DigitalUM :: Browsing by Subject "Células"

Browsing by Subject "Células"

Now showing 1 - 10 of 10

Open Access
Análisis de la expresión y función del inhibidor de antizimas 2 (AZIN2) en ratones transgénicos : estudio de nuevos ortólogos y parálogos de AZIN2
(2016-11-29) Lambertos Escudero, Ana; Peñafiel García, Rafael; Facultad de Medicina
BACKGROUND AND AIMS Polyamines are ubiquitous organic cations that play multiple essential roles in mammalian physiology. Ornithine decarboxylase (ODC) is the rate limiting enzyme in polyamine biosynthesis and it is regulated by antizymes, a family of small proteins whose synthesis is stimulated by high polyamine levels. AZs bind to ODC inhibiting its enzymatic activity and target it for degradation by the 26S proteasome. AZs are themselves regulated by another ODC-related family named antizyme inhibitors (AZINs), consisting of two members: AZIN1 and AZIN2. These proteins lack enzymatic activity but they bind to AZs with higher affinity than ODC, counteracting the effects of antizymes on ODC. AZIN1 is a ubiquitous protein that participates in the regulation of polyamine metabolism and cell growth and its disruption in mice causes death soon after birth. AZIN2 is mainly expressed in brain and testis, followed by other secretory tissues and cells. Although the physiological role of AZIN2 is mostly unknown, some data suggests that it is involved in cell growth, vesicular trafficking, secretion and spermiogenesis. In order to study the expression pattern of AZIN2 and its physiological role in mouse, AZIN2 KO mice were generated by the insertion of a beta geo cassette, resulting in a fused protein formed by the N-terminus extreme of AZIN2 and the reporter enzyme β-galactosidase. On the other hand, advances in genome sequencing revealed the existence of many orthologous of Azin2, and a new paralogue of Azin2 in mouse, named Gm853, whose study by transient transfected cells is a main aim of the present work. RESULTS AND CONCLUSIONS 1. Expression of the reporter gene lacZ in tissues of mice lacking Azin2. AZIN2 KO generated mice provide qualitative and quantitative information about the expression and function of AZIN2. Hystochemical and biochemical analysis of the reporter β-galactosidase activity in different tissues of AZIN2 KO mice confirmed significant expression of AZIN2 in epidydymis, adrenal glands, pancreas, heart, lung and eyes, in addition to testis and brain, pointing to secretory regions. However, none of the KO tissues examined showed significantly variation in polyamine content. Finally, the microarray analysis of gene differential expression between WT and KO mice did not show common changes, except the marked reduction of Azin2 expression. 2. The role of AZIN2 in male reproductive system. Hystological sections from testis and epididymis of AZIN2 KO and WT mice showed that AZIN2 was mainly expressed in haploid cells but also in Leydig cells, suggesting that AZIN2 is required not only for the synthesis but also for the function of mature sperm cells. Besides, the sperm motility test revealed that most AZIN2 KO sperm cells were not able to move across the test medium. However, this deficiency in motor skills did not have major consequences in male fertility, as AZIN2 KO mice demonstrated to be as fertile as their WT counterparts. Finally, the deprivation of AZIN2 in male reproductive system was also associated to decreased biosynthesis and secretion of testosterone. 3. Expression and function of AZIN2 in other secretory cells and tissues. Phenotypic analysis of AZIN2 KO mice. The role of AZIN2 in murine physiology was analysed in other secretory cells and tissues apart from testis by comparing the gain or the loss of functions in AZIN2 KO mice. In brain, AZIN2 prevails in the cerebellum and hippocampus areas and its disruption in these areas correlates with a deficient motor function in mice. The expression of AZIN2 in adrenal glands and pancreas was restricted to the adrenal medulla and to Langerhans islets, respectively. In other tissues such as heart, eyes, lung and kidney, the expression of AZIN2 was also restricted to specific types of cells. In pancreas, the absence of AZIN2 generates a slight hyperglycemia associated to impaired synthesis and secretion of insulin from β cells. 4. Structural and functional properties of Xenopus Azin2. Studies about ODC in Xenopus reveal the existence of two homologous proteins named XODC1 and XODC2, with different spatial and temporary patterns of expression. XODC2 appears on gene databases as XAZIN2, thus, it is considered an orthologous of mAZIN2 and hAZIN2. Unlike mAZIN2, the orthologous of AZIN2 in Xenopus laevis (xlAZIN2) is degraded by AZ1 and possesses decarboxylase activity of ornithine and lysine, showing higher affinity for lysine than for ornithine. The comparative analysis of xlAZIN2 with mODC and mAZIN2 revealed additional similarities with mODC, based on the cytosolic subcellular localization and the ability to form aggregates such as homotetramers. Similarly to mODC, xlAZIN2 stimulates agmatine uptake, decreases that of putrescine and spermidine and presents a short half-life, lower than 30 minutes. 5. Study of mouse Gm853, a new paralogue of Odc and Azin2. Comparative analysis of protein sequences from ODC paralogues revealed GM853 as a new homologue protein of ODC and AZINs in mouse, presenting all conserved residues for enzymatic activity. Experiments with transfected cells demonstrated that GM853 is not an antizyme inhibitor as it does not prevent the interaction between ODC and AZ1. Otherwise, it is a very stable protein mainly located in the cytosol and it is able to form homodimers and homotetramers but no heterodimers with other paralogues. Besides, GM853 presents enzymatic activity, being the first decarboxylase for L-Leucine described in mammals. The expression of GM853 in mice is restricted to renal tissue with higher representation in male kidneys, related to increased levels of testosterone. The product of Leucine decarboxylation is the isopenthylamine and it is rapidly excreted with urine. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS Las poliaminas son cationes orgánicos presentes en todas las células con funciones esenciales en la fisiología de todos los mamíferos. Ornitina descarboxilasa (ODC) es la enzima limitante en la biosíntesis de poliaminas y está regulada por los antizimas (AZs), una familia de pequeñas proteínas cuya síntesis es estimulada por las propias poliaminas. Los AZs se unen a ODC inhibiendo su actividad enzimática y la conducen al proteasoma 26S para su degradación. Los AZs son a su vez regulados por otra familia de proteínas relacionadas con ODC, denominadas inhibidores de antizimas (AZINs), formada por dos miembros: AZIN1 y AZIN2. Estas proteínas carecen de actividad enzimática pero se unen a los AZs con más afinidad que ODC, contrarrestando los efectos de los antizimas sobre ODC. AZIN1 es una proteína ubicua que participa en la regulación del metabolismo de poliaminas y el crecimiento celular y su abatimiento en ratones causa la muerte poco después de nacer. AZIN2 se expresa fundamentalmente en cerebro y testículos, además de otros tejidos y células secretoras. Aunque el papel fisiológico de AZIN2 no se conoce con certeza, algunos experimentos sugieren que está implicado en el crecimiento celular, el tráfico vesicular, secreción y espermatogénesis. Con el fin de estudiar el patrón de expresión de AZIN2 y su implicación fisiológica en ratón, se generaron ratones KO de AZIN2 mediante la inserción de un cassette beta geo, que dio lugar a una proteína recombinante formada por el extremo N-terminal de AZIN2 y la enzima reportera β-galactosidasa. Por otro lado, los avances en el ámbito de la secuenciación de genomas, han revelado la existencia de un gran número de ortólogos de Azin2, así como un nuevo parálogo de Azin2 en ratón, denominado Gm853, cuyo estudio mediante células transfectadas también es objeto de esta tesis doctoral. RESULTADOS Y CONCLUSIONES 1. Expresión del gen reportero lacZ en tejidos de ratones con abatimiento de Azin2. El modelo de ratón transgénico con abatimiento del gen Azin2 generado, permitía el estudio de la expresión y posible función de la proteína AZIN2. El análisis histoquímico y bioquímico de la actividad β-galactosidasa en tejidos de ratones KO de AZIN2 confirmó la expresión de AZIN2 en epidídimo, glándula adrenal, páncreas, corazón, pulmón y ojos, aparte de testículo y cerebro, apuntando a células secretoras. Sin embargo, en ninguno de los tejidos estudiados en ratones deficientes en AZIN2 se observó reducción significativa de los niveles tisulares de poliaminas. Finalmente, el estudio comparativo de la expresión de genes entre ratones WT y KO mediante microarrays, no mostró cambios comunes en todos ellos salvo la marcada reducción de la expresión de Azin2. 2. The role of AZIN2 in male reproductive system. El análisis histoquímico de secciones de testículos y epidídimos WT y KO de AZIN2 mostró que AZIN2 se expresa fundamentalmente en células haploides, pero también en las células de Leydig, sugiriendo su participación no solo enla síntesis sino también en la maduración de los espermatozoides. Además, el test de movilidad espermática mostró que la mayoría de los espermatozoides KO de AZIN2 no eran capaces de desplazarse en el medio de ensayo. Sin embargo, esta deficiencia en la motilidad no tuvo consecuencias en la fertilidad de los ratones machos, demostrando ser tan fértiles como los WT. Finalmente, el abatimiento de AZIN2 en el aparato reproductor masculino se asoció a una disminución en la biosíntesis y la secreción de testosterona. 3. Expresión y función de AZIN2 en otros tejidos y células secretoras. Análisis fenotípico de los ratones KO de AZIN2. El papel de AZIN2 en la fisiología murina en otros tejidos que expresan AZIN2 se analizó comparando los cambios sobre la función en ratones KO de AZIN. En el cerebro de ratón, AZIN2 predomina en el cerebelo y en el hipocampo y su disrrupción en estas áreas está relacionada con un una función motora deficiente. La expression de AZIN2 en la glándula adrenal y el páncreas se limitó a la médula adrenal y a los islotes de Langerhans, respectivamente. En otros tejidos como corazón, ojos, pulmón y riñón, la expression de AZIN2 se concentró en tipos de células específicas. En páncreas, la ausencia de AZIN2 genera una ligera hiperglucemia porque afecta a la síntesis y secreción de insulina por las células β. 4. Propiedades estructurales y funcionales de Azin2 de Xenopus. El estudio de ODC en Xenopus reveló la existencia de dos proteínas homólogas denominadas XODC1 y XODC2, con diferente patró de expresión espacial y temporal. XODC2 aparece en las bancos de genes como XAZIN2, siendo considerado un ortólogo de mAZIN2 y hAZIN2. Al contrario que AZIN2 de ratón, su ortólogo en Xenopus (xlAZIN2) es degradado por AZ1 y presenta actividad descarboxilasa de ornitina y lisina, con una afinidad superior por lisina que por ornitina. El análisis comparativo de xlAZIN2 con mODC y mAZIN2 mostró una mayor semejanza con mODC, basándose en su localización subcelular citosólica y en la capacidad de ambas proteínas para formar oligómeros. Además, al igual que mODC, xlAZIN2 presenta una vida media muy corta (inferior a 30 minutos) y estimula la captación de agmatina en detrimento de la de putrescina y espermidina. 5. Estudio de Gm853, un nuevo parálogo de Odc y Azin2 en ratón. El análisis comparativo de la secuencia proteica de los distintos parálogos de ODC reveló la existencia de GM853, una nueva proteína homóloga de ODC y AZINs en ratón, que conserva todos los residuos relacionados con la actividad catalítica. Estudios con células transfectadas demostraron que GM853 no es un inhibidor de antizimas, ya que no evita la interacción entre ODC y AZ1. En cambio, es una proteína estable localizada fundamentalmente en el citosol y es capaz de formar homodímeros y homotetrámeros pero no heterodímeros con otros parálogos. GM853 presenta actividad enzimática, siendo la primera proteína descrita en mamíferos con actividad descarboxilasa de leucina. En ratón, GM853 se encuentra en el riñón y su expresión depende de los niveles de testosterona, predominando en el riñón de ratones machos. El producto de la descarboxilación de la leucina es la isopentilamina, una amina que es rápidamente eliminada a través de la orina.
Open Access
Caracterización funcional de los receptores de TNF de pez cebra : Functional characterization of TNF receptors in cebrafish.
(2013-11-22) Espín Palazón, Raquel; Meseguer Peñalver, José; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Facultad de Biología
OBJETIVOS 1. Caracterización de los receptores de Tnf (Tnfr1 y Tnfr2) en la homeostasis vascular durante el desarrollo en pez cebra. 2. Caracterización de las rutas de señalización de Tnfr1 y Tnfr2 involucradas en el desarrollo de las células endoteliales y su homeostasis. 3. Caracterización del papel que juegan Tnfrs y sus ligandos (Tnfa y Lta) en la ola primitiva de hematopoyesis en el pez cebra. 4. Caracterización de los Tnfrs y sus ligandos (Tnfa y Lta) en la especificación y mantenimiento de las HSCs en el embrión de pez cebra. METODOLOGÍA Para la presente tesis doctoral, se ha utilizado el pez cebra (Danio rerio) como modelo de experimentación animal. Además, para la experimentación in vitro se han usado varias líneas celulares y técnicas de cultivo celulares. En cuanto a las técnicas de biología molecular, podemos destacar la microinyección en estadio de huevo de RNAm, morfolinos y DNA; RT-qPCR e hibridación in situ. También se han usado técnicas de microscopía tales como la microscopía confocal y de fluorescencia; técnicas inmunohistoquímicas y TUNEL para la detección de apoptosis; y técnicas de citometría y aislamiento físico de células mediante fluorescencia (FACS). RESULTADOS Durante la presente tesis doctoral, hemos caracterizado el papel que desempeñan el factor de necrosis tumoral (Tnfa) y sus receptores (receptores del factor de necrosis tumoral, Tnfrs) en el desarrollo de las células endoteliales y del sistema hematopoyético. Para ello hemos usado el pez cebra (Danio rerio), como modelo animal de vertebrados. Por un lado, nuestros resultados nos han llevado a concluir que la deficiencia en el gen de tnfr2 en embriones de pez cebra conlleva la inducción en células endoteliales de un programa apoptótico que depende de caspasa-8, caspasa-2 y P53, pero no caspasa-3. Además, la deficiencia simultánea de Tnfr1 o la activación de NF-ĸB, rescata la apoptosis de las células endoteliales, lo que indica que debe haber un equilibrio entre los dos receptores de Tnf para la correcta homeostasis vascular de este tipo celular. De forma similar, el Tnfa promueve la apoptosis de las células endoteliales humanas a través de Tnfr1, desencadenando la activación de caspasa-2 y P53. Por otro lado, en este trabajo demostramos que la señalización de Tnfa a través de Tnfr2 se necesita de forma intrínseca por las células madre hematopoyéticas (HSCs) para su mantenimiento y expansión. La deficiencia genética de Tnfa o Tnfr2, pero no de linfotoxina (Lta) o Tnfr1, conlleva la apoptosis de las HSCs cuando se especifican en el embrión. CONCLUSIONES 1. El silenciamiento génico dirigido contra Tnfr2 resulta en la inducción de un programa apoptótico dependiente de caspasa-8 en células endoteliales. Esta apoptosis se rescata mediante la eliminación de Tnfr1, lo que indica que se requiere un balance adecuado entre los Tnfrs para la integridad de las células endoteliales y la homeostasis vascular. 2. En las células endoteliales, el Tnfr1 señaliza apoptosis a través de la formación del complejo II y la consecuente activación de caspasa-8 y caspasa-2, mientras que Tnfr2 señaliza supervivencia mediante el comple I y la activación de NF-ĸB. 3. El programa apoptótico inducido por Tnfr1, en el cual participa caspasa-8, caspasa-2 y P53, se encuentra conservado evolutivamente en células endoteliales humanas. 4. La señalización de Tnfrs es dispensable para la hematopoyesis primitiva en el embrión de pez cebra. 5. La inhibición génica de Tnfa o Tnfr2, pero no Tnfr1 o Lta, resulta en la apoptosis de las HSCs cuando éstas emergen de la aorta dorsal. 6. La señalización Tnfa/Tnfr2 se requiere de forma intrínseca para la supervivencia de las HSCs a partir del endotelio hemogénico. OBJECTIVES 1. Characterization of Tnfa receptors (Tnfr1 and Tnfr2) in vascular homeostasis during the zebrafish embryo development. 2. Characterization of the Tnfr1 and Tnfr2 signaling pathways involved in endothelial cell development and homeostasis. 3. Characterization of the role played by Tnfrs and their ligands (Tnfa and Lta) in the primitive wave of hematopoiesis in the zebrafish embryo. 4. Characterization of Tnfrs and their ligands (Tnfa and Lta) in HSCs specification and maintenance in the zebrafish embryo. METHODOLOGY In this Doctoral Thesis, zebrafish (Danio rerio) has been utilized as research animal model. In addition, several cell lines and tissue culture techniques have been used for the in vitro experimentation. Related to the molecular biology techniques utilized, the injection at one-cell stage with mRNA, morpholinos and DNA; RT-qPCR and in situ hybridization can be emphasized. Moreover, other techniques used have been used such as confocal microscopy and fluorescence microscopy; immunohystochemistry techniques and TUNEL for apoptosis detection; as well as cytometry-related assays as fluorescence activated cell sorting (FACS). RESULTS During this Doctoral Thesis, we have characterized the role of Tnfa and Tnf receptors (Tnfrs) during endothelial and hematopoiesis development in the embryo using zebrafish (Danio rerio) as a vertebrate model. Targeted gene knockdown of Tnfr2 in zebrafish embryos results in the induction of a caspase-8, caspase-2 and P53-dependent apoptotic program in endothelial cells that bypasses caspase-3. Furthermore, the simultaneous depletion of Tnfr1 or the activation of NF-ĸB rescue endothelial cell apoptosis, indicating that a signaling balance between both TNFRs is required for endothelial cell integrity. Similarly, Tnfa promotes the apoptosis of human endothelial cells through Tnfr1 and triggers caspase-2 and P53 activation. On the other hand, we show that Tnfa signaling through Tnfr2 is intrinsically required for hematopoietic stem cells (HSCs) maintenance and expansion. The genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2, but not of lymphotoxin α (Lta) or Tnfr1, results in the apoptosis of HSCs soon after their emergence. CONCLUSIONS 1. Target gene silencing of Tnfr2 results in the induction of a caspase-8-dependent apoptotic program in endothelial cells. This apoptosis can be rescued by depletion of Tnfr1, indicating that an appropriate signaling balance between both Tnfrs is required for endothelial cell integrity and vascular homeostasis. 2. In endothelial cells, Tnfr1 signals apoptosis through complex II formation and caspase-8 and caspase-2 activation, while Tnfr2 signals survival via complex I and NF-ĸB activation. 3. The apoptotic program induced by Tnfr1, which involves caspase-8, caspase-2 and P53, is evolutionary conserved in human endothelial cells. 4. Tnfrs signaling is dispensable for primitive hematopoiesis in the zebrafish embryo. 5. Genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1 or Lta, results in HSC apoptosis soon after their emergence from the floor of the dorsal aorta. 6. Tnfa/Tnfr2 signaling is intrinsically required for HSC survival after their emergence from the hemogenic endothelium.
Open Access
Caracterización in vitro de células madre/estromales mesenquimales adiposas caninas modificadas mediante exofucosilación enzimática
(Universidad de Murcia, 2024-02-07) Gil Chinchilla, Jesús Isaías; Marín Atucha, Noemí; Talavera López, Jesús; García Bernal, David; Escuela Internacional de Doctorado
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO: Las células madre/estromales mesenquimales (MSC) son una población de células indiferenciadas con capacidad de autorrenovación y diferenciación a células de distintos linajes mesodérmicos. Su identificación y utilización terapéutica está generando grandes expectativas tanto en medicina humana como veterinaria gracias a su capacidad para secretar moléculas antinflamatorias e inmunomoduladoras, así como otras señales bioquímicas que estimulan la regeneración celular y reparación de los tejidos dañados. En estudios previos se ha comprobado que estos efectos tróficos beneficiosos se encuentran estrechamente relacionados con su capacidad de migración y extravasación hacia los tejidos inflamados. En estos tejidos, se expresan altos niveles de E-selectina, cuya expresión está regulada por citoquinas proinflamatorias como la IL-1 o el TFN-α. Sin embargo, las MSC carecen de la expresión de ligandos para E-selectina como CLA (glicoforma sialofucosilada de PSGL-1) o HCELL (glicoforma sialofucosilada del receptor CD44), lo cual limita su capacidad de migración a los tejidos dañados y afectando por tanto a su eficacia terapéutica tras su administración intravenosa. No obstante, se están desarrollando distintas estrategias para mejorar la capacidad de migración in vivo de las MSC hacia estos tejidos, siendo una de ellas la glicoingeniería de la superficie celular donde destaca la exofucosilación enzimática. Esta técnica consiste en la modificación transitoria del receptor CD44 presente en las MSC, que por medio de un proceso enzimático es transformado en la molécula HCELL que es el ligando más potente de E-Selectina. El objetivo principal de este estudio consistió en determinar si era posible fucosilar de forma efectiva las MSC derivadas del tejido adiposo (AT-MSC) caninas, y si este proceso de exofucosilación enzimática provoca alguna alteración en sus propiedades y/o características celulares y funcionales, evaluando además su preservación en condiciones de refrigeración con vistas a un posible uso terapéutico en la práctica clínica veterinaria. MATERIALES Y MÉTODOS: Las AT-MSC fueron aisladas a partir de lipoexplantes de grasa procedentes de perros donantes (n=10). Para ello, una vez en el laboratorio los lipoexplantes fueron sometidos a una digestión mecánico-enzimática, obteniéndose el cultivo primario y los siguientes subcultivos hasta llegar a pase 2-4, momento en el que fueron sometidas a la exofucosilación enzimática para la realización de los experimentos planificados: 1) Verificación del proceso de exofucosilación enzimática de las AT-MSC caninas; 2) Determinación de la estabilidad de la exofucosilación enzimática en las AT-MSC FUC en condiciones de cultivo (37ºC) y en refrigeración RESUMEN - 267 - (4ºC); 3) Caracterización celular de las AT-MSC FUC en función de su morfología celular, inmunofenotipo y capacidad de diferenciación multipotencial hacia células del tejido adiposo, óseo y cartilaginoso; 4) Caracterización funcional de las AT-MSC FUC determinando su capacidad de proliferación, de migración, de secreción y de inmunomodulación celular; y 5) Estudio de la viabilidad celular en condiciones de refrigeración (4ºC) de las AT-MSC caninas tras su fucosilación. Los datos fueron recopilados en una base de datos Excel© v.19 y analizados mediante el software GraphPadPrism© v.8. RESULTADOS: Nuestros resultados mostraron que las AT-MSC caninas pueden ser fucosiladas de forma efectiva (>98%), revirtiéndose este proceso en condiciones de cultivo celular en menos de 72h en condiciones de cultivo celular (6%) pero manteniéndose estable y funcionales en condiciones de refrigeración (4ºC) durante al menos 4 días (>90%). Además, observamos que las AT-MSC FUC mantienen sus características celulares conservando su morfología, inmunofenotipo celular, capacidad de diferenciación multipotencial hacia tejido adiposo, óseo y cartilaginoso, y capacidad de proliferación. Sin embargo, encontramos que la exofucosilación enzimática aumenta 1,7 veces más su capacidad de migración, y que se vuelven más antinflamatorias e inmunomoduladoras, potenciándose estos efectos aún más en presencia de citoquinas proinflamatorias (TNF-α + IFNγ) como las que se expresan en los tejidos inflamados o dañados. Por último, también observamos que la exofucosilación enzimática no afecta de forma significativa a la viabilidad celular de las AT-MSC caninas, pudiendo además mantenerse funcionales mediante refrigeración a 4ºC durante al menos 4 días.y con una viabilidad celular superior al 90%. CONCLUSIONES: A la vista de los resultados obtenidos, podemos concluir que la exofucosilación enzimática es una técnica factible y segura para su aplicación en AT-MSC caninas, ya que no afecta de forma significativa a las características celulares propias de estas células mesenquimales, y que de forma importante potencia su capacidad de migración y sus efectos terapéuticos antinflamatorios e inmunomoduladores, pudiendo emplearse esta modificación celular para optimizar y mejorar las propiedades de las AT-MSC caninas. De este modo en un futuro próximo esta técnica podría ser utilizada en la práctica clínica veterinaria para el tratamiento de diversas patologías de base inflamatoria y/o inmunomediadas.
Open Access
Efectos "in vitro" de tres extractos del capullo del gusano de la seda frente a la radiación ultravioleta B
(2015-07-15) Vicente-Ortega Sánchez, Raquel; Sánchez-Pedreño Guillén, Paloma; Gómez García, Francisco José; Vicente Ortega, Vicente; Departamento de Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica
Durante las últimas décadas la exposición solar ha sufrido un aumento considerable, sobre todo la recreativa o intermitente, por lo que el fotoenvejecimiento afecta también a jóvenes que se exponen al sol sin protección o a fuentes ultravioleta artificiales para el bronceado rápido (Camacho, 2001), de ahí, la inversión millonaria que se realiza en Occidente en investigación de sustancias que eviten o retrasen los efectos del fotoenvejecimiento, tanto por estética como por el coste económico del tratamiento de las lesiones. En los últimos años, los aceites esenciales han suscitado gran interés debido a su capacidad antioxidante, que podría interferir en los mecanismos del fotoenvejecimiento, evitando la formación de radicales libres y potenciando el subsistema inmunológico cutáneo (Siegel, 2012). En nuestro trabajo hemos ensayado tres extractos procedentes del capullo del gusano de la seda: fibroína, sericina e hidrolizado para conocer sus efectos “in vitro”: a) Citotóxicos (viabilidad y proliferación celular) sobre las líneas celulares: Vero, TRAMP-C1 y HaCaT. b) Genotóxico y genoprotector sobre sangre total humana. c) Sobre la migración celular y protección frente a la radiación ultravioleta B en la línea celular HaCaT. En los ensayos de CITOTOXICIDAD sobre las células Vero, ni la fibroína ni el hidrolizado de seda fueron citotóxicos, mientras que la sericina provocó una disminución de la viabilidad celular dosis-respuesta significativa, moderadamente citotóxica. Las células TRAMP-C1 mostraron valores de viabilidad celular a las 24 y 48 horas muy próximos a los controles (casi del 100%) por lo qué ninguno de los extractos: fibroína, sericina e hidrolizado de seda presentaron acción anticancerosa sobre la línea celular TRAMP-C1 a las concentraciones estudiadas.El objetivo del ensayo de citotoxicidad para las células HaCaT fue ajustar las dosis de los extractos para poder utilizar la máxima concentración que admitiera el cultivo sin que afectara a su viabilidad y poder llegar hasta ese punto con el ensayo de fotoprotección y migración. La fibroína no fue citotóxica hasta 0,1%, a partir del cual mostró cierto efecto citotóxico estadísticamente significativo dependiente de la dosis. La sericina resultó más citotóxica como también constatamos sobre la línea Vero. Este efecto comenzó a hacerse evidente con las concentraciones más bajas (0,05 y 0,1), alcanzando la IC 50 de forma temprana en 0,22% a las 24 horas y 0,16% a las 48 horas. El efecto negativo dosis-respuesta sobre el cultivo fue estadísticamente significativo a partir del 0,05%. El hidrolizado de seda mostró mejor comportamiento respecto a la viabilidad de estas células, con valores próximos e incluso superiores al 100% (control) en todas las concentraciones estudiadas a 24 y 48 horas. Por lo que el hidrolizado de seda no afecta a la viabilidad celular de esta línea. En el ensayo de GENOTOXICIDAD, no existían diferencias estadísticamente significativas en el número de micronúcleos por 500 CB en las muestras tratadas con los tres extractos respecto a las controles. En el ensayo de GENOPROTECCIÓN, observamos disminución de MN/500 CB cuando se administraban los tratamientos (fibroína, sericina e hidrolizado de seda) previamente a la irradiación aunque ninguno mostró disminución estadísticamente significativa respecto al control irradiado. Por lo que parece existir tendencia a la protección frente al daño producido por la radiación X. En cuanto a la MIGRACIÓN CELULAR, el hidrolizado de seda no mostró diferencias estadísticamente significativas a las concentraciones estudiadas (0’01 y 0’1 %) en relación a la migración de las células HaCaT. El estudio de FOTOPROTECCIÓN presentó resultados significativos (p < 0’001) para el hidrolizado y la fibroína, resaltando el importante incremento de la viabilidad celular a las 24 y 48 horas causado por el hidrolizado de seda a las concentraciones 0,001; 0,01; 0,05 y 0,1, y la mínima intensidad de radiación ultravioleta (0,08 J/cm2), lo que consideramos de gran relevancia clínica por la facilidad de incorporación de una dosis tan baja de hidrolizado de seda a un producto fotoprotector. I. SUMMARY In the last decades the sun exposition, specially recreative or intermitent, has led to a tremendous increase in skin cancer. Photo-aging also affects young people who have exposed to the sun or artificial UV sources without protection (Camacho, 2001). For that reason, the Occidental Countries have made a millonair inversion in research studies on substancies to avoid or delay the photo-aging effects. During the last years, the esential oils have aroused great interest because of their antioxidant capacity, which could affect on photodamage mecanism, avoiding the free radycals formation and enhancing the cutaneous inmune subsystem (Siegel, 2012). II. OBJETIVES General Objective The main objective of this thesis was to compare three extracts from silkworm: fibroin, sericin and silk hidrolyzate in order to know their “in vitro” effects: a) Cytotoxic (viability and celular proliferation) on celular lines: Vero, TRAMP-C1 and HaCaT. b) Genotoxic and genoprotective on total human blood. c) Celular migration and protecction against ultravioleta B radiaton on celular line HaCaT. Specific Objectives 1º. To evaluate the cocoon of silkworm efectts: fibroin, sericin and silk hidrolyzate upon proliferation and citotoxicity of celular lines: TRAMP-C1 y HaCaT. 2º. To study the genotoxic and genoprotective silkworm extracts over total human blood. 3º. To identify the activity of silkworm extracts upon celular migration in HaCaT line. 4º. To analyze, in HaCaT line, the silkworm extracts protective effects against ultraviolet B radiation. III. RESULTS Neither fibroin or silk hydrolyzate were citotoxic upon Vero celular line trial, while sericine caused a significant disminution celular dose-response, moderately citotoxic. Fibroin was not citotoxic until 0,1%, after that concentration it showed a light dose-dependent citotoxic effect statistically significant. Sericine was more citotoxic over Vero celular line. This effect was more evident with lower concentrations (0.05 y 0.1), with sooner IC 50 on 0.22% at 24h and 0.16% at 48h. The negative dose-response effect over the cultive was estatistically significant from 0,05%. The silk hydrolyzate showed a better response respect these cells viability, with values closer or higher to 100% (control) in all the studied concentrations within 24 and 48 hours. So the silk hydrolyzate does not affect this celular line’s viability. The TRAMP-C1 cells showed celular viability values within 24 and 48 hours closer to control (near 100%) so no one of the extracts: fibroin, sericin and silk hydrolyzate showed anticancer action over TRAMP-C1 celular line in studied concentrations. In the GENOTOXICITY trial, did not exist statistically significant differences in the number of MN/500 CB in the samples treated with the three agents respect to the control. In the GENOPROTECTION trial, a disminution of MN/500 CB was observed when treatments (fibroin, sericin and silk hidrolyzate) were administrated previously to the irradiation although no one showed a statistically significant disminution respect the irradiated control. So there seems to be a protection against X radiation. As regard the CELULAR MIGRATION, the sylk hydrolyzate did not show statistically significant differences in studied concentrations (0.01 y 0.1 %) related with migration of celular line HaCaT. The PHOTOPROTECTION study showed significant results (p < 0.001) for the silk hydrolyzate and fibroin, with an important cellular viability increase within 24 y 48 hours caused by the hydrolyzate 0.001, 0.01, 0.05 and 0.1 concentrations and the ultraviolet minimun intensity radiation (0.08 J/cm2). Silk hydrolyzate should be considered as a photoprotective agent with a high clinic relevance, due to its activity in very low doses.
Open Access
Estructura, expresión y aspectos funcionales del inhibidor de antizimas 2 (AZIN2)
(2013-12-13) Ramos Molina, Bruno; Peñafiel García, Rafael; López Contreras, Andrés Joaquín; Facultad de Medicina
Las poliaminas son pequeñas moléculas con carga positiva esenciales para los procesos de crecimiento, proliferación, diferenciación y apoptosis celular. En mamíferos, los niveles intracelulares de poliaminas están altamente regulados a través de distintos mecanismos, como su biosíntesis, degradación y transporte a través de la membrana plasmática. La regulación post-traduccional de ornitina descarboxilasa (ODC), enzima clave de la ruta biosintética, está principalmente mediada por la acción de una familia de proteínas denominadas antizimas (AZs), cuya síntesis se estimula cuando los niveles de poliaminas son elevados. Las AZs se unen y inhiben ODC, e inducen su degradación proteasomal sin ubiquitinación. Además, las AZs inhiben la captación de poliaminas extracelulares, probablemente por interaccionar con el transportador de poliaminas. Además de las AZs, la actividad ODC está también indirectamente regulada por una familia de proteínas denominadas inhibidores de antizimas (AZINs). Estas proteínas, homólogas a ODC pero sin actividad enzimática, también interaccionan con las AZs, incluso de manera más eficiente que ODC, contrarrestando los efectos de las AZs sobre ODC. En mamíferos, la familia de los AZINs está compuesta por dos miembros: AZIN1 y AZIN2. Mientras que AZIN1 es una proteína de expresión ubicua que regula los niveles intracelulares de poliaminas y el crecimiento celular, AZIN2 se expresa mayoritariamente en testículo y cerebro, y su función fisiológica es menos conocida. El presente trabajo se ha centrado en el estudio de la expresión del gen Azin2 en tejidos de ratón, así como en profundizar en el conocimiento de diferentes aspectos funcionales y estructurales de AZIN2, proteína caracterizada por primera vez en nuestro laboratorio, comparando los mismos con los de sus proteínas homólogas ODC y AZIN1. Los objetivos del trabajo planteados, relacionados con la expresión, estructura, y función de AZIN2, fueron los siguientes: 1) Estudio de la expresión de AZIN2 y proteínas homólogas, así como la de las AZs en diferentes tejidos de ratón adulto mediante RT-PCR a tiempo real; 2) expresión de AZIN2 en testículo de rata y en testículos de ratones con alteraciones en la espermatogénesis; 3) influencia de AZIN2 y proteínas relacionadas con el metabolismo de poliaminas sobre el transporte de agmatina e influencia sobre el mismo de compuestos amino-guanidinios; 4) predicción de la estructura tridimensional de AZIN2 mediante modelado comparativo por homología, y estudio de la estructura cuaternaria de AZIN2 en células de mamífero; 5) análisis de la zona de unión a AZs (AZBE) en AZIN2 y sus parálogos, e influencia de los residuos conservados en las propiedades de las proteínas; 6) estudio de la vida media de AZIN2 y sus parálogos en células de mamífero, y de su posible mecanismo de degradación. En general, la metodología utilizada para la realización de este trabajo puede describirse como una combinación de técnicas de bioquímicas y de biología molecular, análisis de expresión génica mediante RT-PCR a tiempo real y aproximaciones computacionales. Además, se utilizaron tanto líneas celulares, principalmente para los experimentos de transfección, como animales de laboratorio. En particular, se realizaron tratamientos específicos para la destrucción de células germinales haploides del testículo. Las conclusiones obtenidas del trabajo experimental son las siguientes: 1. El análisis mediante RT-PCR a tiempo real mostró que, además de cerebro y testículo, AZIN2 se expresa de manera significativa en otros tejidos de ratón adulto como epidídimo, glándula adrenal, páncreas, corazón y pulmón, mientras que su expresión en diversas líneas celulares humanas de origen tumoral fue prácticamente indetectable. 2. Diversos modelos experimentales corroboran que en el testículo murino la gran mayoría del ARNm de AZIN2 se encuentra localizado en las células germinales haploides, descartando una expresión significativa en otros tipos celulares testiculares como las células intersticiales. 3. El patrón de expresión postnatal de AZIN2 y AZ3 en el testículo de rata es similar al encontrado en ratón, sugiriendo que estas proteínas también podrían estar participando en el proceso de espermiogénesis en esta especie. 4. La sobreexpresión de ODC o AZIN2 estimula la entrada de agmatina a las células COS7, mientras que las AZs la inhiben. En condiciones basales, dicho transporte, a concentraciones próximas a las fisiológicas, parece tener lugar a través del transportador general de poliaminas. 5. La estructura tridimensional de AZIN2, deducida mediante modelado comparativo, es similar a la descrita para sus parálogos ODC y AZIN1 en lo referente a los dominios barril / y hoja plegada , aunque difiere en regiones menos conservadas como ciertos bucles y las regiones N- y C-terminal. 6. A diferencia de ODC, AZIN2 es incapaz de formar homodímeros o a heterodimerizar con monómeros de ODC, aunque comparte con esta proteína la capacidad para interaccionar con las tres antizimas conocidas. 7. El análisis comparativo de la secuencia de la región AZBE en los diferentes ortólogos de AZIN2 y los de sus parálogos AZIN1 y ODC reveló la existencia de cinco residuos conservados (K116, A124, E139, L140 y K142 en la secuencia de AZIN2 de ratón). 8. Mientras que las mutaciones simples de cada uno de estos residuos en AZIN2 apenas afectaron la interacción de esta proteína con las AZs, las mutaciones dobles o triples de algunos de ellos anularon la capacidad de AZIN2 para interaccionar con las AZs, de manera independiente de la repercusión de dichas mutaciones sobre la carga eléctrica neta del elemento AZBE. 9. Los residuos conservados en la secuencia AZBE de ODC parecen ser muy importantes para la función de la enzima, ya que todas las mutaciones simples de los mismos, con la excepción de A123, disminuyeron notablemente la actividad catalítica de la enzima. 10. Los residuos E138 y L139 son críticos para la funcionalidad de ODC, ya que su sustitución por alaninas disminuye grandemente la homodimerización de la proteína, produciendo además la del segundo un gran aumento en su estabilidad por anular su interacción con AZ1. 11. En células transfectadas, AZIN2 es una proteína más lábil que ODC, mostrando una vida media de aproximadamente 90 minutos, y que a diferencia con ODC se estabiliza grandemente al interaccionar con las antizimas. 12. A diferencia con lo observado para ODC y AZIN1, la inhibición de la maquinaria proteasomal con lactacistina o MG132 produce una marcada disminución de la proteína AZIN2, sugiriendo que su degradación pudiera estar mediada por una vía alternativa a la del proteasoma 26S. Polyamines are small cationic molecules essential for cell growth, proliferation, differentiation and apoptosis. In mammals, the intracellular polyamine levels are tightly controlled by the regulation of different processes including their biosynthesis, degradation and transport across the plasma membrane. Post-translational regulation of ornithine decarboxylase (ODC), the key biosynthetic enzyme, is mainly mediated by the action of a family of small proteins named antizymes (AZs), whose synthesis is stimulated by high polyamine levels. AZs bind and inhibit ODC and target it to proteasomal degradation. Furthermore, AZs inhibit extracellular polyamine uptake presumably by interacting with the polyamine transport system. In addition to AZs, the ODC activity is also indirectly regulated by a family of proteins named antizyme inhibitors (AZINs). These proteins, closely related to ODC but without enzymatic activity, also interact with antizymes, even more efficiently than ODC, counteracting the effects of antizymes on ODC. In mammals, the AZIN family is formed by two members: AZIN1 and AZIN2. Whereas AZIN1 is a ubiquitous protein that regulates intracellular polyamine levels and cell growth, AZIN2 is mainly expressed in testis and brain and its physiological role is mostly unknown. In this work we have focused on the study of the expression of the Azin2 gene in mouse tissues and the determination of different functional and structural aspects of AZIN2, protein first characterized in our laboratory, comparing the results with those of the homologous proteins ODC and AZIN1. The specific aims of this work were: 1) To determine the expression pattern of AZIN2 and homologous proteins, as well as those of AZs, in different adult mouse tissues by real-time RT-PCR; 2) to elucidate the AZIN2 expression in rat normal testes and in mouse testes with impaired spermatogenesis; 3) to analyse the effect of AZIN2 and proteins related to the polyamine metabolism and the influence of aminoguanidine compounds on agmatine transport; 4) to predict the tridimensional structure of AZIN2 by comparative modeling and to determine whether AZIN2 is able to form homodimers or heterodimers with ODC in mammalian cells; 5) to analyse the AZBE region of AZIN2 and its paralogs and the effect of conserved residues in the functionality of these proteins; 6) to study the half-life and the mechanism of degradation of AZIN2 and its paralogs in mammalian cells. In general the experimental methodology involved methods of molecular biology and biochemistry, gene expression analyses using real-time RT-PCR and computational approaches. In addition, we used several mammalian cell lines, mainly for transient transfection experiments, and laboratory animals. In particular, we performed specific treatments for the selective destruction of haploid germ cells in mouse testis. The conclusions obtained from our experiments were as follows: 1. Real-time RT-PCR analysis showed that, in addition to brain and testis, AZIN2 is expressed significantly in other adult mouse tissues such as epididymis, adrenal glands, pancreas, heart and lung, whereas its expression in several human cancer cell lines is almost undetectable. 2. In mouse testis, most AZIN2 mRNA is located in haploid germ cells, without significant expression in other testicular cells such as the interstitial cells. 3. The postnatal expression patterns of AZIN2 and AZ3 genes in rat testis are similar to those found in mice, indicating a evolutionary conserved expression pattern and suggesting that in the rat both proteins might be also participating in the spermiogenesis. 4. Agmatine uptake in COS7 cells is stimulated by AZIN2, ODC or SSAT overexpression, and inhibited by the presence of AZs. In basal conditions, agmatine uptake occurs through the polyamine transporter when the concentration of agmatine is close to the physiological values. 5. The tertiary structure of AZIN2, predicted by comparative modeling, is similar to those of its paralogs ODC and AZIN1 in the domains TIM / barrel and sheet, but it differs considerably in less conserved regions such as some loops and the N- and C-terminal regions. 6. Unlike ODC, AZIN2 is unable to form homodimers or heterodimers with ODC, but it is able to interact with the three AZ isoforms. 7. The comparative analysis of the AZBE sequences from multiple AZIN1, AZIN2 and ODC ortologs revealed the existence of five conserved residues (K116, A124, E139, L140 and K142 in mouse AZIN2). 8. In AZIN2, the double and triple substitutions of some of the conserved residues, but not single substitutions, drastically affected its interaction with AZs, independently from the effect of the substitutions on the net electric charge of the AZBE region. 9. In the case of ODC, the conserved residues play an important role in the function of the enzyme, since all single substitutions, with the exception of A123, significantly diminished ODC catalytic activity. 10. The residues E138 and L139 are critical for ODC functionality, since their substitution by alanines clearly reduced the formation of homodimers, causing the change L139A a potential increase of the protein stability by decreasing its interaction with AZ1. 11. In transfected cells, AZIN2 is more labile than ODC, having a half-life of approximately 90 minutes and being considerably stabilized by the interaction with AZs. 12. Unlike ODC and AZIN1, AZIN2 protein levels decreased after treatment with proteasome inhibitors, suggesting that its degradation might be mediated by an alternative route to proteasome 26S.
Open Access
Functional characterization of mast cells and histamine in the immune system of gilthead seabream (Sparus aurata L.) = Caracterización funcional de las células cebadas y de la histamina en el sistema inmunitario de dorada (Sparus aurata L.)
(2017-04-27) Gómez González, Nuria Esther; García Ayala, Alfonsa; Sepulcre Cortés, María Pilar; Escuela Internacional de Doctorado
El sistema inmunitario de peces teleósteos ha sido estudiado durante décadas y, a pesar de haberse realizado importantes avances en su conocimiento, todavía hoy existen grandes lagunas, especialmente sobre la presencia y la función de las células cebadas (MCs) y la histamina. La dorada (Sparus aurata L.), pez teleósteo marino de alto valor comercial en la acuicultura mediterránea, ha sido utilizado por numerosos autores en el estudio de la respuesta inmunitaria de peces. Además, y debido al hecho de que la dorada es una especie hermafrodita, muchos estudios se han centrado en el efecto que el estrógeno sintético 17α-etinilestradiol (EE2), ampliamente distribuido en los ambientes acuáticos, ejerce sobre ella. Sin embargo, ninguno de estos estudios se ha centrado en los leucocitos peritoneales. Con estos precedentes, el objetivo de esta tesis ha sido avanzar en el conocimiento del papel de las MCs y la histamina en la respuesta inmunitaria de la dorada. En el primer capítulo desarrollamos un protocolo de aislamiento de MCs peritoneales de dorada. Utilizando gradientes de centrifugación y densidad, cultivos celulares, separación celular activada por magnetismo y anticuerpos monoclonales específicos (mAb) se obtuvieron fracciones de MCs con un 95% de pureza. Las MCs peritoneales aisladas presentan histamina, la cual es liberada utilizando el compuesto 48/80 (Co 48/80), clásico activador de células cebadas. Además, la expresión de los genes il1b e il8 se induce en estas células tras estimularlas con ADN bacteriano. Este protocolo de aislamiento de MCs permitirá avanzar en el conocimiento de la evolución de los mecanismos inflamatorios de vertebrados. En el segundo capítulo, estudiamos el efecto de la histamina y del Co 48/80 en la respuesta inmunitaria innata y adaptativa de dorada. Para ello, inyectamos vía intraperitoneal histamina o Co 48/80, solos o combinados con el patógeno Vibrio anguillarum, y se analizó su efecto en el exudado peritoneal y en el riñón cefálico. La histamina y el Co 48/80 alteran el porcentaje de leucocitos peritoneales y de riñón cefálico, incrementan la producción de ROS y alteran la producción específica de IgM contra V. anguillarum. Además, ambos compuestos reducen la expresión del gen que cifra el receptor 2 de histamina en leucocitos peritoneales. Estos resultados demuestran que aunque la administración sistémica de histamina y Co 48/80 es segura, ninguno de los dos compuestos puede ser considerado como un adyuvante eficiente en la vacunación intraperitoneal de dorada. En el tercer capítulo, produjimos y caracterizamos un mAb, GB10, que reconoce específicamente MCs de dorada. GB10 marca el 20-30% de los leucocitos peritoneales. GB10 induce rápidamente la muerte de las MCs de dorada, como demostramos mediante citometría de flujo. Ensayos in vivo, en los que GB10 será intraperitonealmente inyectado en dorada, nos ayudarán a comprender aspectos evolutivos tanto de las MCs como de la histamina. Finalmente, en el cuarto capítulo, analizamos el efecto de EE2 en la respuesta inmunitaria peritoneal de dorada. El EE2 fue administrado en la dieta de juveniles de dorada durante 76 días que fueron inyectados intraperitonealmente con hemocianina y aluminio como adyuvante al final del tratamiento y 92 días después. La administración en dieta del EE2 induce la expresión de los genes que cifran los receptores de estrógenos, el nuclear α y el acoplado a la proteína G1. De manera interesante, la administración en dieta del EE2 indujo una respuesta inflamatoria en el exudado peritoneal que se mantuvo durante varios meses después de finalizar el tratamiento, además de modular la expresión de los genes que cifran los receptores de histamina. En conjunto, este estudio proporciona nueva información sobre la disrupción endocrina inmunitaria, centrada en los leucocitos peritoneales. The immune system of teleost fish has been studied for decades but, despite the important advances made in our related knowledge, much is still unknown, especially about the presence and role of mast cells (MCs) and histamine. The gilthead seabream (Sparus aurata L.), a marine teleost fish of great commercial value in the Mediterranean aquaculture, has been widely used for better understanding the fish immune response. Moreover, and due to the fact that the gilthead seabream is a hermaphrodite specie, many studies has focus on the effects that the synthetic estrogen 17α-ethinylestradiol (EE2), widespread in the aquatic environment, exerts in this specie. However, no studies have been focused on peritoneal leukocytes. Within the above framework, the aim of this thesis has been to advance our knowledge of the role of MCs and histamine in the immune response of the gilthead seabream. The first chapter ended up with the development of a protocol to isolate peritoneal MCs of gilthead seabream. Using discontinuous density gradient centrifugations, cell culture, magnetic-activated cell sorting, and specific monoclonal antibodies (mAb), 95% pure MC fractions were obtained. Isolated peritoneal MCs possess histamine which is released by the compound 48/80 (Co 48/80), the classical mast cell activator. Moreover, IL-1β and IL-8 gene expression was induced in these cells by stimulation with bacterial DNA. This MC isolation protocol will be useful in the knowledge advance of the vertebrate inflammatory mechanisms evolution. In the second chapter, we study the effect of histamine and Co 48/80 on the innate and adaptive immune response of gilthead seabream. For this purpose, histamine and Co 48/80 were intraperitoneally injected alone or combined with the pathogen, Vibrio anguillarum, and their effects on peritoneal exudate and head kidney were analyzed. Histamine and Co 48/80 alter the percentage of peritoneal exudate and head kidney immune cells, increase the ROS production by peritoneal leukocytes and impair the humoral adaptive immune response, i.e. production of specific IgM to V. anguillarum. Moreover, both, histamine and Co 48/80, reduce the expression of the gene encoding histamine receptor 2 in peritoneal leukocytes. These results show that although systemic administration of histamine and Co 48/80 is safe, neither histamine nor Co48/80 can be regarded as efficient adjuvants for gilthead seabream intraperitoneal vaccination. In the third chapter, we report the production and characterization of a mAb, GB10, which specifically recognizes gilthead seabream MCs. GB10 reacted with 20-30% of peritoneal leukocytes. GB10 rapidly induce death of gilthead seabream MCs, as demonstrated by flow cytometry. In vivo assays, in which GB10 will be intraperitoneally injected in gilthead seabream, will help to understand the evolutionary aspects of both MCs and histamine. Finally, in the fourth chapter, we analyze the effects of EE2 in the peritoneal immune response of gilthead seabream. Juvenile fish were fed a pellet diet supplemented with EE2 for 76 days and intraperitoneally injected with hemocyanin plus imject alum adjuvant at the end of EE2 treatment and 92 days later. The dietary intake of EE2 induces the expression of genes encoding for the nuclear estrogen receptor α and the G protein-coupled estrogen receptor 1 in the peritoneal leukocytes. Interestingly, the dietary intake of EE2 induced an inflammatory response in the peritoneal exudate, which was largely maintained for several months after the cessation of the treatment and, besides, modulates histamine receptor gene expression. Taken together, the study provides fresh information about endocrine immune disruption, focusing on peritoneal leukocytes.
Open Access
Functional characterization of purinergic receptors in the differentiation and activation of macrophages = Caracterización funcional de recptores purinérgicos en la diferenciación y activación de macrófagos
(2016-02-12) Barberá Cremades, María; Pelegrín Vivancos, Pablo; Facultad de Biología
Resumen Esta Tesis estudia la caracterización de diferentes receptores purinérgicos, principalmente P2X7, en células presentadoras de antígeno de la estirpe mieloide mononuclear fagocítica (monocitos, macrófagos peritoneales y macrófagos derivados de médula ósea). En concreto, se determina como la señalización purinérgica afecta a la diferenciación de los macrófagos, la producción de eicosanoides y de TNF-α, en estados tanto pro-inflamatorias y como de inmunosupresión. Para ello, se emplearon diferentes estímulos celulares; señales de patógenos, principalmente lipopolisacarido (LPS) bacteriano, señal que activa a los macrófagos a través de los receptores tipo toll 4; y señales de daño celular, principalmente ATP y adenosina. Siendo los objetivos concretos de esta Tesis: 1) Estudiar cómo afecta la señalización purinérgica a la diferenciación de los macrófagos; 2) Analizar la relación entre la activación del receptor P2X7 en macrófagos y la producción de eicosanoides; 3) Determinar cómo el receptor P2X7 regula la liberación del factor de necrosis tumoral (TNF)-α en macrófagos extenuados. La metodología empleó macrófagos peritoneales humanos y monocitos de sangre periférica de donantes sanos y pacientes con un proceso séptico severo de origen abdominal; muestras de ratones de la cepa C57BL/6 y deficientes para los receptores a estudio (P2rx7-/- y P2rx4-/-) que se emplearon para estudios tanto in vivo como in vitro. En la mayoría de ensayos se emplearon macrófagos derivados de médula ósea de ratón. Los diferentes macrófagos fueron sometidos a distintos protocolos de estímulo según el objetivo abordado: diferentes dosis de LPS para estudiar la respuesta ante situaciones inflamatorias, o polarización de macrófagos a M1 con LPS e interferon-o a M2 con interleuquina (IL)-4, para en todos los casos estimular con un nucleótido. De los estudios in vitro se analizó la cantidad de IL-1β, TNF-α, prostaglandina (PG) E2, tromboxano A2 y leucotrieno B4 liberada al medio mediante la técnica ELISA, la muerte celular cuantificando la actividad de lactatodehidrogenasa en los sobrenadantes celulares; la viabilidad celular mediante ensayos de reducción meatabólica del bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol; la cuantificación de la expresión relativa de los genes que codifican para los diferentes receptores y marcadores citoquímicos de interés, empleando la técnica de PCR-transcriptasa reversa a tiempo real, la cuantificación de marcadores de membrana específicos de macrófagos mediante citometría de flujo, y finalmente la actividad de la enzima convertidora de TNF-α (TACE) y la actividad catepsina B, mediante técnicas fluorométricas. Los estudios in vivo realizados en ratón analizaron la actividad del receptor P2X7 tras la administración intraperitoneal de LPS, cuantificando IL-1β y TNF-α en lavados peritoneales empleando la técnica ELISA, la presencia de ATP extracelular en peritoneo se cuantificó mediante bioluminiscencia, y la medición de la temperatura rectal en un modelo inducido de sepsis mediante una sonda térmica. Resultados y conclusiones: En esta Tesis se demuestra que la señalización purinérgica es capaz de reducir el número de macrófagos diferenciados de médula ósea, resultando en una regulación positiva de ciertos marcadores M2, derivando en un fenotipo específico de macrófago. En los macrófagos maduros, la activación de P2X7 induce la liberación del mediador lipídico PGE2, siendo P2X7 importante en la respuesta febril, un signo clásico asociado con el proceso inflamatorio. Además, la señalización mediante el receptor P2X7 en macrófagos M1 extenuados es capaz de controlar la liberación clásica de TNF-α. Estos resultados tienen implicaciones clínicas, ya que el receptor P2X7 emerge como una diana terapéutica prometedora para la fiebre y su potenciación durante inmunosupresión podría aumentar la inmunidad en los procesos sépticos. Summary This Thesis studies the characterization of different purinergic receptors, mainly P2X7, analyzing their functions in antigen presenting cells of mononuclear phagocytic myeloid lineage (monocytes, peritoneal macrophages and bone marrow derived macrophages). Precisely, the Thesis determine how purinergic signaling affects macrophage differentiation, eicosanoids and tumor necrosis factor (TNF)-α release, during both proinflammatory and immunosuppressive conditions. Therefore, cells were treated with bacterial products, mainly lipopolysaccharide (LPS), which specifically activates Toll-like receptor 4, and signals of cell damage, mainly ATP and adenosine. Objectives: 1) To study how purinergic signaling affects macrophage differentiation; 2) To analyze the association between the activation of P2X7 in macrophages and the production of eicosanoids; 3) To identify how P2X7 receptor regulates TNF-α release during immune extenuation. Methods: The experiments were performed using peritoneal human macrophages and peripheral blood monocytes of healthy subjects and patients with severe sepsis; mice samples from strain C57BL/6 and the knockout for the genes encoding the receptors to study (P2rx7-/- and P2rx4-/-), these mice were used for both in vivo and in vitro studies. Mice bone marrow derived macrophages were used in almost all the experiments of this thesis. The different macrophages were stimulated with different protocols to address the different objectives: different doses of LPS to mimic inflammatory conditions; LPS and interferon- to polarize macrophages to M1 and with interleukin (IL)-4 to polarize to M2. The amount of IL-1β, TNF-α, prostaglandin (PG) E2, thromboxane A2 and leukotriene B4 released, were measured by ELISA; cell death quantification was measured by the activity of lactate dehydrogenase in cells supernatants; macrophage viability was measured by the metabolic reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; relative expression of genes encoding for the desired receptors and markers was quantified by real-time reverse-transcription PCR; the quantification of specific macrophage membrane markers was analyzed by flow cytometry; the converting TNF-α enzyme (TACE) and cathepsin B activity were measured by fluorometric techniques. In vivo mouse studies to study P2X7 receptor activity after intraperitoneal administration of LPS was analyzed by ELISA, measuring IL-1β and TNF-α in peritoneal lavage; detection of extracellular ATP in peritoneum was quantified by bioluminescence; rectal temperature was measured in a sepsis model. Results and Conclusions: this Thesis demonstrates that purinergic signaling is able to reduce the number of differentiated macrophages from bone marrow, which display upregulation of certain M2 markers, resulting in a specific phenotype of macrophage. In mature macrophages, ATP activating P2X7 receptor induces the release of the lipid mediator PGE2, being P2X7 important for the febrile response, a classical signal associated with the inflammatory process. Furthermore, P2X7 receptor signaling in extenuated M1 macrophages is able to control the classical release of TNF-α. These findings have important clinical implications, since P2X7 receptor emerges as a promising target for fever, however its potentiation during immunosuppression could boost immunity in septic processes.
Open Access
Generación de microquimerismo prenatal para donantes en xenotrasplante
(2017-03-01) Abellaneda Cuadrado, Juana María; Ramis Vidal, Manuel Guillermo; Pallarés Martínez, Francisco José; Escuela Internacional de Doctorado
No hay duda que el poder disponer de órganos animales para trasplante solucionaría el problema de su escasez. Pero para que los xenotrasplantes puedan llegar a ser una realidad clínica, se deben superar varias barreras, siendo una de la más importante la barrera inmunológica. Durante los últimos años las líneas de investigación han estado dirigidas a la creación de estrategias para la inducción de tolerancia inmunológica tanto de las células T como B. Una estrategia especialmente prometedora para acercarnos a la xenotolerancia es conseguir tolerancia de las células B, mediante la obtención del quimerismo mixto hematopoyético. El objetivo de este trabajo ha sido generar lechones con quimerismo mixto mediante la inyección ecoguiada intrauterina de un número bajo de diferentes estirpes celulares humanas y determinar posteriormente la resistencia al rechazo hiperagudo in vitro mediante técnicas clásicas. Para lograr este objetivo se procedió a la puesta a punto de una técnica ecográfica ecoguiada intrauterina, incluyendo pruebas de citotoxicidad de un contraste sonográfico mediante análisis celular en tiempo real. Finalmente se procedió a la inyección ecoguiada de 15 cerdas, usando distintas densidades de células STEM humanas CD34+, células mononucleares totales de sangre de cordón umbilical y células mesenquimales de médula ósea. Cuatro de las cerdas inyectadas parieron lechones vivos. En estos animales se determinó la presencia de quimerismo mixto in vitro mediante diferentes técnicas clásicas: PCR, citometría de flujo (CF), inmunocitoquímica y técnica ELISA para determinación de albúmina humana. Además, se realizaron pruebas de hemólisis in vitro mediante sistema RTCA xCELLigence y el método clásico (APA). Utilizando CF para identificar células con HLA I A, B o C en sangre periférica de todos los lechones nacidos vivos a los 15 días de edad, se encontraron 13 positivos de 58 lechonestestados, procedentes de dos de las inyecciones realizadas. La presencia de más animales positivos de los inyectados nos indica que hubo tránsito de dichas células humanas entre hermanos de camada. Estos 13 animales positivos fueron testados de nuevo a los dos meses de edad y ninguno fue positivo, demostrando la desaparición de las células quiméricas o humanas con el paso del tiempo. Mediante q-PCR para la detección del gen AluYb8 humano, se analizaron las muestras sanguíneas y tejidos de animales muertos perinatalmente (N=8), así como el tejido hepático (n= 59), cardiaco (n=53), renal (n=54) e intestino grueso y delgado (n=63) de los animales nacidos vivos procedentes de cerdas inyectadas. En los animales muertos perinatalmente se encontró el gen humano en distintos tejidos y en mayor cantidad que en los animales nacidos vivos (p<0,001). En sangre periférica de lechones nacidos vivos se encontró ADN humano en más animales de los que fueron inyectados en cada camada, al igual que sucedía en la CF. Esto confirmaría que habría tráfico celular entre los lechones durante la gestación. En cuanto a los tejidos de estos lechones, se determinó la presencia de Aluhumano en el 37,74% de las muestras cardiacas, el 54,2% de las muestras hepáticas y el 16,7% de las muestras renales y no se pudo determinar la presencia de células humanas en ninguna muestra de intestino delgado o grueso. En los animales positivos por CF se detectó este gen en PBMCs, hígado y corazón, con una frecuencia significativamente mayor que en los que fueron negativos para HLA I en sangre. Se observó una diferencia significativa al comparar la densidad de Aluen animales positivos y negativos a HLA I, pero para interpretar estos resultados hay que tener en cuenta que los datos de CF utilizados fueron aquellos obtenidos en la primera prueba realizada, cuando los animales tenían 15 días de edad, mientras que los resultados de Aluen tejidos son los que se obtuvieron a los 80 y 175 días de edad para los animales negativos y positivos por CF, respectivamente. El hecho de que los animales negativos a CF, sacrificados con anterioridad a los animales positivos, muestren valores medios superiores a los segundos,indicaría que se ha ido perdiendo el quimerismo y que en los animales sacrificados más tarde la cantidad de ADN humano detectable es menor. Mediante inmunocitoquímica, no se observaron células teñidas en ninguno de los tejidos valiosos para trasplante (hígado, riñón, corazón o pulmón). Sin embargo, en algunas de las muestras de bazo se observaron hematíes inmunorreactivos al anticuerpo anti-HLA. Tampoco se encontró albumina humana mediante ELISA. Finalmente, se determinó la resistencia al RHA mediado por anticuerpos y complemento mediante la técnica clásica de hemólisis (APA) y se evaluó la hemólisis mediante la puesta a punto y uso de una técnica de análisis celular en tiempo real (RTCA). Se encontró que mediante APA clásica se apreciaba un nivel de hemólisis significativamente creciente al comparar animales CF+, CF- y no modificados. Se observaron también diferencias entre los hematíes tomados a los 15 y a los 80 días de vida, con un mayor nivel de hemólisis en estos últimos. La presencia de hematíes con HLA I humano en superficie, como se demostró con la técnica de la inmunocitoquímica, podría explicar la protección frente a la reacción de APA. Además, corroboraría que aquellos animales en los que se observó quimerismo mediante CF tienen menos hemólisis mediada por anticuerpos y complemento, puesto que habría un porcentaje de hematíes que serían humanos, por tanto, no tendrían antígenos α-gal en superficie y no sufrirían la reacción detonada por los xenoanticuerpos preformados y el complemento. Esta capacidad de protección disminuiría con el tiempo, de forma paralela a la reducción de las copias de ADN humano o de la presencia de células con HLA I en superficie. There is no doubt that having animal organs for xenotransplantation will solve the shortage of human tissues for transplantation. But for xenotransplatation to become a clinical reality have to overpass different barriers, such as immunological rejection. During years the research has been focused on different strategies to get donors avoiding this kind of rejection. Among them is the generation of B cells xenotolerance, inducing immunological tolerance against T and B cells. Thus, the aim of this work has been to generate piglets with mixed chimerism through ecoguidedin utero cellular injection with a low number of different types of human cells and to determinate the ability of these animals to overpass hyperacute rejection by means of different analytical technics. To achieve this aim, firstly a percutaneous ecoguided technic was designed and refined, including the assessment of cytotoxicity against human and pig cells of an ultrasonographic contrast agent. STEM CD34+ cells, total mononuclear cells from umbilical cord blood and cultured mesenchymal human cells from marrow bone were injected into 15 sows. Four injected sows produced alive piglets. Mixed chimerism was determined in samples from these piglets using flow cytometry (CF), immunohistochemistry, and ELISA to detect human albumin. Moreover, hemolysis assays were performed in a double way: classical APA and APA based in real time cells analysis (RTCA). Using CF the presence of cells having HLA I molecules on surface of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) obtained from piglets on 15th and 80th days was identified. Thirteen out of 58 piglets resulted positive and these animals were born only from two sows. The number of positive piglets higher than injected piglets confirms the cell trafficking among litter matters in utero.By means of real time PCR to detect Aluhuman gene, human DNA was researched in blood samples, tissue samples from death born piglets (n=8) and liver (n=59), heart (n=53), kidney (n=54) and small and large intestine (n=63) from alive born piglets coming from injected sows. Human DNA was found in higher frequency and quantity in death born piglets (p<0,001). The Alugene was identified in PBMCs from 33 piglets, confirming thus the cellular trafficking. This gene was also identified in 37.73% of heart samples, 54.2% of liver samples, 16.7% of kidney samples and none of gut and intestine samples. The animals CF+ showed higher frequency of samples with human DNA than CF- animals. There was higher density of Alucopies in CF- animals than in CF+ but it should be taken into account that samples from CF- were obtained 2 months before CF+ samples. All these data point out to a progressive decrease in the number of human cells with the age of the animals. There was no positive immunostained cells for HLA I, except for red blood cells in spleen. There was not found human albumin in sera samples by ELISA. As regards protection against hyperacute rejection, using the hemolysis assays (classical APA and RTCA assay) there was difference comparing CF+ and CF- animals. By means of APA assay, there was significant higher hemolysis percentage comparing CF+, CF- and wild phenotype pigs. There was also higher hemolysis in the second blood sampling compared to the first one. The presence of red blood cells in tissue samples could explain this effect. So, in the CF+ animals would have a certain number of red blood cells of human origin avoiding the effect of anti-alpha-gal antibodies. The difference between the first and the second blood sampling would corroborate again the decrease of the human origin cells in the chimeric animals.
Open Access
Papel del ácido fosfatídico generado por la enzima fosfolipasa D2 en la formación de túbulos del complejo de Golgi
(2015-03-25) Martínez Martínez, Narcisa; Martínez Alonso, Emma; Martínez Menárguez, José Ángel; Facultad de Medicina
INTRODUCCIÓN: Las vesículas y los túbulos son los intermediarios de transporte (ITs) que regulan el flujo de membrana a través de la vía secretora y endocítica. A diferencia de las vesículas, poco se conoce sobre los mecanismos de formación de los túbulos. Cada vez más estudios apuntan a que los lípidos y las enzimas modificadoras de lípidos tienen un papel muy importante en la formación, mantenimiento y fisión de los intermediarios de transporte. Los glicerolípidos pueden jugar un papel importante en estos procesos reclutando proteínas a las membranas, modulando la función de estas o afectando directamente la curvatura de la membrana, Las proteínas relacionadas con la formación, mantenimiento y desacoplamiento de las proteínas de cubierta tipo I (COPI) también se han relacionado con la formación de túbulos. OBJETIVOS: El objetivo general de esta tesis doctoral fue el de avanzar en el conocimiento sobre el papel de los túbulos como ITs en la vía secretora temprana e identificar mecanismos moleculares y de regulación involucrados en el proceso de tubulación, más específicamente, en el papel de glicerolípidos y enzimas modificadoras de lípidos y de las cubiertas tipo COPI. METODOLOGÍA: Para llevar a cabo estos objetivos Para inducir la formación de túbulos derivados del aparato de Golgi las células HeLa se incubaron a baja temperatura (15ºC) y con la droga brefeldina A (BFA). Se usaron inhibidores específicos de enzimas implicadas en el metabolismo de lípidos de membrana para ver el efecto que producen sobre los túbulos mediante ensayos de inmunofluorescencia. Se determinó la localización de la enzima endógena fosfolipasa D2 (PLD2) en el complejo de Golgi mediante inmunocitoquímica ultraestructural. También, se analizó el efecto de la sobreexpresión y el silenciamiento génico de PLD2. CONCLUSIONES: De los resultados obtenidos se desprenden las siguientes conclusiones: 1. Las células HeLa incubadas a 15ºC son un buen modelo para estudiar el papel de glicerolípidos y enzimas modificadoras de lípidos en la formación de túbulos. 2. El ácido fosfatídico (PA) y el diacilglicerol (DAG) son necesarios para la formación y mantenimiento de los túbulos inducidos a 15ºC y BFA, respectivamente. 3. El PA generado por PLD es el más importante para la formación de los túbulos inducidos a baja temperatura. Este lípido está involucrado en un paso temprano de la formación y en la elongación de estos túbulos. 4. PLD2, pero no PLD1, es la enzima responsable de la formación del PA necesario en la tubulación inducida a baja temperatura. Esta enzima está asociada a las membranas del complejo de Golgi y está implicada en el mantenimiento de la arquitectura de este orgánulo. 5. La reducción del PA generado por PLD2 induce la formación de un tipo específico de túbulos que contienen proteínas de matriz. 6. El reclutamiento de ArfGAP1 en las membranas del complejo de Golgi es dependiente del PA generado por PLD2. ArfGAP1 podría ser un componente de la maquinaria molecular implicada en el reclutamiento de la carga en los túbulos. 7. Las membranas del complejo de Golgi son capaces de generar distintos tipos de túbulos con una composición específica. Cuando su actividad enzimática se ve potenciada o cuando la enzima se recluta en ciertas regiones del complejo de Golgi, el PA generado favorece la curvatura local de la membrana reclutando a ArfGAP1, el cual, a su vez, podría ser necesario para el reclutamiento de enzimas residentes. Por el contrario, cuando esta actividad enzimática es inhibida, podría haber una acumulación de DAG o ácido lisofosfatídico, podrían generar otro tipo de túbulos que contienen proteínas de matriz.. Se podría especular que algunos túbulos de Golgi podrían estar relacionados con el transporte retrógado intra-Golgi, mientras que otros mantienen la arquitectura de la cinta del Golgi o bien intervienen en el transporte anterógrado intra-Golgi. INTRODUCTION: Vesicles and tubules are the transport carriers that regulate membrane flux through the secretory and endocytic pathways. In contrast to vesicles, little is known about the mechanism of formation of Golgi tubules. An increasing body of evidence has pointed to the crucial importance of lipids and lipid-modifying enzymes in the biogenesis, maintenance and fission of transport carriers. Glycerophospholipids may play an important role in these processes, by mediating protein recruitment to membranes, modulating protein functions or by affecting membrane curvature directly. The proteins involved in the formation, maintenance and detachment of the coat protein I (COPI) have also been related to the formation of tubules. AIMS: The aim of the present study was to deepen our understanding of the molecular mechanisms that participate in Golgi tubule formation. More specifically, we analysed the role of glycerolipids and related enzymatic activities in the generation and/or maintenance of Golgi tubules as well as their relationship with the COPI machinery. METHODS: To perform these aims we used low temperature (15°C) and the drug brefeldin A (BFA) to induce the formation of Golgi tubules in HeLa cells. Immunofluorescence microscopy was used to visualize the effect of specific inhibitors of lipid modified enzymes in the formation of Golgi tubules. We assessed the localization of endogenous phospholipase D2 (PLD2) within the Golgi membranes by cryoimmunoelectron microscopy. Furthermore, PLD2-overexpressed and depleted cells we analysed. CONCLUSIONS: The results obtained after these studies rendered these conclusions: 1. Hela cells cultured at low temperature (15ºC) are an useful model to study the role of glycerolipids and lipid modified enzymes in the formation of Golgi tubules. 2. Phosphatidic acid (PA) and diacylglycerol (DAG) are needed for the formation and maintenance of low temperature- and BFA-induced Golgi tubules, respectively. 3. PA generated by PLD is the most important glycerolipids for the formation of low temperature-induced Golgi tubules. This glycerolipid may be involved in an early step of the budding process as well as in the tubule elongation. 4. PLD2, but not PLD1, is the enzyme responsible for the formation of PA needed in the low temperature model of Golgi tubulation. This enzyme is associated to Golgi membranes and is involved in the maintenance of the architecture of this organelle. 5. The reduction of the levels of the PA generated by PLD2 induces the formation of a specific set of Golgi tubules containing matrix proteins. 6. ArfGAP1 recruitment to the Golgi membranes depends on the presence of the PA generated by PLD2. This protein might be a component of the molecular machinery involved in cargo recruitment into Golgi tubules. 7. Golgi membranes are able to generate different types of tubules of varied composition. When PLD2 enzymatic activity is enhanced or the enzyme is recruited to certain Golgi areas, the PA generated is able to bend the membrane and to recruit ArfGAP1, which might be necessary for the recruitment of resident enzymes. Conversely, when its activity is inhibited, there is an accumulation of DAG or lisophosphatidic acid, which might generate another type of tubule containing matrix proteins. It can be speculated that some Golgi tubules may be involved in retrograde intra-Golgi traffic, whereas others keep the architecture of the Golgi ribbon or anterograde intra-Golgi transport.
Open Access
Trasplante de células mesenquimales fucosiladas en el tratamiento de la osteoporosis. Estudio preclínico y prueba de concepto
(2014-06-27) Cabañas Perianes, Valentín; García Hernández, Ana Mª; Gomez Espuch, Joaquín; Moraleda Jiménez, José María; Facultad de Medicina
Objetivos: La osteoporosis es una enfermedad ósea definida por la pérdida de masa ósea generalizada con un elevado riesgo de fracturas óseas asociado a una alta morbimortalidad. Las Células Stem Mesenquimales (CSM) de médula ósea (MO) pueden representar un tratamiento óptimo para la osteoporosis debido a su capacidad innata de diferenciación a osteoblastos. Aunque el injerto de las CSM ha sido demostrado, su tropismo óseo es bajo cuando se administran de forma intravenosa, imprescindible para el tratamiento de esta enfermedad sistémica. Su tropismo depende de la interacción de sus receptores de superficie con los que se encuentran en las células endoteliales. La proteína E-selectina es inducida en el endotelio de la microvasculatura de tejidos inflamatorios en respuesta a citoquinas y es constitutivamente expresada en las células endoteliales de MO. La glicoforma de CD44 (HCELL), un potente ligando de E y L-selectina, es expresada de forma innata por las Células Stem Hematopoyéticas (CSH). HCELL es la molécula clave para el reclutamiento celular hacia la MO. Las CSM expresan CD44 pero no HCELL ni otros ligandos de E-selectina de forma constitutiva. La fucosilación (adición de una fucosa) ex vivo en posición α1,3 del antígeno CD44 mediante la enzima fucosiltransferasa VI (FTVI) produce HCELL en las CSM, incrementando su afinidad por E-selectina y por tanto su osteotropismo. EL objetivo de este estudio preclínico es evaluar la seguridad y la eficacia de las CSM humanas fucosiladas en un modelo murino inmunocomprometido (NOD/SCID). Métodos: 31 ratones NOD/SCID fueron randomizados a recibir de forma intravenosa: 1x106 CSM fucosiladas (n=13), 1x106 CSM (n=14), o salino (n=4). Las toxicidades fueron evaluadas por un score clínico, peso y un examen histológico (corazón, pulmón, hígado, bazo, riñón, gónadas, cerebro, hueso y MO). Se realizó estudio de biodistribución mediante detección de los genes β-actina y β2-microglobulina humanas. La integridad genética fue evaluada por cariotipo. Se realizó inmunohistoquímica con un anticuerpo policlonal anti-Osteocalcina humana para valorar eficacia. Las células osteocalcina positivas fueron identificadas por un precipitado citoplasmático de color marrón oscuro. Resultados: No se produjo ningún fallecimiento inesperado y ningún ratón mostró toxicidad aguda. Un ratón en el brazo de salino presentó toxicidad crónica leve (piloerección y cambios moderados en el comportamiento). La histología de corazón, hígado, bazo, riñón, cerebro, hueso y MO fue normal en todos los ratones. Se objetivaron áreas localizadas inflamatorias en los pulmones de un 15%, 42% y 25% de los ratones infundidos con CSM fucosiladas, CSM y salino respectivamente sin diferencias significativas (p=0.28). La biodistribución fue normal en todos los ratones con la excepción de un ratón (infundido con CSM sin fucosilar) que mostró expresión de ARN humano (β-actina and β2-microglobulina) en la muestra pulmonar tomada a las 12 semanas después de la infusión. Se observaron osteoblastos en el 100% de los ratones infundidos con CSM fucosiladas, en 62,5% de los infundidos con CSM, y ninguno en el grupo de salino (p=0.01). Los ratones infundidos con CSM fucosiladas presentaron un mayor número de osteoblastos osteocalcina positivos en 10 campos de gran aumento (400x) de secciones de tibia y calota con respecto a los infundidos con no fucosiladas (32 vs 5.5) (p=0.0082). Las CSM fucosiladas. Los osteoblastos humanos fueron detectados en el hueso desde la quinta a la doceava semana post-infusión. Conclusiones: Nuestro ensayo preclínico demuestra que la infusión intravenosa de CSM fucosiladas es segura y eficaz en guiar las células al hueso con un potencial más elevado de osificación en ratones NOD/SCID que las CSM no fucosiladas. Estos resultados van a permitir comenzar con un Ensayo clínico en humanos con CSM fucosiladas. ABSTRACT Objectives: Osteoporosis is a skeletal disease characterized by systemic bone loss with an increased risk to bone fractures, associated with high morbidity and mortality. Mesenchymal stem cells (MSC) from bone marrow (BM) are ideal candidates for the treatment of osteoporosis because they are able to differentiate to osteoblasts. Although bone graft of MSCs has been demonstrated, its osteotropism is low when they are administered intravenously (IV), of choice in this multifocal disease. MSC homing depends upon the adhesive interaction between MSC surface receptors and counter receptors on endothelial cells. E-selectin protein is induced on microvascular endothelium in inflammatory tissues in response to cytokines and it is constitutively expressed in BM endothelial cells. The Hematopoietic cell E and L-selectin ligand (HCELL), a glycoform of CD44, is a potent E-selectin ligand expressed constitutively in the Hematopoietic stem cells (HSC). HCELL represents the key to involve in cell recruitment to the BM. MSC express CD44 but do not express HCELL or other E-selectin ligands. Ex vivo fucosylation (adding a fucose residue) in α1-3 position of the CD44 antigen by use of the enzyme fucosyltransferase VI (FTVI) yields HCELL in MSC increasing the affinity for E-selectin and osteotropism. The aim of this preclinical study was to describe the safety and efficacy of human fucosylated MSC infused in an immunocompromised mice model (NOD/SCID). Methods: 31 NOD/SCID mice were randomized to by tail vein injection: 1x106 fucosylated MSC (n=13), 1x106 MSC (n=14) or saline (n=4). Toxicities were evaluated by a clinical score, weight and histological assessment (heart, lung, liver, spleen, kidney, gonads, brain, bone and BM). RT-PCR array-based evaluation of the expression of human β-actin and β2-microglobulin genes was performed to study biodistribution of MSC. The maintenance of genetic integrity was evaluated during in vitro culture by karyotype. Additional samples of tibia and calota were to immunostained with a polyclonal Rabbit anti-human osteocalcina to demonstrate efficacy. Osteocalcin-positive cells were identified by a dark-brown cytoplasmic precipitate. Results: There was no unexpected death and none of the mices had any acute toxicity. One mouse in the saline arm had mild chronic toxicity primarily manifested as piloerection, and moderate changes in behavior. The histology of heart, liver, kidney, spleen, gonads, brain, bone and bone marrow was normal in all mice. There were localized areas of lung inflammation in 15%, 42% and 25% of mice infused with fucosylated MSC, MSC, and saline, respectively without significance differences (p=0.28). Biodistribution was normal with except one mice (infused with MSC non-fucosylated) showed an expression of human RNA β-actin and β2-microglobulin in the lung sample taken after 12 weeks of intravenous infusion .Osteoblasts were seen in 100% of mices infused with fucosylated MSC, in 62.5%% of animals infused with MSC alone, and none in saline group (p=0.01). NOD/SCID mice infused with fucosylated MSC presented a higher number of osteoblasts positive for osteocalcin in 10 high-power fields (400x) of tibia and calvarium sections that non-fucosylated (32 vs 5.5) (p=0.0082). Human osteoblasts were detected inside the bone from the fifth to the twelfth week after infusion. Conclusions: Our preclinical trial demonstrate that the intravenous infusion of human fucosylated MSC is safe and effective in guiding the cells to bone with a higher potential to ossification in NOD/SCID mices that non-fucosylated MSC. These results are allowing to start a human clinical trial with intravenous fucosylated MSC as treatment in patients with osteoporosis.

Browsing by Subject "Células"

Results Per Page

Sort Options