudio experimental fue el de evaluar la idoneidad y eficacia de SLC, empleando el coloide Androcoll-P-XL®, como un procedimiento de rutina para la selección de los espermatozoides funcionales de los eyaculados de porcino para la criopreservación. Trece FR (una por verraco) se dividieron en tres alícuotas. Dos alícuotas de 15 y 150 mL se centrifugaron (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 y 150 mL (v/v) de Androcoll-P-Large® y Androcoll-P-XL®, respectivamente. La tercera alícuota se mantuvo sin procesa (control). Tras la centrifugación, los porcentajes de espermatozoides morfológicamente normales y con motilidad rápida y progresiva (CASA) fueron mayores (p<0’01) tras en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll -P® utilizado. Sin embargo, el porcentaje de espermatozoides con ADN nuclear fragmentado fue menor (p<0’01) en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll-P® utilizado. Las tasas de recuperación de espermatozoides totales, mótiles, viables y morfológicamente normales oscilaron entre el 20 y 100 %, mientras que los porcentajes de espermatozoides con ADN nuclear intacto oscilaron entre el 60 y 100 %, con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la SLC, las muestras espermáticas fueron criopreservadas. Tras la descongelación, los porcentajes de espermatozoides mótiles, viables y con ADN nuclear intacto, fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en el control con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la descongelación, se inseminaron 679 ovocitos madurados in vitro con un ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1. La SLC también mejoró (p<0’01) la capacidad de FIV de los espermatozoides congelados-descongelados, evaluada de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma). Sin embargo, no hubo ningún efecto de SLC sobre capacidad in vitro de los cigotos putativos para desarrollar a blastocistos. Tras todo lo anteriormente expuesto, podemos concluir que: Los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen de porcino antes de la congelación influyen negativamente en la congelabilidad de los espermatozoides funcionales. Lo cual se evidencia por una reducción en la proporción de espermatozoides funcionales recuperados tras la descongelación y por una menor capacidad fecundante y habilidad para desarrollar embriones in vitro por los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. La selección espermática mediante el gradiente de centrifugación de una sola capa Androcoll-P® utilizado antes de la congelación, mejora la congelabilidad espermática y la capacidad fecundante de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. Artificial insemination (AI) is extensively used by swine producers worldwide, playing a pivotal role in the improvement of herd productivity. Ideally, swine AI-programs should use frozen-thawed (FT) sperm, given its additional advantages compared to liquid-stored semen, particularly those concerning international trade and biosecurity. However, FT-sperm are infrequently used in commercial swine AI programs because of their lower efficiency with respect to liquid-stored semen; more FT-spermatozoa are required per AI dose to achieve typically lower fertility outcomes. The biological reason for the large number of spermatozoa required per AI dose is related to the high cryosensitivity of boar spermatozoa. In addition, the spermatozoa that survive the cryopreservation process exhibit an impaired and shortened functional lifespan. Therefore, this thesis was designed to optimize the boar sperm cryopreservation protocol in order to improve the sperm survival after thawing. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the impact of non-functional spermatozoa on the cryopreservation success of functional spermatozoa was assessed. Fifteen sperm-rich ejaculate fractions (SREF) collected from 5 fertile boars were frozen (following a standard 0.5-mL straw freezing protocol) with different proportions of induced non-functional sperm (0-native semen sample-, 25, 50 and 75% non-functional spermatozoa). After thawing, the recovery of motile and viable spermatozoa was assessed, and the functional of the spermatozoa was evaluated from plasma membrane fluidity and intracellular reactive oxygen species (ROS) generation upon exposure to capacitation conditions. In addition, the lipid peroxidation of the plasma membrane was assessed by the indirect measurement of malondialdehyde (MDA) generation. The normalized (with respect to a native semen sample) sperm motility (assessed by CASA) and viability (cytometrically assessed after staining with Hoechst 33342, H-42; propidium iodide, PI; and fluorescein-conjugated peanut agglutinin, PNA-FITC) decreased (p<0.01) as the proportion of functional spermatozoa in the semen samples before freezing decreased, irrespective of the semen donor. However, the magnitude of the effect differed (p<0.01) among boars. Moreover, semen samples with the largest non-functional sperm subpopulation before freezing showed the highest (p<0.01) levels of MDA after thawing. The thawed viable spermatozoa of semen samples with a high proportion of non-functional spermatozoa before freezing were also functionally different from those of samples with a low proportion of non-functional spermatozoa. These differences consisted of higher (p<0.01) levels of intracellular ROS generation (assessed with 5-(and-6) chloromethyl-20,70-dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester; CM-H2DCFDA) and increased (p<0.01) membrane fluidity (assessed with Merocyanine 540, M540). The objective of the second study was to evaluate the impact of non-functional spermatozoa on the in vitro fertilization (IVF) ability of FT-spermatozoa. Using the same experimental approach as the previous study, 4 sperm semen samples from 15 SREF with the same different proportions of induced non-functional sperm were also prepared and cryopreserved following the protocol indicated above. After thawing, the semen samples were centrifuged with PorciPureTM Bottom Layer. The sperm concentration (measured using a Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) and viability (as indicated in the previous study) of each sperm pellet were assessed to calculate the total viable sperm count in each semen sample. The functionality of the spermatozoa, in terms of intracellular ROS generation and nuclear DNA fragmentation (sperm chromatin dispersion test; Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), was assessed before and after the PorciPureTM centrifugation gradient in sperm samples incubated under capacitating conditions. The IVF ability of cryosurviving spermatozoa was assessed according to oocyte fertilisation (2 pronuclei and a sperm tail inside of the ooplasm) and embryo development. A total of 1,041 in vitro-matured oocytes were inseminated using a fixed number of PorciPureTM-purified viable spermatozoa (viable sperm: oocyte ratio of 300:1), regardless of the differing percentages among the 4 semen samples (native, 25 %, 50 %, and 75 % non-functional spermatozoa). Embryo development was evaluated at 2 and 7 days after insemination by the assessment of the cleavage rate (percentage of oocytes divided to 2–4 cells/total putative zygotes cultivated) and blastocyst formation (percentage of blastocyst/total putative zygotes cultivated), respectively. The total cell number of the resulting blastocysts was evaluated by staining the blastocysts with H-42. The results revealed that high proportions of dead spermatozoa in raw semen samples before and during freezing induce (p<0.001) increased ROS generation and nuclear DNA fragmentation in frozen-thawed spermatozoa. These dysfunctional changes resulted in low ratios (p<0.01) of in vitro penetrated oocytes and healthy developing embryos. The effectiveness of sperm selection using single-layer centrifugation (SLC) prior to freezing on the sperm cryosurvival of boar ejaculates was evaluated in the third study. Twenty-four SREF, collected from 24 boars, were divided into 2 groups according to their initial semen traits: standard (n=15) and substandard (n=9). Semen samples from each SREF were split in 2 aliquots, one remained untreated (control samples) and the other was single-layer centrifuged (500 g for 20 min) using 15 mL of Androcoll-P-Large® (SLC-samples). The yield of total, motile (assessed by CASA) and viable (cytometrically evaluated as mentioned above) sperm after SLC was higher (p<0.05) in standard than substandard semen samples. The semen samples were cryopreserved using a standard 0.5-mL straw freezing protocol. Post-thaw sperm motility and viability were higher (p<0.05) in SLC than in control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Additionally, thawed spermatozoa from SLC samples were more resistant (p<0.05) to lipid peroxidation (BIOXYTECH MDA-586 Assay Kit) than those from control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. The SLC-treatment also influenced the functionality of thawed spermatozoa undergoing an in vitro capacitation process. The percentage of viable sperm showing high membrane fluidity (assessed with M540) was lower (p<0.05) in the SLC than in the control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Thawed viable spermatozoa of SLC samples generated less (p<0.05) reactive oxygen species (assessed with CM-H2DCFDA) than those of control samples in the substandard ejaculates. The objective of the fourth experimental study was to evaluate the suitability and effectiveness of SLC as a routine procedure for selecting boar spermatozoa for cryopreservation. Thirteen sperm rich ejaculate fractions (one per boar) were split into three aliquots. Two aliquots of 15 and 150 mL were SLC-processed (500 g for 20 min) using 15 and 150 mL (v/v) of Androcoll-P-Large® and Androcoll-P-XL®, respectively. The third aliquot remained un-processed as a control. The percentages of spermatozoa that were morphologically normal and showed rapid and progressive motility (assessed by CASA) spermatozoa were higher (p<0.01) and those with fragmented nuclear DNA were lower (p<0.01) after SLC than control semen samples, regardless of the Androcoll-P® used. The recovery rates of total, motile, viable (flow cytometric evaluated after staining with H-42, PI and FITC-PNA) and morphologically normal spermatozoa ranged between 20 and 100% and those with intact nuclear DNA ranged between 60 and 100%, irrespective of the Androcoll-P® used. Thereafter, the semen samples were cryopreserved as mentioned above. Post-thaw percentages of sperm motility, viability and intact nuclear DNA were higher (p<0.05) in SLC-processed than in control semen samples, irrespective of the Androcoll-P® used. SLC-processing also improved (p<0’01) the IVF ability of FT-sperm (679 in vitro matured oocytes inseminated with a viable sperm:oocyte ratio of 300:1 following the same procedure mentioned above), measured as the percentage of penetrated oocytes and the mean number of swollen sperm heads and/or male pronuclei in penetrated oocytes. However, there was no effect of SLC-processing on the in vitro ability of putative zygotes to develop to blastocysts. The results achieved in these four experimental studies have generated the following conclusions: Non-functional spermatozoa present in boar semen samples before freezing negatively influence the cryopreservation of functional spermatozoa by reducing the proportion of recovered surviving spermatozoa after thawing and also by altering the functional and fertilisation ability of the sperm that survive the cryopreservation process. Single Layer Centrifugation prior to freezing improves the boar sperm cryopreservation and post-thaw fertilisation ability of cryosurvival spermatozoa. However, further studies aimed at optimising the yield of SLC procedure are needed.
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Definición del objetivo económico y de selección en la explotación convencional de ganado porcino, estudio a nivel de granja y control de calidad de la canal y de la carne en dos genotipos comerciales / Emilio María Dolores Pedrero ; director Antonio Muñoz Luna.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Veterinaria,, 1993) Dolores Pedrero, Emilio María
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Desarrollo de métodos simples y rápidos para la purificación de haptoglobina , proteína C-Reactiva y ceruloplasmina en el ganado porcino :tesina /presentada por Pablo Fuentes Pardo.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Veterinaria, Departamento de Medicina y Cirugía Animal,, 2006) Fuentes Pardo, Pablo
Open Access
Desarrollo de modelizaciones nutricionales en cerdas reproductoras TN 70 (Topigs Norsvin), recría externa y alimentación convencional para la producción de cerdo convencional con el cruce con Pietrain
(Universidad de Murcia, 2025-03-18) López Moya, José Antonio; Muñoz Luna, Antonio; Ramis Vidal, Guillermo; Escuela Internacional de Doctorado
La selección genética ha mejorado la prolificidad de las cerdas, lo que se refleja en un aumento en el tamaño de la camada, y la nutrición adecuada de las primerizas y las cerdas ha cambiado simultáneamente debido a la mejora de la productividad. Debido a esta intensa selección genética, se ha producido una disminución muy notable de las reservas de grasa de las primerizas acompañada de cambios en el metabolismo basal de los cerdos. La mayoría de las recomendaciones de nutrientes se basan en investigaciones con cerdas que eran mucho menos prolíficas y productivas que las que se encuentran en las granjas actuales. Por tanto, las necesidades de nutrientes de las cerdas modernas son muy poco conocidas en comparación con nuestro conocimiento sobre los cerdos en crecimiento. Los cambios en el rendimiento de las cerdas han tenido efectos importantes en sus requerimientos nutricionales debido a la mayor prolificidad, producción de leche y mayor tamaño corporal que implica mayores requerimientos. Por lo tanto, los datos fundamentales que subyacen a los modelos actuales de alimentación de cerdas deben ser actualizados. Los modelos de simulación son herramientas utilizadas tanto en la investigación como en la industria para adaptar las recomendaciones de nutrientes a los objetivos de productividad de los animales y que nos ayudan a tomar decisiones sobre estrategias de alimentación en función de los costes de producción del pienso. Debemos afrontar varios problemas emergentes: sostenibilidad, impacto medioambiental, rentabilidad o bienestar animal. La combinación adecuada de un régimen alimentario y una formulación de dieta respetuosa con el medio ambiente a través de un enfoque nutricional será más eficaz para reducir la excreción de nutrientes en la producción porcina. En las primeras etapas de la gestación, el mayor requerimiento de aminoácidos es para el aumento del cuerpo materno, mientras que en las últimas etapas de la gestación es para el desarrollo del tejido fetal y mamario. Para el último tercio, se debe aumentar el consumo de alimento, especialmente para tener en cuenta las crecientes necesidades metabólicas durante la gestación, así como el aumento del tamaño de la camada, evitando sobrealimentar a las cerdas en esta fase. El objetivo de la modelización propuesta en este trabajo fue lograr nuevos programas nutricionales en cerdas gestantes y lactantes. Este estudio se llevó a cabo durante un período de 3 años. Se registro el peso corporal, el espesor de la grasa dorsal (EGD), la profundidad del lomo (PL), el peso de la camada y el consumo de alimento durante la gestación y la lactancia. El EGD y la PL se midieron mediante ecografía en el momento de la cubrición, el parto y el destete. De la misma manera, 74 primerizas fueron monitorizadas desde el destete hasta la primera cubrición durante su fase de recría. Las hembras fueron alimentadas una vez al día durante la gestación y dos veces durante la lactación. El modelo descrito por Dourmad et al. (1999, 2008) sirvió de base para el modelo de gestación. Para el modelo de lactación también se utilizó el modelo descrito por Dourmad et al. (2008) y contrastado con el de Hansen. Es vital tener en cuenta cómo las cerdas utilizan los nutrientes para la reproducción. Por tanto, estrategias de alimentación adecuadas permiten una mejor nutrición y una menor excreción de nutrientes. Los aportes nutricionales deben adaptarse para mantener las reservas corporales en óptimas condiciones durante toda su vida productiva y, así, optimizar su desempeño reproductivo, lo que requiere un ajuste preciso del nivel de alimentación, de la composición nutricional del alimento, de las condiciones ambientales y de alojamiento, etc. ya que inciden directamente en el aprovechamiento de los nutrientes y su consumo voluntario.