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Adaptación del metabolismo central en el mantenimiento de la homeostasis en ambientes hipersalinos : caso del halófilo Chromohalobacter salexigens
(2016-02-09) Pastor Hernández, José María; Bernal Sánchez, Vicente; Cánovas Díaz, Manuel; Facultad de Química
Objetivos: (i) Esbozar una imagen general del metabolismo central de C. salexigens a partir de la información del genoma, (ii) determinar los principales flujos extracelulares (asimilación de carbono, excreción de subproductos) y de síntesis de sus solutos compatibles, las ectoínas, y analizar el efecto de la salinidad sobre dichos flujos empleando fuentes de carbono marcadas isotópicamente, (iii) estudiar el efecto de la composición del medio (en términos de ratio C/N y tipo de fuente de nitrógeno) sobre los flujos metabólicos, síntesis de ectoínas/biomasa y excreción de subproductos y aplicar esta información en el diseño de una estrategia de cultivo que maximice la producción de biomasa/ectoínas, (v) analizar el efecto del uso de fructosa como fuente de carbono sobre la fisiología de C. salexigens y (vi) identificar las rutas de consumo de fructosa y demostrarlas experimentalmente. Metodología: Se aplicó HPLC para identificación y cuantificación de metabolitos y ectoínas, 13C-RMN para cuantificación de ectoínas y rastreo de marcaje isotópico y 31P-RMN para medida de actividad enzimática en extractos crudos. Se usaron métodos espectrofotométricos para medida de actividades enzimáticas (en extractos crudos y en proteínas purificadas). Se aplicó RT-PCR en determinaciones de expresión génica y técnicas de biología molecular en la clonación y expresión heteróloga de genes de C. salexigens en E. coli. Resultados: Se llevan a cabo cultivos crecidos en glucosa a diferentes salinidades que muestran una menor eficacia metabólica a baja salinidad, en forma de metabolismo overflow (excreción de piruvato y acetato), menor síntesis de biomasa y mayor velocidad de consumo de glucosa. Los estudios con glucosa marcada con 13C indican que i) C. salexigens carece de ruta glucolítica funcional, metabolizando la glucosa casi exclusivamente mediante la ruta de ED, debido a la probable falta de una enzima Pfk funcional, ii) el nivel de anaplerosis es alto en comparación con microorganismos relacionados, iii) algunos flujos relativos clave del metabolismo central no se alteran con la salinidad, lo que implica una rigidez metabólica que podría justificar la presencia de overflow a baja salinidad. En cultivos con distintas ratios C/N, se observa un mayor nivel de overflow en ratios C/N altas (fuente de nitrógeno limitante). La eficacia en síntesis de ectoínas es mayor en medio con menor cantidad de fuente de carbono (glucosa) y de nitrógeno (amonio). Estos resultados se aplican al diseño de una estrategia de cultivo fed-batch en dos fases, con la que se consigue alcanzar alta densidad celular y eliminar el overflow. La ratio C/N no afecta a las ratios de flujos centrales confirmando la rigidez metabólica. En cultivos con fructosa como fuente de carbono se observa la ausencia de overflow y mayor síntesis de biomasa. El empleo de fructosa marcada con 13C confirma la presencia de dos rutas para el catabolismo de la fructosa en C. salexigens: la ruta de ED, mayoritaria, y la ruta de EMP que contribuye en un 15-20% del flujo. Conclusiones: La glucólisis no es funcional debido a la carencia de Pfk, y la glucosa se asimila mediante la ruta de ED, más eficaz en producción de NADPH; existe un alto nivel de anaplerosis. Estos datos apuntan a una adaptación al gran esfuerzo anabólico para síntesis de ectoínas. El metabolismo central del carbono es rígido, sus flujos relativos no varían con la salinidad, ni con la proporción C/N en el medio. Esta rigidez hace el metabolismo menos eficiente en medios pobres en fuente de nitrógeno y con baja salinidad. Esto indica una adaptación a ambientes pobres en nutrientes. Las condiciones en las que el metabolismo es menos eficiente dan lugar a un menor crecimiento, y la aparición de metabolismo overflow. C. salexigens metaboliza la fructosa mediante dos rutas: las rutas de ED y EMP. ED es mayoritaria, debido a las altas necesidades de cofactores reducidos. La disponibilidad adicional de la ruta de EMP hace al metalismo en fructosa más eficiente que en glucosa, lo que se traduce en ausencia de overflow en fructosa, y mayor síntesis de biomasa. Objectives: (i) Drawing a draft of central metabolism from C. salexigens based on the annotated genome, (ii) assessing the main extracellular fluxes (carbon source uptake, by-products excretion) and the synthesis of the main compatible solutes, ectoines, and analyzing the effect of salinity on such fluxes using isotopically labeled carbon sources, (iii) studying the effects of medium composition (as C/N ratio and nitrogen source) on metabolic fluxes, biomass/ectoines synthesis and by-products excretion and applying this information to devise a culture strategy able to maximize biomass/ectoines production, (v) analyzing the effect of fructose as carbon source on the C. salexigens physiology and (vi) identifying the pathways for fructose uptake and give experimental evidence of them. Methodology: HPLC was applied to identify and quantify metabolites and ectoines, 13C-NMR for ectoines quantification and isotopic label tracing and 31P-NMR for assessing enzyme activities on crude extracts. Spectrophotometric methods were applied for measuring enzyme activities (both in crude extracts and purified proteins). RT-PCR was used in gene expression experiments and molecular biology techniques for cloning and heterologous expression of genes from C. salexigens in E. coli. Results: Glucose grown cultures were performed at different salinities, showing a less efficient metabolism at low salinity as overflow metabolism (pyruvate and acetate excretion), lower biomass synthesis and higher glucose uptake rate. Studies using 13C-labeled glucose show that i) C. salexigens lacks a functional glycolytic pathway, and metabolizes glucose almost exclusively through ED pathway, which is likely due to the lack of Pfk enzyme, ii) high anaplerosis levels, compared to related microorganisms, iii) certain key flux ratios from central metabolism were not affected by salinity, involving a metabolic rigidity which could explain the presence of overflow at low salinity. Higher overflow levels are shown by cultures grown on a higher C/N ratio (limiting nitrogen source). Ectoines synthesis yield is higher when growing in media with low carbon (glucose) and nitrogen (ammonium) sources content. These results are applied to devising a two-step fed-batch culture strategy, which allowed reaching high cell density and overflow removal. C/N ratio did not affect central metabolism flux ratios, further confirming the metabolic rigidness. Lack of overflow and higher biomass yields are shown by fructose grown cultures. Using 13C-labeled fructose confirmed the existence of two alternative pathways for fructose uptake in C. salexigens: ED pathway which contributes to 80-85% of fructose uptake flux, and EMP pathway for the remaining part of carbon flux. Conclusions: Glycolysis is not present due to lack of Pfk enzyme, thus, glucose must be assimilated through ED pathway, which is more efficient in NADPH production; anaplerosis is relatively high. These results suggest C. salexigens has adapted to meet the high biosynthesis needs posed by salinity. Central metabolism is rigid, as central flux ratios were not affected by salinity or C/N ratio in growth medium. Such rigidity makes metabolism less efficient in low nitrogen and low salinity growth media. This could be understood as an adaptation to grow in nutrient-poor environments. Environmental conditions where central metabolism is less efficient lead lower growth yield due to overflow metabolism. C. salexigens can metabolize fructose by means of two different routes: ED and EMP pathways. Most of fructose is assimilated by ED pathway, due to high cofactor synthesis needs. The availability of an additional EMP route makes fructose metabolism more efficient than glucose metabolism, resulting in lack of overflow and higher biomass yields in fructose.
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Análisis comparativo de la morfometría, microbiota y efectos de la endogamia en poblaciones globales de Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae)
(Universidad de Murcia, 2025-10-06) Ramos Martínez, Ángel; Galián Albaladejo, José; Sin departamento asociado; Escuelas::Escuela Internacional de Doctorado
La presente tesis tiene como objetivo principal analizar, cuantificar y caracterizar los cambios morfológicos, productivos, reproductivos y microbiológicos en la especie Tenebrio molitor, considerando su origen geográfico y cría. Se evaluaron variables como peso, longitud, coloración, presencia de malformaciones, parámetros reproductivos, morfología y microbiota intestinal. Un segundo objetivo fue explorar las aplicaciones prácticas de estas diferencias en el sector productivo, especialmente en la explotación del vigor híbrido, la selección de líneas con características favorables y la utilización de cepas bacterianas beneficiosas para mejorar el rendimiento, la sanidad y la seguridad alimentaria. La metodología se estructuró en seis capítulos. El primero consistió en una revisión sistemática sobre la cría intensiva de insectos y las consecuencias de la consanguinidad en campos reproductivos, productivos, hormonales, genéticos e inmunológicos. El segundo abordó el cruce de diferentes poblaciones de T. molitor de distintos orígenes, evaluando parámetros productivos como número de descendientes y velocidad del ciclo. El tercero analizó variaciones morfológicas entre poblaciones globales mediante morfometría geométrica. El cuarto estudió la composición de la microbiota intestinal en poblaciones silvestres, industriales y tradicionales, mientras que el quinto examinó cómo distintas dietas, suplementadas con carpóforos y micelio de hongos, modifican la microbiota en una misma población. Finalmente, el sexto evaluó el efecto probiótico de Pediococcus pentosaceus frente a patógenos, verificando su potencial como suplemento en la cría intensiva. Las conclusiones reflejan la importancia de integrar enfoques genéticos, morfológicos y microbiológicos en la producción de T. molitor. En primer lugar, se confirma el impacto negativo de la endogamia: menor éxito reproductivo, debilitamiento inmunológico, reducción de la diversidad genética y aumento de malformaciones. Al mismo tiempo, se destaca el valor estratégico de las poblaciones silvestres, con alta variabilidad genética y fenotípica, para contrarrestar los efectos de la consanguinidad. En relación con la variabilidad morfológica, la morfometría geométrica se consolidó como herramienta eficaz para diferenciar poblaciones según origen y sistema de cría. Se observó que la domesticación y la intensificación reducen la diversidad morfológica, lo cual puede limitar la adaptabilidad de las colonias en contextos productivos. Asimismo, la dispersión histórica de la especie pudo reconstruirse parcialmente a partir de evidencias morfológicas, vinculando su expansión con la agricultura y el comercio. El estudio de la microbiota intestinal mostró una fuerte influencia del origen y del sistema de cría. Las poblaciones tradicionales exhibieron mayor diversidad bacteriana, mientras que los sistemas industriales tendieron a empobrecerla, con efectos potencialmente negativos en digestión, inmunidad y resiliencia. La dieta también resultó determinante: la inclusión de micelio de Lentinula edodes en niveles moderados favoreció comunidades bacterianas equilibradas, mientras que altas proporciones de carpóforo promovieron estados de disbiosis asociados a Enterobacteriaceae. Estos hallazgos subrayan la necesidad de diseñar estrategias nutricionales que consideren la microbiota como objetivo central de manejo. Por último, la suplementación con P. pentosaceus demostró un doble beneficio. Mejoró discretamente parámetros productivos, y en presencia de patógenos redujo la mortalidad y los daños sobre el desarrollo. Se identificaron, además, posibles aplicaciones industriales derivadas de la modificación del exoesqueleto asociada a la suplementación. En conjunto, el uso de este probiótico se perfila como una herramienta sostenible, escalable y eficaz para reforzar la productividad y bioseguridad en la industria entomológica. Esta tesis evidencia que la optimización de la cría de T. molitor requiere un enfoque integral que combine la gestión genética, morfológica y microbiológica. La integración de estrategias basadas en vigor híbrido, selección de líneas, manipulación nutricional y uso de probióticos permite no solo mejorar la eficiencia y la resiliencia de las colonias, sino también garantizar su sostenibilidad en el marco de la producción animal y la bioeconomía moderna.
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Análisis genético y molecular de un transductor de la señal luminosa en la bacteria Myxococcus xanthus / Liliana Galbis Martínez; directores Francisco J. Murillo Araújo, Marta Fontes Bastos.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Genética y Microbiología,, 2005) Galbis Martínez, Liliana
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Aplicación de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (RPCV) en la reforestación de zonas semiáridas = Application of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) in the revegatation of semiarid areas
(2015-05-12) Mengual Navarro-Soto, Carmen María; Roldán Garrigos, Antonio; Schoebitz Cid, Mauricio Iván; Facultad de Biología
En las zonas semiáridas mediterráneas del sureste de España, las escasas e irregulares precipitaciones, y un largo y seco periodo de verano han contribuido drásticamente a la aceleración de los procesos de degradación del suelo. Los cambios ambientales como consecuencia de la pérdida de las comunidades naturales de plantas, vienen a menudo acompañados o precedidos por la degeneración de las propiedades físicas y químicas del suelo, además de por una pérdida o reducción de la actividad microbiana. Actualmente se acepta que la diversidad y actividad de la microbiota del suelo es la base de uno de los mecanismos que más contribuyen a la conservación del suelo, al desarrollo y mantenimiento de la cubierta vegetal y por ende, a la estabilidad y funcionamiento del ecosistema. Así pues, el objetivo principal de este trabajo fue evaluar, en áreas degradas, la eficacia de diversas cepas de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (RPCV) junto a la aplicación de enmiendas orgánicas sobre el desarrollo de la cubierta vegetal y la calidad de las propiedades del suelo, así como verificar la efectividad como RPCV de varias cepas de actinobacterias, previamente aisladas de diferentes suelos de la Región de Murcia. Con este fin, se llevaron a cabo cinco ensayos diferentes: tres de ellos en condiciones de campo, utilizando diferentes enmiendas orgánicas y RPCV, un cuarto ensayo consistente en el aislamiento de cepas de actinobacterias de la rizosfera de un arbusto autóctono presente en dos localidades diferentes de la Región de Murcia, Rhamnus lycioides L. y un quinto y último ensayo focalizado en la verificación como RPCV de las cepas de actinobacterias previamente aisladas así como el estudio de la incidencia relativa del de origen de las cepas y el suelo sujeto a plantación en la efectividad de las mismas. En todos los experimentos desarrollados en condiciones de campo, se evaluaron tanto el crecimiento y la absorción de nutrientes por parte de la planta, así como las respuestas al estrés originado por la escasez de agua. Del mismo modo, se determinaron las propiedades físico-químicas, químicas y biológicas del suelo. Con respecto al ensayo de aislamiento de actinobacterias de suelo rizosférico, se llevaron a cabo diversas técnicas que permitieron aislar y purificar diferentes cepas, así como caracterizarlas e identificarlas. Como resultados principales del trabajo, se puede destacar que en los tres primeros ensayos, las rizobacterias empleadas promovieron, satisfactoriamente, el crecimiento de las plantas así como la absorción de nutrientes y su tolerancia al estrés. En el primer experimento, en el que se ensayó sobre Cistus albidus L. una mezcla de dos rizobacterias inmovilizadas en arcilla (Azospirillum brasilense y Pantoea dispersa) como inoculante microbiano y residuo de oliva como enmienda, se observó un efecto aditivo en el tratamiento combinado, consistente en la inoculación microbiana y la adición del residuo orgánico al mismo tiempo, que permitió acrecentar las propiedades bioquímicas y microbiológicas del suelo. En el segundo ensayo en campo, en el que se probaron las mismas rizobacterias y la misma enmienda sobre Pinus halepensis Mill., se determinó que la eficacia de la inoculación microbiana fue el tratamiento más efectivo sobre el desarrollo de la planta y sobre las propiedades del suelo. El tercer ensayo se desarrolló para verificar la eficacia de diferentes cepas libres de RPCV (Bacillus megaterium, Enterobacter sp., Bacillus thuringiensis y Bacillus sp.) y la adición de residuo de remolacha azucarera compostado como enmienda orgánica sobre Lavandula dentata L. En este caso, la selección de las rizobacterias efectivas y la combinación de su inoculación junto con la aplicación de la enmienda orgánica se consideró el punto crucial del que dependería la eficacia de esta técnica de revegetación. Con respecto al cuarto ensayo, desarrollado en condiciones de laboratorio, la metodologías utilizadas para el aislamiento caracterización e identificación de diferentes especies de actinobacterias se consideraron las adecuadas, obteniéndose cuatro cepas pertenecientes al género Streptomyces que reunían las condiciones necesarias para ser consideradas potenciales RPCV. En el quinto y último ensayo, en condiciones de campo, se determinó que las bacterias previamente aisladas preservaban las habilidades descritas en condiciones de laboratorio, verificándose su rol como RPCV. Sin embargo, deberían considerarse tanto el origen de la cepa como la fertilidad biológica del suelo sujeto a plantación como factores fundamentales para la selección de cepas de actinobacterias destinadas a uso en revegetación en ambientes semiáridos. Summary In Mediterranean semiarid zones of Southeast Spain, limited and irregular rainfalls and a long and dry summer periods have contributed drastically to the acceleration of soil degradation processes. Environmental changes as a consequence of loss of natural plant cover are often accompanied by the physical and chemical soil properties degeneration, and by a loss or reduction of microbial activity. It is a corroborated fact that the proper functioning and stability of terrestrial ecosystems depends, to a large extent, of the diversity and composition of their vegetal cover. However, the ecological mechanisms that adjust and maintain the peculiar diversity of plant species in an ecosystem throughout the time are only known in a fragmentary way. Nowadays, it is permissible to think that the soil microbiota diversity and activity constitute the basis of one of the mechanisms that influences on soil preservation, on the development and maintenance of the vegetal cover and, consequently, on the ecosystem stability and functioning. The main objective in this Thesis was to evaluate, in degraded areas, the effectiveness of diverse plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) strains and the addition of an organic waste on plant performance and on the soil quality properties, as well as to verify the efficacy of some actinobacteria strains as PGPR, previously isolated from different soils of Murcia. So, five different assays were developed: three field experiments involved the use of different organic amendments and PGPR strains; a fourth assay based on the isolation of different actinobacterial strains from the rhizosphere of an autochthonous shrub, that occurs naturally in two distinct sites of Murcia, Rhamnus lycioides L. and a fifth and last experiment focused on the verification as PGPR of the previously isolated actinobacteria strains as well as the study of the relative incidence of both the strain origin and the characteristics of soil subjected to plantation. In the entire field assays it was evaluated the plants growth, nutrients uptake and the biochemical and/or physiological responses of the plants. The physical, physico-chemical and biological soil properties were also determined. With regard to the experiment focused to the actinobacteria isolation from rhizosphere soil, diverse techniques were carried out allowing isolating and purifying different strains as well as to characterise and identify them. The main results obtained in this Thesis can be summarised as follows: in the assays developed under field conditions, the assayed PGPR satisfactory promoted the plant growth, the nutrients uptake and the tolerance to water stress. In the first assay, it was tested the addition of a mixture of two immobilised PGPR in clay pellets (Azospirillum brasilense and Pantoea dispersa) as microbial inoculant and olive mill residue as organic amendment on the target plant Cistus albidus L., it was observed an additive effect in the combined treatment consisting of the microbial inoculation and the organic amendment applied jointly, allowing to enhance biochemical and microbiological soil properties. In the second field experiment, developed by using the same PGPR and organic residue than in the previous assay, it was determined that the most effective treatment to improve Pinus halepensis Mill. plant performance and soil conditions was the microbial inoculation. The third experiment was developed to verify the effectiveness of diverse PGPR free strains (Bacillus megaterium, Enterobacter sp., Bacillus thuringiensis and Bacillus sp.) and the application of sugar beet residue as organic amendment Lavandula dentata L. performance as target plant. The selection of the most efﬁcient rhizobacteria strains and their combined effect with organic residue seems to be a critical point that drives the effectiveness of using these biotechnological tools in revegetation tasks. Regarding the fourth experiment, developed under laboratory conditions, the methodologies used to the actinobacteria isolation, characterisation and identification were successful. Four strains belonging to genus Streptomyces were obtained and they met the required abilities to consider them PGPR. The actinobacteria strains were tested in a fifth assay developed under field conditions being observed that the PGPR capacities were preserved. However, the strain origin and the biological fertility of plantation soil must be considered to an adequate actinobacteria strain selection to be used in restoration programs under semiarid conditions.
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Assessment of risk factors affecting the microbial safety of leafy greens in Spain = Evaluación del riesgo microbiano en la producción y el procesado de hortalizas de hoja
(2016-07-01) Castro Ibáñez, Irene; Allende Prieto, Ana; Gil Muñoz, Mª Isabel; Escuela Internacional de Doctorado
La presente tesis está destinada a proporcionar una visión general de los principales riesgos microbiológicos asociados a las hortalizas de hoja durante su producción, cosecha y procesado, así como los posibles microorganismos indicadores capaces de predecir o dar una estimación de la posible contaminación con microorganismos patógenos en hortalizas de hoja. La primera parte de esta tesis se centra en los principales factores que afectan a la seguridad microbiana de las hortalizas de hoja a nivel de producción primaria. En el Capítulo 3 se evaluó el efecto de los factores agrícolas y las condiciones meteorológicas en la seguridad microbiana de hortalizas de hoja en España. En este trabajo, se identificaron el suelo y el agua de riego como los factores más importantes que afectan a la seguridad microbiana de la ‘espinaca baby’. Respecto a los factores climáticos, se observó que la temperatura ambiente afectaba la probabilidad de la contaminación de la ‘espinaca baby’. En el Capítulo 4 se estudió el efecto de las precipitaciones extremas sobre la seguridad microbiana de hortalizas de hoja. En este sentido, se encontró que las muestras de suelo, el agua de riego y hortalizas de hoja tomadas de campos afectados por la inundación estaban contaminados con altos niveles de E. coli y patógenos. Este estudio corroboró estudios previos que identificaban las inundaciones como importantes factores de riesgo para la contaminación microbiana de hortalizas de hoja. Por otro lado, se puso de manifiesto que las condiciones climáticas, sobre todo, la radiación solar juegan un papel importante reducción de la supervivencia microbiana en el campo. Con los resultados obtenidos, en el Capítulo 5 se desarrolló un modelo de análisis cuantitativo de riesgos microbiológicos para la evaluación de la exposición microbiana de E. coli en ‘espinaca baby’ al nivel de producción primaria en España. Este modelo se usó para evaluar el impacto potencial de factores climáticos y prácticas agrícolas en la distribución de E. coli en el momento de la cosecha. Conjuntamente, los resultados confirmaron el impacto tanto de los factores climáticos como de las prácticas agrícolas en la contaminación de las hortalizas de hoja con E. coli. Adicionalmente, se puso de manifiesto que la aplicación de medidas preventivas dirigidas a dichos factores y prácticas de riesgo podría reducir considerablemente el riesgo de contaminación. Por lo tanto, el modelo resultó un método útil para evaluar el impacto potencial de los diferentes factores de riesgo y las estrategias de intervención que afectan a las concentraciones de E. coli en el campo. El Capítulo 6 se centra en los riesgos microbiológicos asociados al procesado de hortalizas de hoja. En este estudio, se obtuvo una visión global de la contaminación microbiana en todas las operaciones que implica el procesado de hortalizas de hoja. A este respecto, se encontró que las muestras de agua obtenidas de la centrifuga eran positivas tanto para E. coli genérica como para microorganismos patógenos, sugiriendo el posible origen de la contaminación en el producto sometido a centrifugación o en el agua de lavado. El Capítulo 7, se centra en el último paso de la cadena del ‘campo a la mesa’: el consumidor. Primero, se evaluó la validez de los datos existentes referentes al consumo de frutas y hortalizas frescas en España y Bélgica, llegando a la conclusión de que la información disponible sobre el consumo real y detallado de diferentes tipos de productos frescos así como las prácticas de manipulación de los mismos era deficiente. Por lo tanto, se proporcionaron datos estandarizados para el consumo de productos frescos destinados a ser consumidos crudos o mínimamente procesados. Estos datos podrían ser de gran utilidad en futuros estudios de evaluación de la exposición a diferentes riesgos tanto químicos como microbiológicos con productos frescos listos para el consumo (por ejemplo, hortalizas de hoja). En el Capítulo 8, se discuten los principales resultados de esta tesis y se plantean nuevas perspectivas para futuras investigaciones. Summary The current thesis intended to provide an overview of the prevalence of the main microbial hazards commonly linked to leafy greens during production, harvesting and processing, as well as potential indicator microorganisms able to predict faecal contamination in leafy greens. In order to introduce the research area, a literature review of the relevant aspects and the latest publications related to safety of leafy greens from the cultivation field to consumption was presented in Chapter 1. The first part of the present thesis is focused on the main factors affecting the microbial safety of leafy greens at primary production level. Firstly, Chapter 3 evaluated the effect of agricultural factors and meteorological conditions on the microbial safety of leafy greens in Spain. In this study, soil and irrigation water were found to be the most important factors affecting the microbial safety of baby spinach. Concerning weather factors, it was suggested that ambient temperature affected the likelihood and extent the contamination of baby spinach. In relation to specific weather factors, Chapter 4 studied the effects of extreme rainfall on the microbial safety of leafy greens together with the influence of subsequent weather parameters on the microbial persistence in soil, water and leafy greens. It was found that soil, irrigation and leafy greens samples taken from the floodplains after the event were contaminated with high levels of E. coli and pathogens. The main findings obtained in this Chapter confirmed previous research, which described flooding as a main risk factor for the microbial contamination of leafy greens and highlighted the need for mitigation strategies to protect production areas from incidents capable of releasing microbial contamination. It was also shown that climatic conditions, especially, solar radiation played an important role reducing the microbial survival on the crop. In Chapter 5, mayor findings from chapters 3 and 4 together with a literature review of relevant publications were used to develop a quantitative microbial exposure assessment model of generic E. coli in baby spinach at primary production level in Spain. Once the model was built, it was used to evaluate the potential impact of weather and agricultural practices on the distribution of generic E. coli levels on leafy greens at harvest. Jointly, our results confirmed that weather factors and management practices influenced the likelihood of leafy greens contamination with E. coli and what intervention strategies aimed at such factors and practices could reduce the risk of pre-harvest contamination. Thus, QMEM was a useful approach to assess the potential impact of different risk factors and intervention strategies affecting E. coli concentrations at the field. Once the main risk factors for microbial contamination at field level were recognized, the next step was taken towards processing level. In this sense, Chapter 6 was focused on microbial risks associated to the processing of leafy greens. The main purpose was to gain insight into the bacterial contamination throughout the operations involved in leafy green processing in order to identify critical sampling points and their relation with the microbial safety of end products. Samples of centrifuge water were found to be positive for both, pathogens and generic E. coli, which suggested that the origin of the contamination could be the produce subjected to centrifugation or the remaining process wash water. In Chapter 7, the focus was made on the last step of the farm-to-fork chain: consumers’ level. Firstly, the suitability of exiting data on the consumption of fresh fruit and vegetables was evaluated and it was established that detailed information about actual consumption of different types of fresh produce and the corresponding handling practices used by consumers at home was lacking. Therefore, this chapter was intended to provide standardized data for fresh produce consumed raw or minimally processed that could be used in future exposure assessments related to fresh produce. In Chapter 8, the main results of this thesis together with the future needs and perspectives resulting from this work were discussed.
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Bacteriemias en un hospital clínico universitario : influencia de la vigilancia activa por el especialista clínico de infecciosas en su evolución: estudio prospectivo 2010-2011
(2015-07-09) Hernández Contreras, María Encarnación; Gómez Gómez, Joaquín; García Vázquez, Elisa; Departamento de Medicina Interna
Justificación y objetivos del estudio: Las bacteriemias constituyen los procesos infecciosos más importantes de los hospitales clínicos universitarios por su elevada frecuencia y tasa de morbi-mortalidad. Por ello es importante estructurar programas para mejorar su diagnóstico e instaurar tratamientos precoces y adecuados en aras de lograr una disminución de su mortalidad. Los objetivos de este trabajo son: 1.- Análisis descriptivo de las bacteriemias en un hospital clínico universitario. 2.- Definir los factores pronósticos asociados a peor evolución. 3.- Determinar la influencia de la vigilancia activa por el especialista clínico de Infecciosas en su evolución. Metodología: Realizamos un estudio observacional longitudinal y prospectivo en el que se evaluaron los historiales clínicos de los pacientes adultos que habían desarrollado una bacteriemia, en los que el Servicio de Microbiología había proporcionado una información precoz de forma telefónica. El período de reclutamiento fue desde Junio de 2010 hasta Junio de 2011. De los 363 episodios de bacteriemia documentados se incluyeron en el estudio 324 episodios. De estos, el Servicio de Medicina Interna Infecciosas aplicó un sistema de vigilancia activa en 231 pacientes repartidos entre las especialidades médicas y quirúrgicas (excluídos los pacientes de UCI o del Hospital Materno-Infantil). Resultados y conclusiones: 1. La incidencia e bacteriemias es de 9,4 por 1000 pacientes ingresados, con predominio de hombres (58,8%) y edad media de 63 años. E. coli y Streptococcus spp. Fueron los microorganismos causales más frecuentemente aislados de manera significativa en relación a bacteriemias comunitarias (45.8%). P. aeruginosa, S. epidermidis, Candida spp. y la etiología polimicrobiana fueron las que más se relacionaron con las de origen nosomial (51,4%). De los 324 casos, 169 (52,3%) tenían un Índice de Charlson >3 y un Índice de Pitt >3 en 65 (21.9%). Como factores de riesgo encontramos ingreso y cirugía previos. La mala evolución se encontró en 65 casos (20,1%), con una mortalidad global de 56/324 (17,4%). 2. Como factores asociados de forma independiente y significativa con peor evolución encontramos: a) Índice de Pitt >3 OR 7,94 (IC 95% 3,462-18.215) b) Enfermedad de base rápidamente y últimamente fatal (McCabe I, II) OR 3,11 (IC 95% 1,370-7,079) c) Uso previo de antibióticos OR 2,93 (IC 95% 1,230-7,006) 3. La No vigilancia activa por el especialista clínico de Infecciosas se comporta como un factor independiente y asociado de forma significativa con una peor evolución OR 2,44 (IC 95% 1,050-5,693). Por tanto, podemos concluir que la vigilancia activa por el especialista clínico en Infecciosas constituye el único factor activo con carácter protector en relación a la buena evolución del paciente. Justification and Objectives of the Study: Bloodstream infection or bacteremia is the most notable infectious process in clinical university hospitals due to its high frequency and high rate of morbidity and mortality. For this reason it is important to design programs to improve its diagnosis and introduce early and adequate treatment with the aim of achieving a decrease in its mortality rate. The study has the following objectives: 1.- To provide a descriptive analysis of bloodstream infection in a clinical university hospital. 2.- To define the prognostic factors associated with a poor evolution. 3.- To determine the influence that active surveillance by infectious disease specialists might have on its evolution. Methodology: We carried out a longitudinal, observational and prospective study in which an analysis was made of the clinical case histories of adult patients who had developed bloodstream disease, and in which the microbiology service had provided early information over the telephone. The recruitment period was from June 2010 until June 2011. Of the 363 episodes of bloodstream infection documented, 234 were included in the study. Of these, the Department of Infectious Diseases in the Internal Medicine Service applied a system of active surveillance in 231 patients shared between medical and surgical services (excluding patients in the ICU or the Infant and maternity hospital). Results and Conclusions: 1. The incidence of bloodstream infection was 9.4 per 1000 patients admitted to hospital, with a predominance in men (58.8%) and patients with a mean age of 63 years. E. coli and Streptococcus spp. were the most commonly isolated microorganisms, significantly more common than community-acquired bloodstream infection (45.8%). P. aeruginosa, S. epidermidis, Candida spp. and polymicrobial etiology were the ones most commonly related with a nosocomial origin (51.4%). Of the 324 cases, 169 (52.3%) had a Charlson Index>3 and 65 (21.9%) had a Pitt Index>3. We found hospital admission and previous surgery to be risk factors. Poor evolution was observed in 65 cases (20.1%), with an overall mortality rate of 56/324 (17.4%). 2. We found that the following factors were independently and significantly associated with a worse prognosis: a) a Pitt Index >3 OR 7.94 (CI 95% 3.462-18.215); b) a fast and ultimately fatal disease base (McCabe I, II) OR 3.11 (CI 95% 1.370-7.079); and c) the previous use of antibiotics OR 2.93 (CI 95% 1.230-7.006) 3. The lack of active surveillance by an infectious disease specialist seemed to be an independent prognostic factor and was significantly related to a worse evolution OR 2.44 (IC 95% 1.050-5.693). Therefore, we can conclude that active surveillance by an infectious disease specialist is the only real factor with a protective effect in terms of the patient's evolution.
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Bacteriemias por staphylococcus aureus en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca: estudio epidemiológico, clínico y molecular
(2016-04-29) Blázquez Abellán, Ana; Martínez Toldos, María del Carmen; Yagüe Guirao, Genoveva; Facultad de Veterinaria
Las bacteriemias por Staphylococcus aureus (BSA) son un importante problema en la patología infecciosa tanto en infecciones adquiridas en la comunidad como las hospitalarias por el desarrollo de complicaciones y la mortalidad asociada. Objetivos: 1. Describir las características clínicas, microbiológicas y epidemiológicas de las BSA en nuestro medio. 2. Estudiar la epidemiología molecular de las cepas de S.aureus e identificar los diferentes clones y su estructura poblacional. 3. Analizar el grado de cumplimiento de las intervenciones clínicas orientadas a mejorar el pronóstico. 4. Estudiar la evolución de cada episodio de bacteriemia. Material y métodos: El estudio se realizó en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca. Se incluyeron de forma retrospectiva todos los episodios de BSA ocurridos en los años 2012 y 2013. De cada paciente se recogieron datos clínicos, epidemiológicos y microbiológicos: Identificación y sensibilidad. Técnicas moleculares: Detección del gen mecA mediante PCR; detección del gen codificante de LPV; tipificación del SCCmec, Spa-Typing, electroforesis en campo de pulsos (PFGE). Resultados: Estudio microbiológico y molecular de bacteriemias por S. aureus resistente a meticilina (BSAMR): En nuestra serie el 16% de los pacientes fueron BSAMR. El 32,3% de todos aislados SAMR fueron resistentes al menos a cuatro o más antibióticos. Todos fueron sensibles a vancomicina y teicoplanina. La fagotipia mostró una distribución heterogénea, sin poder establecer agrupaciones. El tipo SCCmec más frecuente fue el SCCmecIVc, (90,5%). Un aislado presentó el subtipo SCCmecIVh y otro el SCCmecV. La PGFE mostró 12 genotipos diferentes siendo predominantes el pulsotipo E7 y E8. Un aislado correspondió al pulsotipo A1. Esta cepa presentaba la LPV. Otro aislado correspondió al genotipo E13 (EMRSA15) (subtipo SCCmecIVh). El spa-typing mostró que el spa-type t067 fue el más frecuente (42,8%). Estudio microbiológico y molecular de bacteriemias por S. aureus sensibles a meticilina (SAMS): De las 110 cepas SAMS el 3,6% fueron sensibles a todos los antibióticos estudiados; el 64,5% fueron resistentes sólo a penicilina. Presentaron patrón de multirresistencia a tres o más antibióticos un 19%. Mediante Spa-Typing se encontró gran dispersión clonal. De las 22 cepas a las que se realizó PFGE, se encontró relación epidemiológica molecular y clínica en dos pacientes. Estudio de las bacteriemias en pacientes adultos: Este grupo presentó edad avanzada con importante comorbilidad. Se encontró mayor gravedad de la comorbilidad el grupo de BSAMR respecto al de BSAMS. La mayoría de las BSA fueron de adquisición hospitalaria o relacionadas con la asistencia sanitaria. El foco de origen más frecuente fue la bacteriemia relacionada con catéter (31.8%). Un 32,11% de pacientes presentaron al menos un criterio de bacteriemia complicada (BC). La mortalidad global fue del 23,6% aunque la mortalidad relacionada fue de 7,3%. La mortalidad atribuible en BSAMR fue de 14,28% frente a 4,5% en BSAMS. Un 11,4% de las BSA recibieron un tratamiento empírico correcto. Los pacientes que cumplen más medidas de calidad en el manejo clínico del proceso infeccioso, presentaron más porcentaje de curación y menos complicaciones. BSA en pacientes pediátricos. El 28,5% de los pacientes pediátricos presentaron BSAMR. De las adquiridas en la comunidad (23,8%) ninguna fue BSAMR. El síndrome infeccioso más frecuente fue la bacteriemia de origen desconocido (47,6%). Un 14,28% de los pacientes presentaron al menos un criterio de BC. El 18,8% recibieron un tratamiento empírico adecuado. En población infantil en ningún caso hubo un desenlace fatal. En el 80% de los pacientes se cumplieron más del 50% de las medidas globales de manejo de la bacteriemia. Al estudiar como influyen el conjunto de las medidas tomadas en el manejo del paciente el grupo que cumple menos medidas tiene más días de ingreso que los otros grupos.The Staphylococcus aureus bacteremia (SAB) is a major infectious disease problem in both community-associated and nosocomial infections because of the development of complications such as mortality. Objectives: 1. Describe the characteristics, microbiological, and epidemiological characteristics of S. aureus bacteremia in our hospital. 2. To study the molecular epidemiology of bacteremic S. aureus strains and identify different clones and structure population. 3. Assess how clinically intervened and analyze the degree of compliance with interventions to improve in practice. 4. To study the evolution of each episode of bacteremia. Methods: The study was conducted at the Virgen de la Arrixaca University Hospital. Retrospectively included all episodes of S. aureus bacteremia occurred in the years 2012 and 2013. For each patient the clinical and epidemiological data were collected from a review of medical records. Microbiological data: Identification and sensitivity of each isolate. Molecular techniques: Detection of mecA gene by PCR; Detection of the gene encoding LPV; SCCmec typing, Spa-Typing and PFGE. Results: Microbiological and molecular research meticillin resistant S.aureus isolates (MRSA) In our series, patients with BSAMR account for 16%. 32.3% of all MRSA isolates were resistant to at least four or more antibiotics. All isolates were susceptible to vancomycin and teicoplanin. The phage typing showed a heterogeneous distribution, unable to establish groups. The most common SCCmec type was SCCmecIVc, (90.5%). An isolated IVh presented SCCmec subtype and another SCCmecV. The PGFE showed 12 different genotypes and the pulse-types being predominant were E7 and E8. An isolated pulse-type corresponded to A1; this strain showed PVL. Another isolated corresponded to genotype E13 (EMRSA15) (subtype SCCmecIVh). The spa-typing showed that spa-type t067 was the most frequent (42.8%). Microbiological and molecular study methicillin susceptible S. aureus strains (MSSA). Of the 110 SAMS 3.6% strains were sensitive to all antibiotics studied; 64.5% were resistant only to penicillin; They presented a pattern of multidrug resistance to three or more antibiotics 19% of the isolates. By Spa-Typing it found a clonal dispersion with 70 different spa-types. Of the 22 strains that PFGE was performed, and clinical molecular epidemiological link was found in two patients. Study of SAB in adult patients: This group of elderly population presented with significant comorbidity. Increased severity of comorbolidad group MRSAB respect to MSSA found. Most SAB hospital were related to purchase or healthcare. The most common infectious syndrome was catheter-related bacteremia (31.8%). A 32.11% of patients had one or more criteria complicated bacteremia. Having an MRSA bacteremia involves 3.2 times more risk of complicated bacteremia (CB). The overall mortality was 23.6%, although related mortality was 7.3%. MRSAB attributable mortality was 14.28% compared to 4.5% in MSSAB. Only 11.4% of the BSA receive proper treatment. Patients who meet more quality measures in the clinical management of infectious process are more cure rate and fewer complications. SAB in pediatric patients. The corresponding population group to the Children's Hospital is a 15.9%. 28.5% of pediatric patients had MRSAB . Of those acquired in the community (23.8%) was no BSAMR. The most common infectious syndrome was bacteremia of unknown origin (47.6%). 14.28% of patients have at least one criterion of complicated bacteremia. 18.8% received an appropriate empirical treatment. In child population in no case was fatal. 80% of patients are more compliant than 50% of global management measures of bacteremia. By studying how they influence all the measures taken in the management of patients the group meets less measures of income it has more days than the other groups.
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Caracterización de esporas de "Bacillus stearothermophilus" y efecto de factores medioambientales sobre su desarrollo y sobre sus parámetros de muerte térmica / Pablo Salvador Fernández Escámez ; director Antonio Martínez López.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Veterinaria,, 1994) Fernández Escámez, Pablo Salvador
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Colonización por ESKAPES y características clínicas de pacientes en estado crítico
(Universidad de Murcia, 2020) Santos Zonta, Franciele do Nascimento; da Silva Roque, Márcia; Soares da Silva, Ruan Gabriel; Gabrieli Ritter, Amanda; Tondello Jacobsen, Fernanda
Identificar la colonización por ESKAPES y las características clínicas de los pacientes hospitalizados en una Unidad de Cuidados Intensivos para Adultos de un hospital mixto en Paraná. Método: Investigación de campo, descriptiva, documental y experimental con enfoque cuantitativo, desarollada en una Unidad de Cuidados Intensivos adultos de un hospital mixto en el suroeste de Paraná, Brasil. La población del estudio consistió en pacientes con ingreso de 48 horas en la Unidad de Cuidados Intensivos, de abril a agosto de 2018 y de abril a agosto de 2019. La muestra totalizó 102 individuos. Para la recopilación de datos clínicos, se utilizó un Checklist y para el análisis microbiológico se recogieron muestras de las cavidades nasales y orales y la secreción traqueal. El análisis de los datos clínicos se produjo a través del software Statistical Package for the Social Sciences. Se realizaron pruebas de frecuencia y chi-cuadrado, teniendo en cuenta la p<0,05 significativa.Resultados: Se evaluaron un total de 102 pacientes ingresados en la Unidad de Cuidados Intensivos durante el período estudiado. De ellos, 57 (55,8%) fueron colonizados por microorganismos patógenos. En cuanto a la colonización por microorganismos, predominan Staphylococcus aureus (61,4%), seguido de Klebsiella pneumoniae (40,4%), Pseudomonas aeruginosa (26,3%) y Staphylococcus epidermidis (21,1%). Cabe destacar que Klebsiella pneumoniae y Staphylococcus aureus estuvieron presentes en las tres regiones evaluadas.
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Conferencia: 'Hízose la luz...y las bacterias la vieron'
(2010-03-02) Urbina, Luis
Conferencia: 'Hízose la luz...y las bacterias la vieron'. Francisco José Murillo, Universidad de Murcia. XXIII Semana de Biología. Salón de Grados de la Facultad de Biología. Campus de Espinardo.
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Desarrollo de métodos rápidos para la detección de alicyclobacillus spp. en materia prima destinada a la elaboración de bebidas y zumos de frutas
(2016-02-11) Fernández Fernández, María Pilar; Periago Castón, María Jesús; Gabaldón Hernández, José Antonio; Departamento de Tecnología de Alimentos, Nutrición y Bromatología
Alicyclobacillus acidoterrestris es una bacteria termoacidófila, formadora de esporas que crece a una temperatura entre 26 y 60 ºC (con un rango óptimo de temperatura 42-53 ºC) y en un rango de pH de 2,0 a 6,0 con valores óptimos entre 3,5 y 5,0. Es una bacteria termorresistente que puede crecer en alimentos ácidos, incluyendo zumos y bebidas de frutas, y supone un gran problema para la industria de este sector, ya que el deterioro del zumo por este microorganismo no es perceptible en el producto final al crecer sin formación de gas, pero origina sabores desagradables que alteran el producto, como un “sabor a medicina”. Su detección, plantea dificultades en los departamentos de calidad ya que son necesarios varios días para la obtención de resultados por los métodos microbiológicos clásicos tradicionales. Por ello, es de gran importancia el desarrollo de métodos rápidos que permitan el control de Alicyclobacillus en las materias primas empleadas en la industria alimentaria garantizando así la ausencia de este microorganismo en los productos finales, zumos y bebidas de frutas. En la presente Tesis Doctoral el objetivo general ha sido estudiar la aplicación de dos métodos rápidos (impedancia eléctrica y PCR) para la detección de Alicyclobacillus spp. en distintas materias primas empleadas en la industria de zumos. Para ello se inocularon las materias primas (zumo concentrado de uva, zumo concentrado de manzana, zumo concentrado de piña, zumo concentrado de naranja, cremogenado de melocotón-nectarina, cremogenado de pera y zumo puro de naranja) con esporas Alicyclobacillus acidoterrestris aisladas a partir de un zumo de melocotón y uva, y con una cepa de referencia del mismo. En la primera experiencia se ensayaron distintos tratamientos térmicos (80 ºC/10 minutos, 70 ºC/20 minutos y 60 ºC/30 minutos) para la germinación de esporas a formas vegetativas, no existiendo diferencias significativas en los recuentos de Alicyclobacillus a las distintas concentraciones de inóculos, ni en los porcentajes de recuperación. Es por ello que se seleccionó el tratamiento térmico de 80 ºC/10 minutos para emplear así menos tiempo de análisis. La técnica de impedancia eléctrica válida para la detección de Alicyclobacillus acidoterrestris fue el método indirecto, que registró los cambios en la impedancia del medio (%M) a través de la formación de CO2 derivado de la ruta metabólica del guayacol por Alicyclobacillus, siendo el medio de cultivo más adecuado para la determinación de este microorganismo el caldo BAT. Por el contrario, no detectamos crecimiento por impedancia eléctrica directa. Para cada una de las materias primas, zumo concentrado de uva, zumo concentrado de manzana, zumo concentrado de naranja, cremogenado de melocotón-nectarina, cremogenado de pera y zumo puro de naranja, se desarrolló un método valido para la detección y cuantificación de Alicyclobacillus acidoterrestris por impedancia eléctrica indirecta para un valor de %M= -10, logrando unos coeficientes de correlación y varianza corregida elevados, superiores al 0,8 tanto para el experimento realizado con una cepa aislada de un zumo de melocotón y uva comercial e identificada como Alicyclobacillus acidoterrestris, como el efectuado con una cepa de referencia de Alicyclobacillus acidoterrestris. La validación de este método comparando con el método de microbiología clásica con BAM Agar resultó satisfactoria con valores de R2 > 0,9 para cada una de las matrices mencionadas. Sin embargo, para el zumo concentrado de piña este método no permitió una adecuada cuantificación, ya que se obtuvo baja correlación entre las variables tiempo de detección por impedancia y logaritmo de las unidades formadoras de colonias cuantificadas por siembra tradicional en placa con BAM Agar, tanto para el estudio realizado con la cepa aislada como en el realizado con la cepa de referencia. Además, este método tampoco pudo ser validado con el método clásico de microbiología con BAM Agar por obtener un valor muy bajo de varianza explicada, R2= 0,366. Con la técnica de RTi-PCR es posible determinar la concentración de Alicyclobacillus acidoterrestris en todas las materias primas utilizadas en este estudio destinadas a la elaboración de zumos y bebidas de frutas, obteniendo unos valores de coeficientes de correlación y varianza corregida superiores a 0,9; y estableciendo un límite de detección, cuantificado por fluorescencia, de CT < 40 que corresponde a límite de detección de 200 ufc/mL en recuento en placa, para todos los casos, incluso en el zumo concentrado de piña a diferencia de la técnica por impedancia eléctrica. Las características intrínsecas de composición química analizadas en las muestras: ºBrix, pH, glucosa, fructosa, sacarosa, pectinas solubles en agua, ácidos orgánicos, compuestos fenólicos y flavonoides no influyeron en el crecimiento de Alicyclobacillus spp., al no observar diferencias en el crecimiento del microorganismo entre las muestras, a excepción del zumo concentrado de piña. En el caso del zumo de piña, los resultados obtenidos en el método de impedancia eléctrica indirecta, pueden estar relacionados con la composición fenólica de este zumo que se caracteriza por un alto contenido en lignanos, compuestos considerados como antimicrobianos de hongos y algunas bacterias patógenas, que pudiera inhibir el crecimiento de Alicyclobacillus y por consiguiente la síntesis de guayacol y formación de CO2. Summary Alicyclobacillus acidoterrestris is a thermoacidophilic, spore-forming bacterium that grows to a temperature between 26 and 60 ºC (with an optimal rank of temperature 42-53 ºC) and in a pH rank of 2,0 to 6,0 with optimal values between 3,5 and 5,0. It is a thermoresistant bacterium that can grow in acidic food, including fruit juices and drinks, and it means a great problem for the industry of this sector, since the deterioration in the juices by this microorganism is not noticeable on the final product as it grows without gas formation but it originates unpleasant tastes modifying the product, like "a taste of medicine". Its detection gives rise to difficulties at the quality departments, given that several days are necessary for the obtaining of results by the traditional microbiological methods. For that reason, it is highly important the development of quick methods which allow to control Alicyclobacillus in the raw materials used in the food industry, guaranteeing in this way the absence of this microorganism on the final products, fruit juices and drinks. At the present Doctoral Thesis the general aim has been to study the application of two quick methods (electrical impedance and RTi-PCR) for the detection of Alicyclobacillus spp. in different raw materials used in the juice industry. For that, the raw materials (concentrated grape juice, concentrated apple juice, concentrated pineapple juice, concentrated orange juice, peach-nectarine purée, pear purée and orange pure juice) were inoculated with spores Alicyclobacillus acidoterrestris isolated from a peach and grape juice, and with a reference strain of the same. At the first experience, different heat treatments were tried out (80 ºC/10 minutes, 70 ºC/20 minutes and 60 ºC/30 minutes) for the spore germination to vegetative forms, with no significant differences in the Alicyclobacillus counts to the different concentrations of inocula nor in the recovery percentages. It is for that reason that it was selected the heat treatment of 80 ºC/10 minutes in order to employ in this way less time of analysis. The electrical impedance technique valid for Alicyclobacillus acidoterrestris detection was the indirect method, which registered the changes in the impedance of the environ (%M) via the transformation of CO2 derived from the metabolic pathway of the guaiacol by Alicyclobacillus, being the BAT broth the most adequate culture medium for the determination of this microorganism. On the contrary, it was not detected growth by direct electrical impedance. For each one of the raw materials, concentrated grape juice, concentrated apple juice, concentrated orange juice, peach-nectarine purée, pear purée and orange pure juice, it was developed a valid method for the detection and quantification of Alicyclobacillus acidoterrestris by indirect electrical impedance for a value of %M = -10, achieving high correlation coefficients and corrected variance, higher to the 0,8, not only for the experiment carried out with an isolated strain from a commercial peach and grape juice and identified as Alicyclobacillus acidoterrestris, but also for that one carried out with a reference strain of Alicyclobacillus acidoterrestris. The validation of this method compared to the method of classical microbiology with BAM Agar resulted satisfactory with values of R2 > 0,9 for each one of the matrixes mentioned. However, for the concentrated pineapple juice this method didn’t allow an adequate quantification, as it was obtained low correlation between the variables detection time by impedance and logarithm of the colony-forming units quantified by traditional plating with BAM Agar, as for the study carried out with the isolated strain as in that one carried out with the reference strain. In addition to this, this method either could be validated with the classical method of microbiology with BAM Agar for obtaining a very low value of variance, R2 =0,366. With the RTi-PCR technique is possible to determine the concentration of Alicyclobacillus acidoterrestris in all the raw materials used in this study and destined to the manufacturing of fruit juices and drinks, obtaining values of R2 > 0,9 with an established value of CT < 40 and with a detection limit of 200 ufc/mL in all the cases, even in that of the concentrated pineapple juice, as opposed to the technique by electrical impedance. The intrinsic characteristics of chemical composition analysed in the samples: ºBrix, pH, glucose, fructose, sacarose, water soluble pectins, organic acids, phenolic compounds and flavonoids, had no influence in the growth of Alicyclobacillus spp., not observing differences in the growth of the microorganism among the samples, with the exception of the concentrated pineapple juice. In the case of the pineapple juice, the results obtained in the indirect electrical impedance method could be related to the phenolic composition of this juice that is characterized by a high content in lignans, compound considered as fungi antimicrobial and some pathogenic bacteria, which could inhibit the growth of Alicyclobacillus and, therefore, the synthesis of guaiacol and the CO2 formation.
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El potencial de los péptidos antimicrobianos de artrópodos como sustitutos de los antibióticos
(Universidad de Murcia, 2025-10-13) Cutillas Dólera, Pedro; Galián Albadalejo, José; Corrales Romero, Juan Carlos; Sin departamento asociado; Escuelas::Escuela Internacional de Doctorado
La resistencia bacteriana a los antibióticos se ha consolidado como una de las amenazas más serias para la salud pública global, al comprometer la eficacia de los tratamientos convencionales y provocar un aumento alarmante de la morbilidad, la mortalidad y los costes sanitarios. Esta situación se ha visto agravada por el uso indiscriminado de antibióticos tanto en medicina humana como veterinaria, la automedicación sin control médico, y la capacidad de las bacterias para intercambiar genes de resistencia mediante mecanismos de transferencia horizontal. Frente a este panorama, se ha intensificado la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas, entre las que destacan los péptidos antimicrobianos (AMPs) como una alternativa viable y prometedora. Los AMPs son pequeñas proteínas que presentan actividad frente a una amplia variedad de patógenos, incluyendo bacterias, hongos, virus e incluso células tumorales. Estas moléculas destacan por ser termoestables, poco tóxicas para células eucariotas y por actuar mediante mecanismos distintos a los antibióticos tradicionales, lo que reduce significativamente la probabilidad de aparición de resistencias. Aunque se han identificado AMPs en diversos grupos de organismos, los artrópodos se presentan como una fuente especialmente interesante debido a su diversidad biológica y a su constante exposición a entornos microbianos hostiles. El presente trabajo comenzó con el análisis de la microbiota intestinal de dos especies de insectos: Periplaneta americana y Zophobas morio, criadas en el insectario de la Universidad de Murcia y en la empresa spin-off Arthropotech SL. El objetivo fue detectar comunidades bacterianas con perfiles de multirresistencia. Los resultados revelaron una elevada presencia de comunidades bacterianas resistentes a múltiples antibióticos, algunas de las cuales podrían tener implicaciones para la salud humana, dada su proximidad ecológica a entornos urbanos y domésticos. Este hallazgo motivó la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas alternativas. A partir de estos hallazgos, se dirigieron los esfuerzos hacia la identificación y validación experimental de AMPs en distintos artrópodos. En el escarabajo tigre Calomera littoralis se identificaron péptidos como CliCecB2 y Clit-Def, que mostraron eficacia frente a bacterias Gram + y Gram -. Paralelamente, se realizaron estudios bioinformáticos sobre los genomas de Tuta absoluta y Hermetia illucens, que permitieron predecir nuevas secuencias candidatas a AMPs. Estas fueron posteriormente sintetizadas y evaluadas in vitro, confirmando su capacidad para inhibir el crecimiento de bacterias multirresistentes. Además, se exploró el potencial terapéutico del veneno de escorpiones, tradicionalmente asociado con toxicidad. Se centró la atención en péptidos sin puentes disulfuro (NDBP), los cuales fueron sintetizados y sometidos a ensayos in vitro frente a cepas bacterianas resistentes. Los resultados mostraron una actividad antimicrobiana destacada. En conjunto, este trabajo ofrece una visión integral del problema de la multirresistencia bacteriana y de los esfuerzos experimentales realizados para identificar soluciones innovadoras. Los resultados obtenidos respaldan el uso de artrópodos como una fuente prometedora de compuestos antimicrobianos, y posicionan a los AMPs derivados de insectos y escorpiones como herramientas valiosas para afrontar uno de los principales desafíos de la medicina actual.
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Epidemiología clínica y molecular de bacteriemias por Escherichia coli en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca
(Universidad de Murcia, 2018-02-16) Segura Basail, Javier; Yagüe Guirao, Genoveva; Salvador Garcia, Carme; Facultad de Medicina
OBJETIVOS: El objetivo principal de este estudio fue analizar las características epidemiológicas, clínicas y microbiológicas de las bacteriemias por Escherchia coli en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca durante el periodo de un año. MATERIAL Y MÉTODOS: Se recogieron los datos demográficos y epidemiológicos de todos los pacientes con bacteriemia documentada por E. coli durante el año 2013. Se recuperaron y estudiaron los aislados consecutivos de Escherichia coli procedentes de hemocultivos. La identificación bioquímica y sensibilidad antibiótica de los aislamientos se realizó mediante el sistema automatizado Vitek2®. Se sospechó la presencia de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) en las cepas en las que las concentraciones mínimas inhibitorias para cefotaxima y ceftazidima fueron iguales o superiores a 2 μg/ml y se confirmaron fenotípicamente mediante el método de sinergia con doble disco de acuerdo con el CLSI. Se realizó la caracterización de las enzimas BLEE, se determinó el grupo filogenético, factores de virulencia, la presencia específica de los clones ST69 ST73, ST95, ST131 y se caracterizaron las ST (“Sequence type”) de todos los aislados pertenecientes al filogrupo B2 y productores de BLEE no caracterizados previamente. RESULTADOS: La incidencia de bacteriemias producidas por E. coli fue de 86,5 episodios/100000 habitantes-año. La edad media en adultos fue de 63,9 años y un 72,8% presentaron alguna comorbilidad. El 58,5% de las bacteriemias fueron de tipo comunitario y el 59,5% de foco urinario. Un 9.9% de las cepas de E. coli fueron productoras de BLEEs y la resistencia global a ciprofloxacino fue del 39,6%. Se encontraron mayores resistencias a antibióticos entre los aislamientos de E. coli productor de BLEEs y en cepas resistentes a ciprofloxacino. La existencia de enfermedad pulmonar crónica y la administración de antibioterapia previa fueron factores de riesgo para la adquisición de bacteriemia por E. coli BLEE, observandose una tendencia para la adquisición de bacteriemia por E. coli resistente a ciprofloxacino. El 80% de las BLEEs pertenecían a la familia CTX-M y un 46,7% fueron CTX-M 15. El filogrupo mayoritario fue el B2 (52,9%) seguido del grupo D (13,4%). El porcentaje de cepas ExPEC fue del 69,8% y el factor de virulencia mas prevalente fue iutA. Entre los aislados del filogrupo B2 el complejo clonal mayoritario fue ST95 (15%), seguido de ST73 (12,8%) y ST131(10,7%). ST69 supuso el 67% de aislamientos del filogrupo D. Entre las cepas BLEE un 38,9% pertenecieron al clon ST131 ,asociandose en un 85% a CTX-M 15 y un 11,1% pertenecieron a ST155. Se observaron diferencias estadisticamente significativas en cuanto a la administración previa de antimicrobianos y diabetes mellitus en bacteriemias por cepas No-ST73 y No-ST131, respectivamente. Las STs 69, 73 y 95 fueron en lineas generales más sensibles mientras que las ST131 fueron más resistentes. CONCLUSIONES: En nuestro estudio se observó un predomino de bacteriemias por E. coli de adquisición comunitaria y origen urinario en pacientes de edad avanzada y elevada comorbilidad.La presencia de BLEE y la resistencia a ciprofloxacino se asociaron con mayores tasas de resistencia a otras familias de antibioticos. Los factores de riesgo para la adquisición de bacteriemia por E. coli BLEE fueron antibioterapia previa y enfermedad pulmonar crónica y se observo una tendencia en cepas de E. coli resistentes a ciprofloxcino. Se observó una elevada presencia de microorganismos pertenecientes al grupo filogenético B2 y clasificados como ExPEC. Las ST mayoritarias fueron ST95, ST73, ST131 y ST69 y en cepas BLEE se observó un predominio de ST131 asociadas a CTX-M 15. La administración previa de antimicrobianos y diabetes mellitus fueron factores protectores para la adquisicón de bacteriemias por E. coli ST73 y ST131 respectivamente y ST131 se asoció con mayores tasas de resistencia. OBJECTIVES: The main objective of this study was to analyze the epidemiological, clinical and microbiological traits of Escherichia coli bacteraemias at the Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca during the period of one year. MATERIAL AND METHODS: Demographic and epidemiological data were collected from all patients with documented E. coli bacteraemia during the year 2013. Consecutive isolates of Escherichia coli from blood cultures were recovered and studied. The biochemical identification and antibiotic sensitivity of the isolates were performed using the Vitek2® automated system. The presence of extended spectrum betalactamases (ESBL) was suspected in strains where the minimum inhibitory concentrations for cefotaxime and ceftazidime were equal to or greater than 2 μg / ml and were confirmed phenotypically by the double disc synergy method according to CLSI. The characterization of the ESBL enzymes was carried out, the phylogenetic group, virulence factors, the specific presence of ST69 ST73, ST95, ST131 clones and ST ("Sequence type") of all isolates belonging to the phylogenetic B2 and ESBL producers not previously characterized. RESULTS: The incidence of bacteraemia caused by E. coli was of per 86.5 episodes / 100,000 inhabitants per year. The mean age in adults was 63,9 years and 72,8% presented some comorbidity. 58.5% of the bacteriemias were community adquired and 59.5% were of the urinary focus. A 9.9% of E. coli strains were ESBL producers and total resistance to ciprofloxacin was 39.6%. Higher antibiotic resistance was found between isolates of E. coli producing ESBLs and in strains resistant to ciprofloxacin. The existence of chronic lung disease and the administration of previous antibiotic therapy were both risk factors for the acquisition of ESBL E. coli bacteraemia, observing a tendency for bacterial acquisition of E. coli resistant to ciprofloxacin. 80% of the ESBLs were of the CTX-M family and 46,7% were of the CTX-M-15 subfamily. The most abundant phylogroup was B2 (52.9%) followed by group D (13.4%). The ExPEC strains percentage was 69.8% and the most prevalent virulence factor was iutA. Among the isolates of phylogenetic group B2, the more frequent clonal complex was ST95 (15%), followed by ST73 (12.8%) and ST131 (10.7%). ST69 comprised 67% of isolates of the phylogenetic group D. Among the ESBL strains, 38.9% were of ST131 clone, 85% of which were associated with CTX-M 15, and 11.1% were of ST155 clone, respectively . Statistically significant differences were observed regarding the early administration of antimicrobials and diabetes mellitus in bacteraemias by non-ST73 and non-ST131 strains, respectively. STs 69, 73 and 95 strains were more sensitive generally while ST131 strains were more resistant. CONCLUSIONS: In our study, we have observed a prevalence of E. coli bacteraemias of community acquisition and urinary origin in patients of advanced age and high comorbidity. The presence of ESBL and resistance to ciprofloxacin were associated with higher resistance rates to other antimicrobial families. The risk factors for the acquisition of ESBL E. coli bacteraemia were earlier antimicrobial therapy and chronic lung disease, and a trend was observed in resistant to ciprofloxocin E. coli strains. It was observed a high presence of microorganisms belonging to phylogenetic group B2 and classified as ExPEC. The major STs were ST95, ST73, ST131 and ST69. In ESBL strains a predominance of ST131 associated with CTX-M 15 was observed. Either earlier administration of antimicrobials or diabetes mellitus were protective factors for the acquisition of E. coli ST73 and ST131 bacteraemias, respectively.Finally, ST131 was associated with higher resistance rates.
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Estrategias de ingeniería metabólica y biología de sistemas aplicadas a la producción de L(-)carnitina por Escherichia coli= Metabolic engineering and systems biology strategies for L(-)carnitine production in Escherichia coli
(2014-06-04) Arense Parra, Paula; Iborra Pastor, José Luis; Cánovas Díaz, Manuel; Departamento de Bioquímica y Biología Molecular (B) e Inmunología
Esta Tesis Doctoral recoge el trabajo de investigación que se ha realizado en dos líneas desarrolladas de forma paralela sobre Escherichia coli. Por un lado, la optimización de un proceso de biotransformación para mejorar la síntesis de L( )-carnitina mediante técnicas de ingeniería metabólica. Y por otro, la determinación de los principales efectos que provoca la exposición prolongada a altas concentraciones de sal y su respuesta de adaptación, principalmente cuando las fuentes de carbono pueden contener altas concentraciones de sal y tanto el sustrato como el producto son osmoprotectores. Para ello, se han aplicado técnicas utilizadas por la biología de sistemas y la ingeniería metabólica. La importancia de L( )-carnitina viene determinada por el papel que desempeña en el metabolismo energético, de hecho su deficiencia está asociada a diversas patologías. Varios trabajos centrados en la aplicación terapéutica de L( )-carnitina han demostrado que su administración puede ayudar a suplir dicha carencia. A partir de este punto, comienza una creciente actividad investigadora centrada en la producción de L( )-carnitina. Este trabajo presenta un método alternativo basado en la utilización de E. coli para llevar a cabo la biotransformación de compuestos de bajo valor añadido como puede ser D(+)-carnitina y/o crotonobetaína en L( )-carnitina. Por medio de técnicas de biología molecular se ha modificado genéticamente una cepa de E. coli, consiguiendo la sobreexpresión de caiC y mejorando el rendimiento de la cepa silvestre. Además, para optimizar la producción de L( )-carnitina se han estudiado aspectos relacionados con el metabolismo de carnitina como la disponibilidad de coenzima A o la inhibición de una ruta metabólica que favorezca la transformación del sustrato en L( )-carnitina. Posteriormente, se obtuvo una cepa modificada más estable y con una alta capacidad para la producción de L( )-carnitina, para ello se han implementado diversas estrategias de ingeniería metabólica. Las mutaciones implicadas en la mejora de esta cepa fueron: a) la deleción del gen aceK para incrementar el flujo hacia el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, b) la deleción del gen caiA para impedir la síntesis de γ-butyrobetaína (productos del metabolismo de carnitina), y c) la sustitución del promotor natural altamente regulado del operón cai por un promotor artificial constitutivo. Con dichas mutaciones implementadas en una misma cepa, no sólo se consiguió aproximadamente un 100 % de conversión de crotonobetaína en L( )-carnitina en las condiciones de ensayo, sino que también la limitación impuesta por la presencia de oxígeno fue superada por este mutante, lo que indica la importancia de la ingeniería metabólica en la mejora de procesos biotecnológicos. L(-)-carnitina o compuestos similares son utilizados como osmoprotectores, acumulándolos en el interior celular, para evitar la deshidratación cuando la osmolaridad del medio se incrementa. Ante estas situaciones, los microorganismos pueden adaptarse y dar una respuesta pasajera, o realizar un proceso de adaptación para mantener su supervivencia mientras el estrés está presente. En este trabajo, se observó la evolución y la respuesta generada de una cepa de E. coli cultivada en un reactor continuo y sometida a tres concentraciones crecientes de sal (moderada, alta y muy alta). La medida de las actividades enzimáticas de las principales rutas metabólicas, así como la determinación de los metabolitos fermentativos producidos, resaltaron el importante papel ejercido por el metabolismo central en la adaptación y en la supervivencia celular tras una larga exposición a estrés salino, así como la necesidad de disponer de precursores biosintéticos y de energía en forma de ATP. Además, se profundizó en el estudio del comportamiento celular realizando una aproximación desde la biología de sistemas, integrando los niveles metabolómico, flujómico y transcriptómico. Se debe destacar que se observaron dos conjuntos de respuestas consecuencia de la concentración de sal presente en el medio. Uno dirigido a mantener unos niveles energéticos umbrales en la célula, basado tanto en el incremento de los flujos metabólicos hacia rutas que permitían la generación de energía, como en la reducción de procesos no esenciales para la supervivencia. Y otro, una respuesta característica en las células expuestas a alta o a muy alta concentración de sal, que estuvo caracterizada no sólo por cambios en los patrones de fermentación metabólica sino también por una alteración significativa del estado redox celular. Así, con el uso de técnicas apropiadas se han podido detectar un gran número de cambios en la fisiología y el metabolismo de E. coli. Además, la aproximación de la biología de sistemas ofrece una forma de obtener e integrar gran cantidad de información, que de otra forma se perdería por la cantidad de información que se obtiene. Finalmente, la ingeniería metabólica y la biología de sistemas han aportado una excelente manera de mejorar y conocer las características de los microorganismos involucrados en los procesos biotecnológicos relacionados con la producción de L( )-carnitina. SUMMARY Two parallel research aims addressed on Escherichia coli are shown in this PhD thesis. On one hand, the optimization of a biotransformation process in order to improve L( )-carnitine synthesis by using metabolic engineering techniques is explained within the first chapters. On the other hand, in the following chapters, the main effects provoked by long-term high salt concentrations and the adaptative response to osmotic stress were determined using different techniques related to systems biology. L( )-carnitine is an important trimethylammonium compound because of its role in the energetic metabolism, in humans, several pathologies are related with deficiencies of carnitine level. Several works focused on the therapeutic application of L( )-carnitine, showed that administration of this compound could be a solution as opposed to its absence. Once different carnitine production ways were revised, this work shows an alternative method using Escherichia coli to carry out the biotransformation from D(+)-carnitine and/or crotonobetaine into L( )-carnitine. By using molecular biology techniques a strain of E. coli was engineered, obtaining caiC overexpression and enhancing the production yield respect to the wild type strain. Moreover, several aspects related with carnitine metabolism, such as coenzyme A availability and the inhibition of specific metabolic pathways were studied to optimize the carnitine production. Afterwards, various metabolic engineering strategies were implemented, obtaining a stable engineered strain with high capacity to produce L( )-carnitine. The modifications carried out were: a) deletion of the aceK gene (encoding a bifunctional protein phosphatase/kinase which performs post-translational control of isocitrate dehydrogenase) in order to increase the metabolic flux towards TCA cycle, b) deletion of the caiA gene (encoding the crotonobetainyl-CoA reductase) to avoid synthesis of γ-butyrobetaine (byproduct of the carnitine metabolism), and c) replacement of the highly regulated natural promoter of the cai operon by a constitutive promoter. These mutations implemented in the same strain led to obtaining almost 100% conversion from crotonobetaine to L( )-carnitine in the assay conditions. Moreover, the main restrictions impossed to the aerobic expression of the carnitine metabolism were eliminated producing L( ) carnitine in the presence of oxygen. Therefore, this work emphasizes the important role of metabolic engineering to improve any biotechnological process. On the other hand, L( )-carnitine and similar compounds are used as osmoprotectors, which are accumulated in high concentrations, either through the uptake from the medium or through de novo synthesis inside the cells, to avoid dehydratation when the osmolarity of the culture medium increases. Under these conditions, microorganisms have different response to an environmental stress, short-term or shock and long-term adaptation. In this work, evolution and response to long-term adaptation were analyzed in a E. coli strain growing in continuous reactors supplemented with a gradually increasing concentration of NaCl (moderate, high and very high). Enzyme activities from the main metabolic pathways and fermentative metabolites were analyzed, highlighting important role of central metabolism on adaptation and cellular survival after salt stress exposition. Furthermore, the need of biosynthetic precursors and energy as ATP were shown. In addition, a systems biology approach was conducted to study cellular behavior. In order to estimate the critical modifications undergone to overcome stress and to develop tolerance to salt, the metabolism was examined at several levels using different techniques (metabolomics, fluxomics and transcriptomics). Under salt stress conditions two set of responses were shown. One of them was focused to maintain the energetic threshold in cells, thus, either an increment of the metabolic pathways which could produce energy or a decrease of no-essential processes to survive were shown. On the other hand, cells under high or very high salt concentrations showed another similar response characterized by both changing on pattern of fermentative pathways and redox state. Therefore, using suitable techniques many changes in the physiology and metabolism of the E. coli strain in use were detected. Moreover, the systems biology approach offered a way to obtain and integrate a large amount of information, preventing some of the information being overlooked by the massive amount of data. Both the metabolic engineering and systems biology approaches have provided excellent ways to improve and know features of microorganisms involved in biotechnological processes related with the L( )-carnitine production.
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Estudio de la epidemiología molecular y resistencia antibiótica de aislamientos clínicos de Acinetobacter baumannii del Hospital Clínico Universitario Viergen de la Arrixaca
(2016-09-02) García Lucas, Teresa; Yagüe Guirao, Genoveva; Salvador García, Carme; Facultad de Biología
Objetivos: El principal objetivo de este estudio fue determinar el mecanismo de resistencia a carbapenems mediante métodos fenotípicos y genotípicos, en aislamientos de Acinetobacter baumannii, así como conocer la epidemiología molecular de estas cepas mediante diferentes técnicas de tipificación molecular. Metodología: Se realizó el estudio de 239 aislamientos de A. baumannii procedentes de 101 pacientes ingresados en la unidad de Reanimación (REA) y en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca durante un periodo de dos años (2010 y 2011). La identificación y la sensibilidad de A. baumannii se realizó con el sistema automatizado Vitek2®, y la confirmación de la especie dentro del complejo Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii se determinó mediante la detección genotípica del gen blaOXA-51-like. La detección fenotípica de carbapenemasas se llevó a cabo con el test de Hodge y el Etest® MBL. Los resultados obtenidos por estos métodos se comprobaron mediante la realización de PCR. La relación clonal entre los aislamientos de A. baumannii se evaluó con diferentes técnicas: REP-PCR y RFLP-PFGE. Adicionalmente algunas cepas fueron tipificadas usando MLST. Resultados: La mayoría de las cepas fueron multirresistentes con porcentajes de sensibilidad a carbapenems del 3%. Tan solo 3 de las cepas estudiadas fueron sensibles a este grupo de antibióticos. Los antibióticos más activos fueron colistina y minociclina, con el 93,1% y 60,4% de cepas sensibles, respectivamente. El test de Hodge fue negativo en el 29,7% (30/101) de las cepas de A. baumannii. Tan solo 3 de estas cepas fueron sensibles a carbapenems. Los resultados obtenidos en el Etest® MBL en MH2 y MHE fueron discrepantes en todos los aislamientos de A. baumannii. En un 99% de los aislamientos se detectó el gen que codifica la OXA-51-like y en el 93,1% se identificó la OXA-24-like. No hubo ningún aislamiento que presentara la OXA-23-like ni OXA-58. No se identificó ninguna MBLs de las estudiadas en este trabajo. La tipificación molecular mediante REP-PCR permitió diferenciar 4 clones, dos de ellos mayoritarios, el clon A y el clon B con el 47,5% y 40,6% de aislamientos, respectivamente. Ambos clones se aislaron de las dos unidades de alto riesgo estudiadas lo que indica una dispersión de estos en el hospital. Los resultados de RFLP-PFGE también mostraron dos patrones mayoritarios denominados patrón I y patrón II. La concordancia entre ambos métodos fue del 89,9%. La secuencia tipo de la cepa del patrón I tipificada mediante MLST correspondió a la ST92 y los aislamientos del patrón II con la ST187. Conclusiones: La resistencia antibiótica en los aislamientos de Acinetobacter baumannii del estudio resultó muy elevada. Un 97% de los aislamientos fueron resistentes a carbapenems considerados el tratamiento de elección. Los antibióticos más activos frente A. baumannii fueron colistina, minociclina, amikacina y cotrimoxazol. Los test fenotípicos, para la detección de carbapenemasas y metalobetalactamasas, tuvieron un valor limitado en nuestro estudio. La OXA-24-like fue la oxacilinasa adquirida identificada con más frecuencia en los aislamientos de A. baumannii. No se detectaron las oxacilinasas OXA-23-like y OXA-58-like. Tampoco se identificó ninguna MBLs. La presencia en todos los aislamientos, excepto uno, de oxacilinasas del grupo OXA-51-like nos permite concluir que estas cepas pertenecen a la especie A. baumannii. Se detectaron 2 clones mayoritarios de A.baumannii en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca durante los dos años de estudio, distribuidos tanto en REA como en UCI. Los resultados obtenidos por REP-PCR mostraron una concordancia del 89,9% con los resultados obtenidos por PFGE-RFLP. Las secuencias tipo obtenidas en este estudio fueron la ST92 y ST187. Estas STs se han descrito en España. Objectives: The main objectives of this study were to determine the mechanism of resistance to carbapenems by phenotypic and genotypic methods in Acinetobacter baumannii isolates and to know the molecular epidemiology of these strains by different molecular typing techniques. Methods: We studied 239 A. baumannii strains isolated from 101 patients hospitalized in Reanimation Unit and Critical Care Unit in the Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca during 2 years (2010 and 2011). Identification and susceptibility of A. baumannii were processed with automated system Vitek2® and the species confirmation within Acinetobacter calcoaceticus- Acinetobacter baumannii complex was determined by genotypic detection blaOXA-51-like gene. Phenotypic carbapenemases detection was performed by Hodge Test and MBL Etest®. The results obtained by these methods were tested by performed PCR. Clonal relationship between A. baumannii isolates was evaluated by different techniques: REP-PCR and RFLP-PFGE. Additionally some strains were typed by MLST. Results: Most stains were multi-resistant with percentage of susceptibility to carbapenems of 3%. Only 3 of the studied strains were susceptible to this group of antibiotics. The most active antibiotics were colistin and minocycline with 93,1% and 60,4% of susceptible strains respectively. Hodge test was negative in 29,7% (30/101) of A. baumannii strains. Only 3 of these strains were susceptible to carbapenems. The results obtained in the MBL Etest® MH2 and MHE were discrepant in all isolates of A. baumannii. In 99% of the isolates the gene encoding OXA-51-like was detected and OXA-24-like carbapenemases was identified in 93,1%. PCR analysis revealed absence of OXA-23-like or OXA-58-like carbapenemases. Any MBLs studied in this study were identified. Molecular typing by REP-PCR allowed to differentiate 4 clones. Two were prevalent, clone A and clone B with 47,5% and 40,6% of isolates, respectively. Both clones were isolated from the two Critical Care Units studied indicating a dispersion of these in the hospital. The RFLP-PFGE results also showed two major patterns called pattern I and pattern II. The agreement between both methods was 89,9%. The strain belonging to clone I corresponded to ST92 by MLST, and two A. baumannii isolates belonging to clone II were ST187. Conclusions: Antibiotic resistance in Acinetobacter baumannii isolates in the study was very high. 97% of the isolates were resistant to carbapenems considered the treatment of choice. The most active antibiotics against A. baumannii were colistin, minocycline, amikacin and cotrimoxazole. Phenotypic test for the detection of carbapenemases and metallobetalactamase had limited value in our study. The OXA-24-like was the most frequently identified Oxacillinase acquired in A. baumannii isolates. The presence in all isolates, except one, of oxacillinases that belong to the group OXA-51-like allows us to conclude that these strains belong to the species A. baumannii. Two majority clones of A. baumannii were detected in Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca during the two years of study, distributed both Reanimation Unit and Critical Care Unit. The results obtained by REP-PCR showed 89,9% concordance with the results obtained by PFGE-RFLP. The type sequences obtained in this study were ST92 and ST187. These STs have been described in Spain
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Estudio de la lisina-épsilon-oxidasa LodA sintetizada por Marinomas mediterranea : papel de la flavoproteína LodB en la generación del cofactor quinónico de LodA mediante modificación post-traduccional
(2015-07-22) Chacón Verdú, María Dolores; Sánchez Amat, Antonio; Facultad de Biología
Las L-aminoácido oxidasas (LAOs) son enzimas que oxidan aminoácidos generando el cetoácido correspondiente, amonio y peróxido de hidrógeno. Generalmente, estas enzimas tienen una flavina como cofactor. En la bacteria marina Marinomonas mediterranea se han descrito las dos primeras LAOs que poseen un cofactor quinónico. Este tipo de cofactores se generan mediante modificación post-traduccional de aminoácidos. La primera LAO descrita en M. mediterranea, LodA, es una novedosa L-lisina-épsilon-oxidasa (EC 1.4.3.20). De forma paralela a la realización de este trabajo, se ha descrito GoxA, una glicina oxidasa con características distintas a las glicinas oxidasas descritas previamente en otros organismos. Ambas proteínas son codificadas en operones. En el caso del operón lod, inmediatamente después al gen lodA, se encuentra el gen lodB que codifica la flavoproteína LodB. Datos previos indicaban que en M. mediterranea ambas proteínas son necesarias para obtener LodA activa. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar el papel de LodB en la generación del cofactor quinónico de LodA. Así mismo, se han abordado por primera vez estudios de relación estructura/función de LodA para determinar residuos implicados en el proceso de generación del cofactor quinónico y en la actividad enzimática. El estudio presentado en esta memoria se ha llevado a cabo principalmente mediante expresión recombinante, solas o en combinación, en Escherichia coli de las distintas proteínas de los operones que codifican las LAOs. Las proteínas recombinantes se analizaron mediante espectrometría de masas para detectar la masa molecular de la proteína completa y de los péptidos generados por digestión enzimática, con el fin de identificar los residuos que son modificados post-traduccionalmente durante la generación del cofactor quinónico. Adicionalmente, el papel de los residuos seleccionados por estar conservados en LodA y proteínas similares o por su localización estructural, se ha estudiado mediante mediante mutagénesis dirigida. Finalmente, se ha realizado un análisis comparativo de las proteínas del operón lod y gox. Se ha determinado que LodA recombinante posee como cofactor cisteína triptofilquinona (CTQ) generado por modificación de los residuos Cys516 y Trp581. La expresión de LodA en ausencia de LodB, genera una forma precursora de LodA, a la que se ha denominado PreLodA, que no muestra actividad enzimática y está monohidroxilada en Trp581. Este resultado indica que la síntesis de la proteína activa requiere la flavoproteína LodB que actuaría sobre PreLodA. Por su parte, los experimentos de mutagénesis han permitido determinar que el residuo conservado Asp512 es esencial en la generación de PreLodA. Otros residuos analizados importantes para la actividad están localizados en la entrada del canal del centro activo de LodA o en la proximidad del cofactor. Las deleciones realizadas en el extremo C-terminal sugieren que esa zona podría participar en la generación de la forma activa de LodA. Mediante análisis bioinformático se ha detectado en genomas microbianos que los operones que codifican proteínas similares a LodA generalmente contienen, además del gen similar a lodA, un segundo gen que codifica una hipotética flavoproteína similar a LodB. El estudio del operón gox ha revelado que, al igual que ocurre con LodA, cuando se expresa GoxA en ausencia de GoxB, se detecta una forma intermedia monohidroxilada sin actividad enzimática que se ha denominado PreGoxA, por su similitud con PreLodA. Por último, se ha demostrado que las flavoproteínas que acompañan a LodA y GoxA no son intercambiables, indicando una alta especificidad de la quinooxidasa que modifica. Este trabajo supone un avance en el estudio de la nueva familia de LAOs con cofactor quinónico. En concreto, se ha puesto de manifiesto un mecanismo novedoso de modificación post-traduccional de proteínas, ya que con anterioridad no se había descrito la participación de flavoproteínas en este tipo de procesos. Summary L-amino acid oxidases (LAOs) oxidize amino acids releasing ammonium, hydrogen peroxide and the corresponding alpha keto acid. The marine bacterium Marinomonas mediterranea synthesizes two novel LAOs which contain a quinone cofactor, in contrast to other LAOs that contain a flavin cofactor. Quinone cofactors are generated by post-translational modification of amino acid residues. The first LAO described in M. mediterranea, LodA, is a novel L-lysine-epsilon-oxidase (EC 1.4.3.20). During the realization of this work, it has been described GoxA, a glycine oxidase which is different from the glycine oxidases previously described in other organisms. Both proteins are encoded in operons containing two genes. The operon lod contains immediately downstream to the gene coding for LodA, a second gene coding for the flavoprotein LodB. Previous data have demonstrated that both proteins are required for the generation of the active form of LodA in M. mediterranea. The aim of this work has been to study the role of LodB in the generation of the quinone cofactor of LodA. In addition, studies about structure/function relationship of LodA has been carried out for the first time with the aim of determining the residues involved in the biogenesis of the quinone cofactor and the enzymatic activity of LodA. This work has been carried out by heterologous expression in Escherichia coli of the different genes coding for either LodA or GoxA, alone or in combination with the genes encoding LodB or GoxB. In order to identify which residues are post-translationally modified, the recombinant proteins were analyzed by mass spectrometry to determine the molecular mass of the complete protein and that of the peptides generated by enzymatic digestion. In addition, the role of residues conserved in LodA and LodA-like proteins has been studied by site directed mutagenesis. Finally, a comparative analysis of protein encoded by lod and gox operons has been also performed. It has been determined that recombinant LodA contains a cysteine tryptophyl quinone cofactor (CTQ) which is generated by post-translational modification of residues Cys516 and Trp581. When LodA is expressed in absence of LodB, an inactive monohydroxylated intermediate of LodA, named PreLodA is generated. It is. This result indicates that LodB is required to obtain active LodA and that PreLodA would be its substrate. A critical role in the generation of this precursor of a conserved Asp residue has been revealed by site directed mutagenesis. Other important residues to obtain enzymatic activity are located at the entrance of the active site of LodA or in close vicinity to the quinone cofactor. Moreover, deletions in C-terminal region of LodA suggest a role of that region in the generation of the active form of LodA. Using bioinformatic analysis it has detected that operons encoding LodA-like proteins in microbial genomes usually contain a second gene encoding a hypothetical LodB-like flavoprotein. The analysis of the recombinant synthesis of GoxA in absence of GoxB has revealed, similarly to LodA, a soluble inactive precursor with partial post-translational modifications. This precursor has been named PreGoxA because of its similarity to PreLodA. Finally, it has been demonstrated that the roles of LodB and GoxB are not interchangeable and each flavoprotein acts specifically on its partner protein. This study gets insights in a novel family of LAOs with quinone cofactors. The data presented in this work have revealed a new mechanism of post-translational modification of proteins involving a flavoprotein.
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Estudio longitudinal y multicéntrico sobre bioseguridad ambiental en salas de ambiente controlado
(Universidad de Murcia, 2023-11-20) Sabuco Tébar, Emiliana de los Ángeles; Campayo Rojas, F. Javier; Arense Gonzalo, Julián Jesús; Escuela Internacional de Doctorado
Introducción: No existe consenso internacional sobre la pertinencia de la monitorización periódica de microorganismos en el aire y en las superficies de salas de ambiente controlado excepto durante obras o brotes, ni sobre los umbrales adecuados en los Parámetros Ambientales (PA) y de Diseño (PD) para mantener el aire y superficies libre de microorganismos. La obtención de una adecuada bioseguridad ambiental en los centros sanitarios requiere además de un correcto diseño y construcción el mantenimiento periódico de las instalaciones. Objetivos: Analizar las asociaciones entre los PA y PD, con las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de microorganismos en el aire y superficies. Determinar la utilidad de los Programas de Evaluación Periódica de Bioseguridad Ambiental (PPEBA) para lograr un aire limpio de microorganismos. Metodología: Estudio longitudinal de intervención no controlada con un análisis retrospectivo de los datos. Las muestras fueron recogidas como parte de un PPEBA en salas de ambiente controlado de 12 centros sanitarios, entre 2010 y 2017. Se registraron los PA (UFC/m3 de hongos y bacterias en el aire, UFC/100 cm2 de bacterias en superficies y suelos, temperatura y humedad relativa), y los PD (presión diferencial, renovaciones hora y posición del filtro HEPA en el sistema de climatización). La toma de muestras microbiológicas de aire se realizó en la salida de impulsión del aire (punto 1), y en el centro de las salas (punto 2), por personas adiestradas, externas a los centros, con equipos calibrados, en salas limpiadas previamente, con equipos funcionando y sin personal. Se utilizó una regresión binomial negativa para la asociación de los PA y los PD con las UFC de bacterias en superficies, una regresión logística para la asociación de los PA y los PD con presencia de hongos en el aire y la Chi-cuadrado para la comparación de variables continuas. Resultados: Los modelos multivariantes mostraron que el aumento de temperatura se asoció con un aumento de bacterias en superficies (IRR=1.224; IC95%:1.05-1.43) y en suelos (IRR=1,259; IC95%:1,06–1,50) y el aumento de renovaciones hora con una disminución de bacterias en superficies (IRR=0.961; IC95%:0.94-0.99) y en suelos (IRR=0.975; IC95%:0,95– 1,009). El aumento de presencia de hongos en el aire se asoció con la posición no terminal de los filtros HEPA (OR=6,78; IC95%,3,77–12,20) y (OR= 4,43; IC 95 %, 2,65–7,40) en el punto 1 y 2 respectivamente, la temperatura (OR=1,23; IC95%,1,06–1,41) en el punto 2 y la presión diferencial (OR=0,86; IC95%,0,84–0,90) y (OR=0,88; IC95%,0,86–0,91) en el punto 1 y 2 respectivamente. A lo largo de la realización del PPEBA encontramos una reducción significativa (p < ,05) del porcentaje de hongos en el aire. Aspergillus spp. fue el hongo oportunista más frecuente en salas de ambiente controlado de la zona del levante español. Conclusiones: Nuestros resultados muestran que el aumento de la temperatura y la disminución de las renovaciones hora aumentan el número de UFC de bacterias en superficies. El filtro HEPA en posición terminal en el sistema de climatización reduce la presencia de hongos en el aire. El PPEBA es herramienta útil para mantener y mejorar la calidad del aire en los hospitales. Aspergillus spp. fue el hongo oportunista más frecuente en salas de ambiente controlado en el sureste de España.
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Estudios moleculares sobre la melanogénesis en "Marinomonas mediterranea": caracterización del operón ppoB / Daniel López Serrano; [dirección de Antonio Sánchez Amat y Francisco Solano Muñoz].
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Génetica y Microbiología,, 2005) López Serrano, Daniel
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Evaluación del estado sanitario del jabalí en la Sierra de Aracena (Huelva) y sus factores de riesgo asociados
(2015-12-18) Vázquez Rodríguez, Javier; Salinas Lorente, Jesús; Martínez-Carrasco Pleite, Carlos; Ruiz de Ybáñez Carnero, María del Rocío; Facultad de Veterinaria
El jabalí (Sus scrofa) es la pieza de caza mayor más importante de España, y además, supone una considerable fuente de recursos en algunas zonas rurales. Sin embargo, también causa pérdidas en cultivos y zonas periféricas de algunas ciudades. En el suroeste de España, la población de jabalíes está ampliamente distribuida y suele entrar en contacto con ganado doméstico, concretamente con cerdos ibéricos. Por todo ello, su amplia distribución y su papel en la sanidad animal y salud pública justifican la selección del jabalí como especie objetivo de este proyecto. Los objetivos de este estudio son describir la distribución de patógenos del jabalí (parásitos, bacterias y virus) en la Sierra de Aracena (Huelva), y evaluar la influencia de diferentes factores ambientales en su presencia. Fueron analizados un total de 199 jabalíes e 43 monterías celebradas durante las temporadas de caza 2010-2011 y 2011-2012. Durante la necropsia se recogieron muestras de órganos, sangre, heces y músculo. Los parásitos hallados fueron estudiados mediante identificación morfométrica, las muestras de músculo mediante digestión ácido-artificial y por último, las heces se procesaron mediante una técnica de sedimentación. Se utilizaron técnicas ELISA para analizar la presencia de virus y bacterias. Finalmente, todos los datos se analizaron estadísticamente (R software) y mediante software de SIG (QGIS) para estudiar la influencia de los factores de riesgo y las coinfecciones. De los 199 jabalíes analizados, 196 estaban parasitados por un total de 10 especies diferentes: Macracanthorynchus hirudineaceus (prevalencia-p-67.34%), Metastrongylus elongatus (p–71,36%), Metastrongylus pudendotectus (p-59,80%), Ascarops strongylina (p–37,19%), Physocephalus sexalatus (p–5,03%), Ascaris suum (p-18,59%), Globocephalus urosubulatus (p-64,32), Trichuris suis (p-31,16%), Oesohpagostomum dentatum (p-14,57%) y Cysticercus tenuicollis (p-12,56%). Sin embargo, es necesario remarcar la ausencia de trematodos y de Trichinella spp. Por otro lado, todos los virus y bacterias seleccionados fueron detectados: Mycobacterium bovis (seroprevalencia-sp-46,73%), Chlamydiaceae (sp-45,23%), Brucella suis (sp-27,17%), virus de la enfermedad de Aujeszky (sp-27,72%), PRRS (sp-6,52%) y PCV2 (sp-51,09%). Sólo M. hirudinaceus mostró una prevalencia significativamente mayor en las hembras, en las cuales también se detectaron títulos de anticuerpos frente a PRRS más elevados. En animales mayores se observaron prevalencias más altas de G. Urosobulatus, O. dentatum, C. tenuicollis, B. suis y PCV2, mientras que T. suis fue más prevalerte en animales jóvenes. El análisis de SIG determinó que la densidad de granjas suponía un factor de riesgo para M. hirudinaceus y G. Urosubulatus¸ sin embargo se obtuvo el resultado contrario para A. suum, cuya prevalencia incrementaba en las zonas con baja densidad de explotaciones. En este aspecto, los resultados de estos análisis revelan que los factores de riesgo más importantes para macro y micro-parásitos son la altitud media y la distancia media a explotaciones agro-ganaderas. Sin embargo, otras variables como la presencia de pinar o la distancia media a bosque de ribera también fueron significativos para algunos. Se ha observado una relación significativa en la coinfección entre algunos patógenos, siendo los más relevantes se han obtenido para la coinfección entre las dos especies de Metrastrongylus y la coinfección Chlamydiaceae - M. bovis. La población de jabalí en la Sierra de Aracena muestra un elevado contacto con determinados agentes infecciosos comunes también a cerdos domésticos. Su presencia en esta zona debería considerarse un factor de riesgo que afecta al mantenimiento y dispersión de estos patógenos entre los animales domésticos. Finalmente, nuestros resultados sugieren que esta interacción entre suidos domésticos y silvestres podría suponer un importante factor de riesgo para la sanidad animal y la salud pública. Por ello, sería recomendable continuar con estudios más profundos que ayuden a comprender mejor la ecopatología de las enfermedades contagiosas. Wild boar (Sus scrofa) is the most important game species in Spain; moreover it is an important economic resource for some rural areas. Nevertheless, it also causes substantial economic losses in cultivated areas and peripheral zones of some cities. In the southwest of Spain, the population of wild boars is widely distributed and come into contact with extensively farmed livestock, particulary Iberian pig. In summary, its wide distribution in this area and its important role in public and animal health justify the selection of the wild boar as the target species for this project. The targets of this study were to describe the distribution of wild boar pathogens (parasites, bacteria and viruses) in Sierra de Aracena (Huelva, SW Spain), and evaluate the significance of different risk factors in their presence. A total 199 wild boar from 43 hunts hold during 2010-2011 and 2011-2012 hunting seasons were analysed. During necropsy, viscera, blood, faeces and muscle samples were collected. Isolated parasites were morphometrically identified, muscle samples was analysed using an acid-artificial digestion, and faeces were processed with a sedimentation technique. Moreover, serological techniques (ELISA) were used to diagnose viral and bacterial infections. Finally, all data were analysed through statistical (R software) and SIG methods (QGIS) to study the role of risk factors and coinfections. Of the 199 wild boars analysed, 196 harboured parasites. A total of 10 different parasite species were identified: Macracanthorynchus hirudineaceus (prevalence-p-67.34%), Metastrongylus elongatus (p–71,36%), Metastrongylus pudendotectus (p-59,80%), Ascarops strongylina (p–37,19%), Physocephalus sexalatus (p–5,03%), Ascaris suum (p-18,59%), Globocephalus urosubulatus (p-64,32), Trichuris suis (p-31,16%), Oesohpagostomum dentatum (p-14,57%) and Cysticercus tenuicollis (p-12,56%). However, the absence of trematodes and Trichinella spp should be emphasized. On the other hand, all the studied bacterial and viral agents were detected in serum samples: Mycobacterium bovis (seroprevalence-sp-46,73%), Chlamydiaceae (sp-45,23%), Brucella suis (sp-27,17%), Aujeszky disease virus (sp-27,72%), PRRS (sp-6,52%) and PCV2 (sp-51,09%). Only M. hirudinaceus showed a significant positive association with host sex (female), and antibodies titles for PRRS were also higher in sows. Additionally, a higher prevalence of G. Urosobulatus, O. dentatum, C. tenuicollis, B. suis and PCV2 was significally associated to older animals, while only T. suis was more prevalent woung ones. GIS analyses showed that farm density was a risk factor for M. hirudinaceus and G. Urosubulatus infections; however, it was not associated to A. suum, wich prevalence was higher in lower farm density areas. In this sense, our results showed that the most important environmental risk factors for both macro and micro-parasite presence were the mean altitude and the mean distance to farm areas. Nevertheless, other variables like the presence of pinewood or the mean distance to riparian forest were significant for some of the studied pathogens. A statistically significant association between some coinfecting pathogen pairs was observed. Thus, the most relevant results were obtained for two Metastrongylus species, and the coinfection between Chlamydiaceae - M. bovis coinfections. The wild boar population of the Sierra de Aracena shows a high level of contact with some infectious agents that are common in domestic pigs. Their presence in this area therefore should be considered as a risk factor that can affect the maintenance and spread of these pathogens among domesticated animals. In summary, our results suggest that this interaction between domestic and wild suids could be in this way an important risk factor for animal and public health. For this reason, deeper environmental studies should be desirable for a better understanding of contagious diseases ecopathology.
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Expresión de genes carotenogénicos de la bacteria "Myxococcus xanthus" en "Escherichia coli" / Antonio Angel Iniesta Martínez ; dirección Francisco J. Murillo Araujo.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Biología, Departamento de Genética y Microbiología,, 2003) Iniesta Martínez, Antonio Ángel