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    Análisis de la expresión génica de la resistencia a plum pox virus en albaricoquero (prunus armeniaca L.)
    (2016-11-08) Olivares Belchí, Pedro Manuel; Martínez Gómez, Pedro; Rubio Angulo, Manuel; Escuela Internacional de Doctorado
    El albaricoquero (Prunus armeniaca L.) es una especie diploide con un genoma de 2n=2x=16 cromosomas. Pertenece a la familia Rosaceae siendo una de las especies del género Prunus más importantes desde el punto de vista agrícola ya que representa el tercer frutal de hueso en importancia económica a nivel mundial después de melocotonero y ciruelo. Esta tesis doctoral describe la respuesta diferencial a nivel genómico, transcriptómico y hormonal frente a PPV en dos variedades de albaricoquero, ‘Rojo Pasión’ (resistente) y ‘Z506-7’ (susceptible). A partir de los resultados del análisis de variaciones de secuencia de microsatélites (Simple sequence repeat, SSRs) y variaciones de nucleótidos (SNPs) en el genoma de albaricoquero, basándonos en la secuenciación de alto rendimiento del RNA (RNA-Seq) y combinando la espectrometría de masas para el genotipado de SNPs, podemos decir que se trata de un enfoque que proporciona una alta flexibilidad, reproducibilidad y precisión en los ensayos, suponiendo una herramienta sólida para detectar diversidad de nucleótidos en regiones codificantes del genoma del Prunus. Los resultados obtenidos muestran sin lugar a dudas la gran influencia del LG 1 en la resistencia al PPV en albaricoquero. Estos datos nos ayudan a enfocar estudios dirigidos hacia zonas más concretas del genoma en la búsqueda de QTLs que controlen un mayor porcentaje de la variación del carácter, saturando otras zonas de interés fuera del PPVres y diseñando marcadores específicos que nos aporten información de la expresión fenotípica de determinados caracteres en cada uno de los descendientes de una población. Por otro lado, desde el punto de vista metodológico, el RNA-Seq se ha mostrado como una herramienta muy poderosa en el análisis de la interacción PPV/albaricoquero aunque no parece ser la herramienta definitiva para resolver los problemas de expresión base ni los determinantes genéticos. El RNA-Seq se presenta como una herramienta complementaria a los estudios genómicos con menor cantidad de datos. Las diferencias transcriptómicas a nivel de expresión de genes confirmaron que la susceptibilidad a PPV en albaricoquero es un proceso complejo basado en la batalla continua entre el virus (PPV) y la planta (Prunus armeniaca) a nivel de genes de resistencia del patógenos y a nivel de silenciamiento génico similar a la respuesta observada en melocotonero en trabajos anteriores. La resistencia a PPV en albaricoquero es también un proceso complejo que también se basa en una batalla continua entre el virus (PPV) y la planta (Prunus) donde los genes MATH (control a larga distancia de los movimientos del virus) están involucrados junto a otros genes. La respuesta de resistencia que se observa en el albaricoquero es diferente de la respuesta que se observa en ciruelos hipersensibles resistentes. Por tanto parece que si bien la susceptibilidad es un proceso similar entre especies la resistencia depende de cada especie. Finalmente, la respuesta hormonal en diferentes variedades de albaricoquero resistentes y susceptibles a PPV y en melocotonero GF305 control e inoculadas pusieron de manifiesto la importante implicación del SA y la citoquinina trans-Zeatina en la infección del virus en Prunus. Es de destacar que tras la inoculación de la variedad de albaricoque ‘Rojo Pasión’ con PPV se produce un descenso de los niveles de ABA que puede ser el responsable de favorecer la señalización de la ruta del SA. El descenso del ABA favorece favorece las condiciones oxidativas dentro de la célula lo que a su vez induce la forma monomérica del NPR1, que es capaz de ser traslocada al núcleo e indicar la señalización de las respuestas mediadas por el SA.ABSTRACT: Apricot (Prunus armeniaca L.) is a diploid specie with a genome of 2n = 2x = 16 chromosomes included inside the Rosaceae family and is one of the most important species of Prunus from an agricultural point of view. Apricot production around the globe places it as the third stone fruit in terms of worldwide economic importance after peach and plum. The objective of this thesis has been to carry out a study about Plum pox virus (PPV) resistance analysis at genomic, transcripromitc and phytohomonal level in the apricot genotypes ‘Rojo Pasión’ (resistant) and ‘Z506-7’ (susceptible). Genomic approaches are focused on improving the development and analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) via an efficient and flexible method combining high throughput sequencing (RNA-Seq) and mass spectrometry. We designed 136 SNPs from the RNA-Seq genotypes ‘Rojo Pasión’ and ‘Z506-7’ (‘Orange Red’ × ‘Currot’). We can therefore consider RNA sequencing as an efficient method for generating high quality molecular markers in apricot. These results provide accurate values for nucleotide diversity in coding sequences in apricot. Thus, the combination a highly efficient RNA-Seq approach and the SNPlex™ high-throughput genotyping technology provide a powerful and flexible tool for apricot genetic analysis. SSR and SNP analysis show without any doubt the great influence of LG 1 on PPV resistance in apricot in the PPVres region. This information allows us to focus in on more specific regions of the genome in the search for major QTLs that control a greater percentage of the variation of the trait. RNA-Seq has proven to be a very powerful tool in the analysis of the Plum pox virus (PPV, sharka disease)/Prunus interaction. This technique is an important complementary tool to other means of studying genomics. In this work an analysis of gene expression of resistance/susceptibility to PPV in apricot is performed. RNA-Seq has been applied to analyse the gene expression changes induced by PPV infection in leaves from two full-sib apricot genotypes, ‘Rojo Pasión’ and ‘Z506-7’, resistant and susceptible to PPV, respectively. Transcriptomic analyses revealed the existence of more than 2,000 genes related to the pathogen response and resistance to PPV in apricot. These results showed that the response to infection by the virus in the susceptible genotype is associated with an induction of genes involved in pathogen resistance such as the allene oxide synthase, S-adenosylmethionine synthetase 2 and the major MLP-like protein 423. Over-expression of the Dicer protein 2a may indicate the suppression of a gene silencing mechanism of the plant by PPV HCPro and P1 PPV proteins. On the other hand, there were 164 genes involved in resistance mechanisms that have been identified in apricot, 49 of which are located in the PPVres region (scaffold 1 positions from 8,050,804 to 8,244,925), which is responsible for PPV resistance in apricot. Among these genes in apricot there are several MATH domain-containing genes, although other genes inside (Pleiotropic drug resistance 9 gene) or outside (CAP, Cysteine-rich secretory proteins, Antigen 5 and Pathogenesis-related 1 protein; and LEA, Late embryogenesis abundant protein) PPVres region could also be involved in the resistance. Finally, the hormonal response in different apricot and peach resistant and susceptible genotypes to PPV GF305 control and inoculated highlighted the important implication of SA and cytokinin trans-Zeatin virus infection in Prunus. It is noteworthy that after inoculation of apricot variety 'Red Passion' with PPV decreased ABA levels may be responsible for promoting signalling pathway SA occurs. The decrease of ABA promotes oxidative conditions favours within the cell the monomeric form of NPR1, which is capable to induce changes signalling SA mediated responses.
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    Bases genéticas y moleculares de la calidad del fruto en albaricoquero (prunus armeniaca L.)
    (2014-11-03) Salazar Martínez, Juan Alfonso; Martínez Gómez, Pedro; Ruiz González, David; Facultad de Biología
    Los objetivos de esta tesis doctoral fueron la caracterización fenotípica y estudio del modo de herencia de los principales caracteres relacionados con la fenología y calidad del fruto en la especie albaricoquero, así como la caracterización genotípica mediante marcadores de ADN (SSRs y SNPs), construcción de mapas de ligamiento genético, identificación de QTLs asociados a caracteres de interés y localización de posibles genes candidatos. El material vegetal utilizado consistió en tres poblaciones segregantes de albaricoquero: ‘Z701-1’× ‘Palsteyn’ (‘Z×P’), ‘Bergeron’ × ‘Currot’ (‘B×C’) y ‘Goldrich’ × ‘Currot’ (‘G×C’) con 160, 187 y 200 descendientes respectivamente. La caracterización fenotípica nos ha permitido la evaluación de fecha de floración, fecha de maduración, ciclo de desarrollo del fruto, peso del fruto, peso del hueso, calibre, color del fruto, firmeza, contenido en sólidos solubles y acidez. Los resultados muestran una gran variabilidad y segregación en cada población, así como evidentes diferencias interanuales. Los histogramas de frecuencias revelan en general una distribución normal de los descendientes en la mayoría de los caracteres evaluados, lo que confirma el carácter poligénico y herencia cuantitativa para todos ellos. Sin embargo, fecha de floración y maduración llegan a mostrar distribuciones bi-modales o tri-modales debido a las diferencias climáticas inter-anuales. Se observa la presencia de valores transgresivos en los descendientes debido a la influencia del fondo genético de los parentales, así como de herencia intermedia. La mayoría de los caracteres evaluados muestran además una buena correlación entre años. En la población ‘Z701-1’ × ‘Palsteyn’ se construyeron los mapas de ligamiento genético a partir de 160 descendientes, utilizando un total de 42 SSRs. Los mapas de ‘Z701-1’ y ‘Palsteyn’ cubren una extensión de 336,2 cM y 363,1 cM respectivamente. En el análisis de QTLs se identificaron QTLs significativos para los principales caracteres fenológicos y de la calidad del fruto en albaricoque. Los resultados mostraron la gran influencia del grupo de ligamiento (LG) 4 para fecha de maduración y ciclo de desarrollo del fruto. La presente tesis abordó un estudio de mejora en la eficiencia de la metodología para el desarrollo y análisis de SNPs, combinando la secuenciación masiva de ARN (RNA-Seq) y la técnica SNPlex mediante la plataforma SEQUENOM. Se diseñaron 136 SNPs procedentes del RNA-Seq de los genotipos ‘Rojo Pasión’ y ‘Z506-7’ siendo aplicados un total de 101 SNP para el genotipado de diferentes variedades de albaricoquero. A partir de los resultados del análisis de variaciones de nucleótidos, podemos decir que este enfoque proporciona alta flexibilidad, reproducibilidad y precisión en los ensayos, suponiendo una herramienta sólida para detectar diversidad de nucleótidos en regiones codificantes y no codificantes del genoma de Prunus. El genotipado con SNPs permitió asimismo establecer las relaciones fenéticas y distancias genéticas entre diferentes cultivares de albaricoquero con diversos orígenes. Finalmente se elaboraron los mapas de ligamiento genético de las poblaciones ‘B×C’ y ‘G×C’, utilizando un total de 130 y 166 descendientes respectivamente. Los mapas fueron construidos combinando marcadores tipo SSR y SNP, siendo mapeados 87 marcadores en la población ‘B×C’ y 89 en ‘G×C’, y cubriendo una extensión del genoma de 394,9 y 414,3 cM en los mapas de ‘Bergeron’ y ‘Currot’ respectivamente, mientras que en ‘Goldrich’ y ‘Currot’ fue de 353,5 y 422,3 cM respectivamente. El análisis de QTLs identificó diferentes QTLs ligados a los principales caracteres fenológicos y de la calidad del fruto en albaricoque. Los QTLs de mayor relevancia por su significación se dan en el LG 4, considerando este grupo de vital importancia para el control de fecha de maduración, ciclo de desarrollo del fruto y contenido en sólidos solubles. En el caso del color de piel y pulpa fueron identificados importantes QTLs al final del LG 3 de ‘Goldrich’. Summary The objective of this thesis has been to carry out a phenotypic characterization of apricot by studying the inheritance of the major traits related to phenology and fruit quality. In addition, a genotypic characterization using DNA markers (SSRs and SNPs) has been performed to develop genetic linkage maps for QTL detection and identification of potential candidate genes and markers. The plant material used comes from three segregating populations of apricot: ‘Z701-1’× ‘Palsteyn’ (‘Z×P’), ‘Bergeron’ × ‘Currot’ (‘B×C’) and ‘Goldrich’ × ‘Currot’ (‘G×C’) with 160, 187 and 200 seedlings respectively. The phenotipyc characterization has allowed us to evaluate blooming date, ripening time, fruit development period, fruit weight, stone weight, fruit diameter, fruit colour, firmness, soluble solids and acidity. Results show a great variability and segregation in each population as well as the obvious differences between years. The histograms frequencies usually reveal in the three populations a normal distribution in the majority of the traits which confirms the polygenic character and quantitative inheritance for all of them. Nevertheless, blooming and ripening date showed bi-modal or tri-modal distribution due to inter-annual climatic conditions. We should also note the presence of many transgressive trait values, probably due to the influence of the genetic background of the parents as well as intermediate inheritance of seedlings. We can affirm that there was good correlation between years for all traits evaluated. In the population ‘Z701-1’ × ‘Palsteyn’ was constructed a genetic linkage maps assaying 160 seedlings with 42 SSR markers. ‘Z701-1’ and ‘Palsteyn’ maps covered a genome extension of 336.2 and 363.1 cM respectively. We subsequently carried out QTL analysis to identify significant QTLs for the most important phenological and fruit quality traits in apricot. Results show without any doubt the great influence of LG 4 on fruit quality traits, especially in the case of ripening time and fruit development period. The study has also been focused on improving the development and analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) via an efficient and flexible method combining high throughput sequencing (RNA-Seq) and SNPlex technology using the SEQUENOM platform. 136 SNP markers were designed from the RNA-Seq genotypes 'Rojo Pasion' and 'Z506-7' being analyzed a total of 101 SNPs for genotyping of different apricot varieties. From the results of variations in nucleotide sequences (SNPs) we can say that this is an approach that provides high flexibility, reproducibility and accuracy and that it can be considered a robust tool for detecting nucleotide diversity in coding and non-coding regions of the Prunus genome. Moreover, logical phenetic relationships and genetic distance were shown among apricot cultivars tested according to the origin of each one. Finally, genetic linkage maps of populations ‘B×C’ and ‘G×C’ were realized using a total of 130 and 166 seedlings, respectively. Maps were constructed combining SSR and SNP markers, making it possible to map a total of 87 markers in the ‘B×C’ population and 89 markers in ‘G×C’. ‘Bergeron’ and ‘Currot’ covered a genome extension of 394.9 and 414.3 cM, while ‘Goldrich’ and ‘Currot’ covered 353.5 and 422.3 cM, respectively. In the phenotype and genotype integrated analysis, different QTLs were detected for the most important phenological and fruit quality traits. The most significant QTLs are localized in LG 4, showing that this group is of vital importance to ripening time, fruit development period and soluble solids content in both apricot populations. Regarding skin and flesh colour, the most important QTLs were detected at the end of LG 3 of ‘Goldrich’.
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