Browsing by Subject "Almendro"

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    Bases fisiológicas del cultivo del almendro (Amygdalus communis L.) en riesgo localizado / María del Carmen Ruiz Sánchez ; director Arturo Torrecillas Melendreras.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Ciencias Biológicas,, 1988) Ruiz Sánchez, María del Carmen
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    Factores moleculares implicados en el sistema de incompatibilidad floral en almendro [Prunus dulcis (Miller) D.A. Webb]
    (Universidad de Murcia, 2018-02-13) Gómez González, Eva Mª; Ortega Pastor, Encarnación; Dicenta López-Higuera, Federico; Facultad de Biología
    A lo largo de la evolución, las plantas con flores han desarrollado un mecanismo genético de reconocimiento y rechazo específico del propio polen. Aunque desde el punto de vista evolutivo la autoincompatibilidad supone una ventaja, es un inconveniente en el cultivo de frutales, ya que puede limitar la producción. El almendro presenta autoincompatibilidad de tipo gametofítico, controlada por el locus S, que contiene al menos dos genes, expresados en el pistilo y en elpolen. El gen S del pistilo codifica para una glicoproteína con función ribonucleasa (ARNasa-S) que degrada específicamente el ARN del tubo polínico incompatible inhibiendo su crecimiento. El gen S del polen (SFB) codifica para una proteína con un dominio caja-F, que interviene en la degradación de proteínas mediante la vía del proteosoma 26S. Aunque la especificidad del rechazo del polen está controlada por el locus S, diversos estudios indican que existen genes modificadores no ligados a este locus que son indispensables en la vía bioquímica del sistema de incompatibilidad gametofítico. A pesar de que el almendro es una especie de origen autoincompatible, en la región italiana de Apulia se han identificado algunas variedades autocompatibles. En estas variedades el fenotipo autocompatible se asocia a la presencia de la ARNasa-Sf, sin embargo recientemente se han caracterizado almendros con el haplotipo Sf pero fenotipo autoincompatible lo que parece indicar la presencia de factores modificadores. El objetivo de esta Tesis Doctoral es avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares de la incompatibilidad floral en almendro mediante la caracterización fenotípica, molecular, transcriptómica y proteómica de variedades y selecciones de almendro con haplotipo Sf y distinto fenotipo. Para ello se han empleado técnicas de secuenciación de ADN, que junto con técnicas que tienen como base la PCR han permitido conocer la secuencia de la región promotora de la ARNasa-Sf, de la ARNasa-Sf y de la región entre los genes ARNasa-Sf y SFBf. Por otro lado, también se han aplicado técnicas de retrotranscripción, de detección de actividad ribonucleasa y de microscopía de fluorescencia que nos han permitido observar el comportamiento de los elementos conocidos del sistema de incompatibilidad en almendro. Estos ensayos moleculares se han combinado a su vez con otros realizados en campo para caracterizar el fenotipo de las distintas variedades y selecciones utilizadas. Con el fin de caracterizar el perfil trancriptómico del sistema de incompatibilidad se han realizado análisis de RNAseq sobre pistilos polinizados y sin polinizar, confirmándose posteriormente los resultados mediante qPCR. La caracterización proteómica del sistema de incompatibilidad se realizó mediante iTRAQ de anteras, pistilos no polinizados y polinizados. Los resultados obtenidos de la caracterización fenotípica han mostrado una relación de incompatibilidad unilateral para el haplotipo Sf debido a una disfunción en el pistilo. Sin embargo, los ensayos de actividad ribonucleasa confirman que sólo están activas las ARNasas-Sf de las variedades incompatibles, aunque ambas ARNasas-Sf se transcriben. La secuenciación de ADN ha confirmado que las secuencias de las ARNasas-Sf y de sus regiones promotoras son iguales. Sólo se ha observado la insercción de timinas en la región intergénica, que podrían ser responsables de la transcripción diferencial de un ORF descrito por primera vez en esta zona. Los análisis de transcriptómica y proteómica han ofrecido una visión general de todos elementos involucrados en las reacciones de incompatibilidad y han mostrado varios candidatos como posibles factores modificadores del sisitema de incompatibilidad.  Over the evolution, the plants with flowers have developed a genetic mechanism of specific recognition and rejection of self pollen. Although from the evolutionary point of view self-incompatibility is an advantage, for fruit trees it may be a disadvantage for, since it limits their production. Almond presents gametophytic self-incompatibility controlled by the S locus, which at least contains two genes. The pistil S gene encodes a glycoprotein with ribonuclease function (S-RNase), which specifically degrades the RNA of the incompatible pollen and inhibits its growth. The pollen S gene (SFB) codes for an F-box protein involved in the degradation of proteins by the 26S proteosome. Although the specificity of pollen rejection is controlled by the S locus, several studies indicate that modifier genes not linked to this locus are involved in the biochemical pathway of the gametophytic incompatibility system. Despite the almond is a self-incompatible species, in the Italian region of Apulia some self-compatible cultivars have been identified. In these cultivars the self-compatible phenotype is associated with the presence of the Sf RNase, however, almonds with the Sf haplotype and a self-incompatible phenotype have recently been characterized, what seems to indicate the presence of modifier factors. Therefore, the objective of this PhD Thesis is to advance in the knowledge of the molecular mechanisms of floral incompatibility in almond through the phenotypic, molecular, transcriptomic and proteomic characterization of almond cultivars and selections with the Sf haplotype but a different phenotype. For this, DNA sequencing techniques have been used, which together with PCR-based techniques allowed to know the sequence of the promoter region of the Sf-RNase, the Sf-RNase and the region between Sf-RNase and SFBf genes. On the other hand, retrotranscription, detection of ribonucleases activity and fluorescence microscopy techniques have also been applied, which allowed to observe the behavior of the known elements of the self-incompatibility system in almond. These molecular assays have been combined with field assays to characterize the phenotype of the different almond selections and cultivars used. In order to characterize the transcriptomic profile of the incompatibility system, RNAseq analyzes were performed on pollinated and non-pollinated pistils. The results are then confirmed by qPCRs. The proteomic characterization of the incompatibility system was performed by iTRAQ of anthers, non-pollinated and pollinated pistils. The results obtained from the phenotypic characterization have shown a unilateral incompatibility relation for the Sf haplotype due to a dysfunction in the pistil. However, ribonuclease activity assays confirmed that only the Sf-RNase of the incompatible selections were active, although both Sf-RNases were transcribed. DNA sequencing confirmed that the sequences of the Sf-RNase and those of their promoters were identical. Only thymines insertion of three into the intergenic region was observed, which could be the responsible for the differential transcription of an ORF, firstly described in this region. Transcriptomic and proteomic analyzes have provided an overview of all elements involved in incompatibility reactions and have shown some candidates as putative incompatiblity system modifier factors.
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    Mejora genética del almendro (Prunus dulcis Miller) por cruzamientos intervarietales : herencia de caracteres y selección / Federico Dicenta López-Higuera.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura, Departamento de Biología Vegetal,, 1991) Dicenta Lopez-Higuera, Federico
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    Metabolismo de los compuestos cianogénicos y desarrollo de marcadores moleculares para el amargor en el almendro [Prunus dulcis (Miller) D. A. Webb]
    (Universidad de Murcia, 2019-05-31) Cueto Chocano, Jorge Luis del; Sánchez Pérez, Raquel; Dicenta López-Higuera, Federico; Facultad de Biología
    El almendro (Prunus dulcis Miller) es una especie del género Prunus originario de Asia Central. Es uno de los frutales de hueso más importantes tanto en producción como en superficie cultivada, siendo Estados Unidos el principal productor mundial con diferencia. España ocupa el tercer puesto mundial, siendo Murcia una de las regiones más importantes. Aunque la mayoría de las variedades cultivadas actualmente son dulces, los almendros silvestres de los que procede la especie cultivada eran amargos. Los glucósidos cianogénicos son los responsables del amargor de la almendra. Estos metabolitos secundarios son compuestos de defensa de muchas plantas entre las que se encuentran las rosáceas. En el almendro podemos encontrar dos glucósidos cianogénicos: la prunasina y la amigdalina. El amargor es un carácter monogénico, cuyo gen responsable (Sk, sweet kernel) se encuentra ubicado en el grupo de ligamiento 5 del genoma del almendro, aunque su localización precisa y función aún no ha sido determinada. La mayoría de variedades comerciales de almendro son heterocigóticas para el sabor amargo, por lo que cuando en los programas de mejora se cruzan, el 25% de los descendientes dará frutos amargos. Actualmente, el mejorador debe de esperar 3 ó 4 años a que los árboles entren en producción para determinar el sabor de sus almendras. Por ello sería de gran interés disponer de marcadores moleculares para este carácter, que permitieran la SAM (Selección Asistida por Marcadores), durante el primer año de vida de las plantas mediante una sencilla PCR, ahorrando tiempo y dinero y mejorando la eficiencia de los programas de mejora. Los objetivos de la presente tesis son el estudio de la evolución de los glucósidos cianogénicos durante el desarrollo de la flor, la saturación con marcadores moleculares la región del grupo de ligamiento 5 donde se encuentra el locus Sk y el análisis del trascriptoma de almendros dulces y amargos mediante el estudio de la expresión diferencial de genes candidatos y por último la caracterización de enzimas de la ruta del amargor y determinar las diferencias entre cultivares dulces y amargos. El primer capítulo analiza la relación entre la época de floración y la presencia de compuestos cianogénicos en la flor. Para ello hemos estudiado la evolución de los glucósidos cianogénicos en flores desde el letargo invernal de las yemas hasta la apertura de la flor, en variedades dulces y amargas de distinta época de floración, mediante extracciones de metanol y el posterior análisis por LC-MS (Liquid chromatography–mass spectrometry). La prunasina y la amigdalina fueron detectadas por primera vez en las yemas florales de las cinco variedades de almendro estudiadas. Estos glucósidos cianogénicos también fueron detectados en distintas partes de la flor: sépalos, pétalos, pistilos y polen, siendo el polen el tejido con mayor concentración de prunasina. Por primera vez fueron observados en las flores algunos compuestos (amidas, anitrilos, ácidos, pentosas) derivados de la prunasina. Todos parecen estar implicados en una ruta alternativa sin liberación de cianuro (el cual dañaría a la planta) y con la producción final de nitrógeno, reutilizable por la propia planta. El objetivo del segundo capítulo es desarrollar un marcador molecular ligado al sabor amargo de la semilla saturando el Sk locus, para realizar una selección asistida por marcadores que pueda ser utilizada en los programas de mejora. Para ello se desarrollaron tres estrategias relacionadas: 1) saturación del Sk locus con nuevos marcadores tipo SSRs y CAPs basados en SNPs. 2) Resecuenciación de dos genotipos de almendro, uno dulce Lauranne y otro amargo S3067. 3) Experimento RNA-seq del tegumento de los dos genotipos anteriormente mencionados en dos puntos diferentes del desarrollo del fruto. Para ello, marcadores CAPs y SSRs fueron utilizados para genotipar la descendencia R1000 x Desmayo. Estos marcadores cubrieron una región de cerca de 800 kb. Gracias a la colinearidad entre el melocotón y el almendro, se detectaron el GL5 del melocotón once genes candidatos en una región de 95.76 kb. Por lo tanto y como principal conclusión de la saturación del GL5, hemos conseguido saturar la zona del Sk locus desde los 3,6 Mb hasta los 61 kb. Entonces queríamos saber si estos genes candidatos también estaban presentes en almendro. Para ello la segunda y tercera estrategia consistió en la evaluación de un genoma dulce y otro amargo y los transcriptomas del tegumento de ambos. En primer lugar se llevó a cabo una resecuenciación del genoma integrando los datos de los marcadores con el nuevo transcriptoma. Tomamos el genotipo amargo como el de referencia. Para profundizar en estos genes abordamos el estudio transcriptómico mediante la técnica del RNA-seq, que reveló la existencia de dos grupos de genes candidatos para el Sk locus. El primero estaba compuesto por tres miembros de la familia MYC de factores de transcripción. El segundo estuvo conformado por enzimas que podrían tener una función en el metabolismo de la amigdalina: una hidrolasa, un citocromo P450 y una glioxal oxidasa. Se detectaron diferencias de expresión de estos genes entre dulces y amargos y además de nuevos SNPs dentro de estos genes candidatos, estos resultados están siendo analizados. El tercer capítulo está dedicado al estudio de las enzimas implicadas en la ruta del amargor para determinar su implicación en el sabor dulce o amargo del almendro. Por todo ello, se estudiaron dos trascriptomas del tegumento en un genotipo dulce y otro amargo, ya que en este tejido maternal fue detectada una acumulación de prunasina en el genotipo amargo pero no en los dulces (Sánchez-Pérez et al., 2008). Los resultados mostraron la expresión diferencial de diferentes genes candidatos para CYP79, CYP71, algunas glucosiltransferasas y una prunasina hidrolasa. Respecto a la ruta de degradación nos centramos en las prunasinas hidrolasas, obteniendo las secuencias de putativas prunasinas hidrolasas de dos cultivares dulces y uno amargo en tres tejidos diferentes (tegumento, nucela y cotiledón) mediante clonación en Escherichia coli. Se observaron diferencias de un solo nucleótido (SNPs) entre algunas secuencias, pero no relacionadas con el sabor dulce o amargo. Estos genes se expresaron en Agrobacterium tumefaciens y, aunque se observó actividad prunasina hidrolasa y β-glucosidasa, tampoco se observaron diferencias entre dulces y amargos. Como principal conclusión cabe destacar que por primera vez se han caracterizado prunasinas hidrolasas en almendros dulces y amargos, pero no se han encontrado diferencias entre los mismos. Por otro lado, respecto a las enzimas anabólicas relacionadas con el amargor del almendro, cuatro putativas glucosiltransferasas fueron caracterizadas en el cotiledón de cultivares amargos, pero sólo uno de ellos fue capaz de producir prunasina y el otro sólo amigdalina, los otros dos produjeron prunasina y amigdalina. Como conclusión principal, por primera vez, se han caracterizado varios clones de la enzima anabólica glucosiltransferasa 2, que transforma la prunasina en amigdalina.
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